هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم وظائف الأعضاء الدموية الدماغية من حيث صلتها بتنظيم تدفق الدم الدماغي أثناء الشيخوخة وتطور الأمراض المزمنة. الميزة الأساسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس متزامن للكالسيوم داخل الخلايا وإمكانية الغشاء من البطاني الشرياني الدماغي في شكل أصلي في ظل الظروف الفسيولوجية. لعزل دماغ الفأر، تحت المجهر إزالة الجلد والشعر على الجمجمة.
وإزالة الدم المفرط مع بوصه الباردة خالية من الكالسيوم. المقبل، وجعل شق باستخدام فقط نصائح من مقص التشريح القياسية. بدءا من عظم القذالي وتمتد من خلال العظام الأنفية للجمجمة.
ثم افتح الجمجمة بعناية على طول الشق ، وذلك باستخدام ملقط خشنة الرؤوس وفصل النسيج الضام لفضح الدماغ. غسل بلطف الدماغ المعزول مع بزة بنز خالية من الكالسيوم الباردة في منقار لإزالة الدم. ضع الجانب البطني للدماغ في غرفة تحتوي على محلول تشريح بارد لعزل الشرايين الدماغية.
لعزل الشرايين الدماغية، وتأمين الدماغ المعزول في محلول تشريح الباردة عن طريق إدراج اثنين من دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال ذلك، في طلاء بوليمر السيليكون المشبع بالفحم في الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج. في وقت لاحق، عزل جراحيا الشرايين الدماغية الخلفية حوالي 0.3 إلى 0.5 شرائح سنتيمتر من الاتصال الخلفي والشرايين basilar. استخدام دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ لتأمين كل من الشرايين الدماغية الخلفية المعزولة في حل تشريح في طبق بيتري.
ثم تنظيف الشرايين الدماغية الخلفية المعزولة بعناية عن طريق إزالة النسيج الضام باستخدام ملقط ناعم شحذ. قطع الشرايين سليمة إلى واحد إلى اثنين من شرائح ملليمتر لعملية الهضم الأنزيمية. في هذا الإجراء، وإعداد جهاز التثايب باستخدام المجهر، وكاميرا، ومرحلة الألومنيوم عقد غرفة وmicromanipulators.
تأمين microsyringe مع وحدة تحكم مضخة المجاورة للمرحلة والعينة. المقبل الردم تماما ماصة المعايرة مع الزيوت المعدنية وتأمينه على المكبس microsyringe. ثم استخدام microsyringe مع وحدة تحكم مضخة سحب حوالي 130 نانولترات من حل الانفصام في ماصة مع ضمان عدم وجود فقاعات الهواء.
في وقت لاحق، ووضع شرائح الشرايين سليمة في ملليلتر واحد من محلول الانفصام مع التركيزات المطلوبة من الإنزيمات في أنبوب زجاجي 10 ملليلتر. احتضان في 34 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 دقيقة للهضم الجزئي. بعد الهضم، استبدال محلول الإنزيم بخمسة ملليلترات من محلول الانفصام الطازج.
باستخدام ماصة ملليلتر واحدة، نقل قطعة واحدة إلى غرفة تحتوي على حل تفكك في درجة حرارة الغرفة. التالي مكان ماصة في حل الانفصام في الغرفة ووضعها على مقربة من نهاية واحدة من وعاء هضم. حدد معدلًا في نطاق 2 إلى 5 نانولترات في الثانية على وحدة تحكم المضخة للحصول على تريثوريشن لطيف.
أثناء عرض من خلال 100 مرة إلى 200 مرة التكبير سحب وإخراج الجزء الشرياني لتفكك خلايا العضلات الملساء في حين تنتج أنبوب البطانية. إذا لزم الأمر، استخدم بعناية ملقط ذات رؤوس دقيقة لفصل المدفنية المنفصلة واللمينا المرنة الداخلية من أنبوب البطانية. تأكد من أن جميع خلايا العضلات الملساء منفصلة وأن الخلايا البطانية فقط تبقى كما أنبوب سليمة.
باستخدام micromanipulators، وتأمين كل نهاية من أنبوب البطانية على زلة الغطاء الزجاجي لغرفة الضخ الفائق باستخدام البورسلليكات الزجاج تثبيت ماصات. غسل من adventitia مفككة وخلايا العضلات الملساء من الغرفة. واستبدال محلول الانفصام مع اثنين من الزهد أكثر كلوريد الكالسيوم PSS.
نقل منصة متحركة مع أنبوب البطانية المضمونة على مجهر القذف الفائق والتلاعب التجريبي. ثم استخدام ستة خزانات نظيفة 50 ملليلتر للتسليم المستمر لPSS والحلول المخدرات المعنية خلال التجربة. استخدم صمام التحكم في التدفق في الخط لتعيين معدل التدفق يدويًا على أنه ثابت كتدفق مرق أثناء مطابقة تدفق التغذية إلى شفط الفراغ.
تسليم PSS إلى الغرفة للضخ الفائق للأنبوب البطانية لمدة خمس دقائق على الأقل قبل تسجيل بيانات الخلفية وتحميل الصبغة. لقياس إمكانات الغشاء في وقت واحد مع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، وسحب قطب حاد والردم عليه مع اثنين من كلوريد البوتاسيوم الضرس لتسجيل من الخلايا المحملة صبغة الفورا-2. لدراسة اقتران داخل الخلايا عن طريق نقل صبغ، ردم microelectrode مع 0.1٪ بروبديسيوم يوديد الذائبة في اثنين من كلوريد البوتاسيوم المولر.
التالي في مكان القطب على سلك الفضة المغلفة مع كلوريد في حامل ماصة تعلق على مرحلة رئيس الكهربائي المضمونة مع ميكرومانيبولاتور. استخدام micromanipulator لوضع لفترة وجيزة غيض من القطب في تدفق PSS في الغرفة، في حين عرض من خلال الهدف أربع مرات. في وقت لاحق, تعيين احتمال غشاء يستريح إلى الصفر كما يتفق مع إمكانية حمام على أساس.
إذا رغبت في ذلك، استخدم شاشات خط أساس مسموعة مرتبطة بمقاييس كهربائية لربط الصوت مع التسجيلات المحتملة. بعد ذلك، زيادة التكبير إلى 400 مرة باستخدام 40 مرة الهدف ووضع غيض من القطب قليلا على الخلية من أنبوب البطانية. ضبط نافذة photometric باستخدام برنامج القياس الضوئي للتركيز على حوالي 50 إلى 80 خلايا البطانية.
ثم ضع القطب برفق في واحدة من خلايا الأنبوب البطانية باستخدام ميكرومانبولاتور وانتظر دقيقتين على الأقل لإمكانية استقرار الغشاء المستريح. مرة واحدة يستريح غشاء المحتملة مستقرة في قيمتها المتوقعة، بدوره على أنبوب الممول الضوئي على واجهة الفلوريسنس في غياب الضوء والبدء في الحصول على تركيز الكالسيوم داخل الخلايا من قبل فورا-2 مثيرة بالتناوب في 340 و 380 نانومتر في حين جمع انبعاثات الفلوريسكين في 510 نانومتر. مرة واحدة يتم إنشاء قياسات المتزامنة من إمكانات الغشاء وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا, السماح حوالي خمس دقائق للضخ الفائق للأنبوب البطانية مع PSS بمعدل تدفق لارينار ثابت قبل تطبيق المخدرات.
تطبيق الدواء المعدة في PSS إلى غرفة الضخ الفائق بمعدل تدفق ثابت. خلال العلاج من المخدرات قياس الغشاء المحتملة في نسب F340/F380 في وقت واحد. بمجرد الانتهاء من التجربة، اسحب القطب الكهربائي من الخلية.
ثم وقف التسجيلات المعنية من إمكانات الغشاء وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا وحفظ الملفات لتحليل البيانات. هذه صورة تباينية للتداخل على تباين أنبوب البطايلي الشرياني الدماغي للماوس، يتم تعديله من أجل التجربة في نافذة القياس الضوئي باستخدام هدف 40 مرة. يتم وضع قطب كهربائي حاد في خلية، كما هو موضح في الجزء العلوي من الصورة.
وفيما يلي أمثلة من آثار الخام لقياس في وقت واحد من F340/F380 نسبة وإمكانية غشاء استجابة ل100 ATP ميكرومولار. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر الفلورسنت confocal، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية بشأن إشارات ميكرودومين من الكالسيوم البطانية، وأنواع الأكسجين التفاعلية، كأمثلة. بشكل عام سوف تستمر هذه التقنية في تمهيد الطريق للأبحاث في علم وظائف الأعضاء الخلوية لاستكشاف وظيفة الأوعية الدموية والشيخوخة في الدورة الدموية والدورة الدموية اللمفاوية.
