نظهر التصوير العضلي متساوي القياس أو التنسومتري باعتباره البروتوكول القياسي الذهبي لقياس تفاعل المقاومة الصغيرة أو الأوعية الدموية ذات القناة الكبيرة في حالة فسيولوجية جيدة التحكم. القياسات قابلة للتكرار وموثوقة للغاية. هذه التقنية قيمة للغاية في السماح للباحثين بدراسة طبقات مختلفة من الأوعية الدموية بشكل منفصل أو التحقيق في التفاعل بين طبقات مختلفة من جدار الأوعية الدموية في وقت واحد.
سيوضح الإجراء روبرت فولك ، أخصائي مختبر الأبحاث من مختبري. ابدأ بتشغيل الحمام المائي وضبطه على 37 درجة مئوية. ضع كأسين زجاجيتين ملصقتين بشكل مناسب في حمام مائي، إحداهما تحتوي على 600 ملليلتر من محلول HEPES-PSS، والأخرى تحتوي على 150 ملليلترا من المحلول العالي البوتاسيوم.
قم بتهوية كأس زجاجية تحتوي على 300 ملليلتر من محلول HEPES-PSS بغاز الكربوجين لمدة 10 دقائق على الأقل. أضف 30 ملليلترا من محلول HEPES-PSS الهوائي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر ، وقم بتسميته بشكل مناسب ، وضعه على الثلج. احتفظ بمحلول HEPES-PSS الهوائي المتبقي على الثلج لاستخدامه أثناء عملية تسلخ الأبهر.
قم بتشغيل وحدة التصوير العضلي المكونة من أربع غرف عند 5 ملليلتر من محلول HEPES-PSS لكل حجرة تصوير عضلي واضبط الحرارة على 37 درجة مئوية. اترك المحلول في كل حجرة يتم تهويته لمدة 30 دقيقة وتحقق للتأكد من أن الغرف قد وصلت إلى 37 درجة مئوية المطلوبة. قم بتشغيل أجهزة الحصول على بيانات myograph والكمبيوتر.
انقل القفص الصدري الذي تم استئصاله من الفئران المصابة بالقتل الرحيم إلى طبق بتري شفاف مطلي بالمطاط الصناعي السيليكوني مملوء بمخزن HEPES-PSS الهوائي البارد المثلج وقم بتثبيته على كلا الجانبين. تحت المجهر ، قم بقطع وإزالة القلب والشريان الأورطي المتصل برفق من القفص الصدري وانقله إلى طبق نظيف مغطى بالمطاط الصناعي السيليكوني ، ثم قم بإزالة النسيج الضام الدهني والدم المتخثر برفق من الشريان الأورطي. باستخدام مقص صغير حاد ، قم بتشريح وعزل الشريان الأورطي بالكامل بدءا من منطقة القوس إلى أسفل الشريان الأورطي الهابط.
قطع الشريان الأورطي تشريح إلى أربعة أجزاء من 2 ملليمتر لكل منهما. استخدم المسطرة الصغيرة داخل الطبق كمرجع. في الغرف التي تحتوي بالفعل على 5 ملليلتر من المخزن المؤقت HEPES-PSS الدافئ والتهوية ، حرك بعناية كل جزء من أجزاء الأبهر 2 ملم على دبابيس التثبيت باستخدام الملقط.
عند وضع الحجرة مرة أخرى في وحدة التصوير العضلي ، حرك المسامير ببطء عن طريق تدوير الميكرومتر عكس اتجاه عقارب الساعة حتى لا ينزلق الجزء الأبهري عن المسامير. أعد كل حجرة تصوير عضلي إلى الوحدة وابدأ في تهوية الغرف عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. صفي الغرف وأضيفي 5 ملليلتر من محلول HEPES-PSS الطازج والدافئ والساخن إلى كل غرفة.
إذا لزم الأمر ، أعد ضبط قياسات القوة لقراءة التوتر الأمثل البالغ 6 مللي نيوتن. أرح المنديل لمدة 15 إلى 20 دقيقة أخرى. افتح برنامج الحصول على البيانات.
قم بتغيير أرقام التتبع من 50 إلى 1 إلى 500 إلى 1 واضغط على ابدأ. قبل بدء تجربة جديدة ، تأكد من إضافة التسمية المناسبة على برنامج الحصول على البيانات. استنزاف الغرف مرة أخرى قبل إضافة 5 ملليلتر من محلول عالي البوتاسيوم إلى كل غرفة.
قم بتصريف الغرف مرة أخرى بمجرد وصول الاستجابة المقلصة للمحلول عالي البوتاسيوم إلى هضبة لتوليد القوة. اغسل المنديل بمحلول HEPES-PSS ثلاث مرات. أضف 5 ملليلتر من محلول عالي البوتاسيوم إلى كل غرفة.
صفي الغرف بمجرد وصول الاستجابة المقلصة لمحلول عالي البوتاسيوم إلى هضبة لتوليد القوة واغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام HEPES-PSS ، ثم أرح الأنسجة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. قبل التعاقد على شرائح الأبهر مع عامل مضيق للأوعية PE بجرعة دون الحد الأقصى. اسمح لمنحنى الانكماش الناجم عن PE بالوصول إلى هضبة لتطوير التوتر.
أضف هضبة من تطور التوتر إلى PE عند 5 ميكرولتر من الجرعات المتزايدة من محاليل مخزون عمل الأسيتيل كولين في فترات مدتها 3 دقائق لإنشاء تركيزات نهائية من الأسيتيل كولين من 50 بيكومولار إلى 10 ميكرومولار في غرفة التصوير العضلي كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد الانتهاء من تجربة الاستجابة للجرعة ، قم بتصريف الغرف ، واغسل شرائح الأبهر بمحلول HEPES-PSS الدافئ والتهوية ثلاث مرات وأرح الأنسجة لمدة 30 دقيقة. بعد إراحة أجزاء الأبهر لمدة 30 دقيقة ، قم بتصريف الغرف وإضافة محلول طازج ودافئ عالي البوتاسيوم إلى كل حجرة ، ثم قم بتصريف الغرف وغسل الأنسجة بمحلول HEPES-PSS عندما تصل استجابة الانقباض لمحلول البوتاسيوم العالي إلى هضبة F كما هو موضح سابقا.
قم باحتضان الأجزاء الأبهرية مسبقا باستخدام L-NAME عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول مخزون العمل المحضر 100 ملليمولار لتقييم مساهمة إنتاج أكسيد النيتريك في الانحلال الوعائي الناجم عن الأسيتيل كولين المرصود. بدون إزالة اسم L ، أضف الجرعة دون القصوى من PE إلى الغرفة للحث على تقلص الأبهر. انتظر حتى يصل منحنى الانكماش الناجم عن PE إلى هضبة لتطوير التوتر ، ثم أضف الأسيتيل كولين إلى غرفة التصوير العضلي لتحقيق تركيز نهائي قدره 500 نانومولار.
انتظر بضع دقائق لتسجيل أي تغييرات محتملة في تطوير القوة حتى تستقر الهضبة المشكلة. استنزاف الغرف وغسل الأنسجة بمحلول HEPES-PSS الدافئ ثلاث مرات. ضع غرفة التصوير العضلي تحت المجهر ومرر برفق سلكا صغيرا عبر تجويف الشريان الأورطي.
حرك السلك برفق عبر التجويف لفترة قصيرة. قطع الشريان الأورطي إلى حلقات الأبهر 2 ملم وتركيب تلك الحلقات على غرفة التصوير العضلي. اضبط الشد الأمثل عند 6 مللي نيوتن واترك الأنسجة ترتاح لمدة 30 دقيقة في محلول HEPES-PSS الدافئ الهوائي ، ثم صفي الغرف وأضف 5 ملليلتر من محلول HEPES-PSS الهوائي الدافئ الطازج إلى كل غرفة.
قم بتصفير القوة لجميع غرف التصوير العضلي وقم بتدوير الميكرومتر ببطء عكس اتجاه عقارب الساعة لزيادة المسافة بين المسامير حتى تصل القوة المسجلة إلى التوتر الأمثل المطلوب لالشريان الأورطي للماوس. اضغط على المنديل لمدة 15 إلى 20 دقيقة أخرى عند التوتر الأمثل ، ثم قم بتصريف الغرف مرة أخرى قبل إضافة 5 ملليلتر من محلول عالي البوتاسيوم إلى كل غرفة. قم بتصريف الغرف مرة أخرى واغسل الأنسجة بمحلول HEPES-PSS ثلاث مرات بمجرد وصول استجابة الانكماش إلى محلول أيون البوتاسيوم العالي إلى الهضبة.
أرح الأنسجة لمدة 15 إلى 20 دقيقة ، ثم انقبض الأجزاء الأبهرية مسبقا باستخدام PE ، عامل مضيق للأوعية. عندما تصل القوة المستحثة ب PE إلى هضبة ، أضف التركيز دون الحد الأقصى للأسيتيل كولين إلى غرفة التصوير العضلي لتحقيق تركيز نهائي قدره 500 نانومولار. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن الهضبة المسجلة لتطوير القوة التي يسببها PE لا تتغير قبل إنهاء التجربة.
تم تقييم سلامة وصلاحية كل سفينة معزولة من خلال تسجيل توليد قوة الانقباض. تم استخدام ذروة القوة المسجلة لاحقا لتطبيع توليد القوة لنفس الجزء استجابة للناهضات. صورت قياسات الانحلال الوعائي بوساطة البطانة تقلص العضلات الملساء وتوليد القوة.
عندما وصل الانكماش الناجم عن PE إلى هضبة ، حققت جرعات متزايدة من الأسيتيل كولين أقصى قدر من الاسترخاء الوعائي في الجزء المعزول. مانع أكسيد النيتريك L-NAME منع تماما الانحلال الوعائي الناجم عن الأسيتيل كولين في الشريان الأورطي المتعاقد عليه مسبقا مما يشير إلى أن الأسيتيل كولين يحفز استرخاء الأوعية الأبهري من خلال زيادة إنتاج أكسيد النيتريك. علاوة على ذلك ، فإن إزالة الطبقة البطانية من الأجزاء الأبهرية منعت أيضا استرخاء الأوعية الناجم عن الأسيتيل كولين مما يؤكد دور البطانة في استرخاء الأوعية الدموية.
تأكد من أن تكون لطيفا أثناء التعامل مع الأوعية الدموية وتنظيفه وتشريحه. من الأهمية بمكان إضافة الناهضات الدوائية والمثبطات بحذر حتى لا تزعج حلقات الأوعية الدموية المثبتة على غرف التصوير العضلي. يمكن أن تساعد المعلومات في تصميم تجارب لاستكشاف الأساليب العلاجية المحتملة لمعالجة الخلل الوظيفي في طبقات وعاء دموي معين.
