نشكر ليو Pallanck للأسهم الطاير، كريستين سومرز للمساعدة التقنية وجيراسيموس P. Sykiotis لإجراء مناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة تدريب منحة T32CA009363 إلى MCB

1. باغت بفعل سلبي الفحص انجذاب بالجاذبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الذباب من النمط الجيني المطلوب، بفصلها بين الجنسين، وبشكل عشوائي مجموعة منهم في أفواج من 20-30 الحيوانات والوجه لهم في قوارير غذائية جديدة كل 2-3 أيام؛ اختبار كل مجموعة من الذباب (أي الأفواج في العمر كعينة، واحد الفوج / التركيب الوراثي) على الأقل مرة في الأسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثلاثين دقيقة قبل الاختبار انجذاب بالجاذبية السلبية، تخدير الذباب مع CO 2 ووضعها في أنابيب من البلاستيك واضحة قبل صفت أدلى مع اثنين من قارورة فارغة الغذائية (انظر الجدول مواد) انضم في فتحاتها مع الشريط واضحة (أبعاد الغرفة: 19 سم x 2.85 سم). في المقايسات لدينا عادة نحن نستخدم 25 الذباب / أنبوب. ملاحظة. يمكن أن تختلف مدة الشفاء من التخدير من بضع دقائق إلى عدة ساعات (على سبيل المثال O / N) وينبغي أن يكون الأمثل للالمورثات محددة اختبارها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة ارتفاعات مختلفة (1-20 سم) على قطعة من الورق النشاف والشريط ورقة على السطحية العموديةه، عمودي على مقاعد البدلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب أمام ورقة: يجب أن تكون جميع أنابيب الانحياز وأقرب ما يمكن إلى ورقة للسماح الارتفاع دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الكاميرا الرقمية (راجع &quot;معدات خاصة&quot; جدول) أمام الأنابيب، على مسافة من 20-30 سم من الورق، وعلى الوقوف (على سبيل المثال مربع طرف ماصة)، حدد &quot;فيلم&quot; الخيار والبدء تسجيل، في هذا الوقت يجب عليك أيضا بدء الموقت لتتبع الوقت بين محاكمات متتالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للذباب للجمع في الجزء السفلي من الأنبوب من خلال الاستفادة من أنبوب لبضع ثوان (مثلا 10 ثانية). يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على الدوام (أي نفس المدة، نفس القوة، نفس المشغل) في كافة مراحل التجربة برمتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حركات الذباب سجل &#39;مع الكاميرا الرقمية لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،5-1،7 أربعة عشر مرات على فترات مين واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الذباب التي هي فوق2 سم علامة بعد 10 ثانية عن طريق التفتيش البصري من الأفلام المسجلة. ملاحظة: في ظروف مقايسة لدينا فعل السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية الذباب &#39;لا تستمر إلى ما بعد اول 10 ثانية بعد مذهلة (أي التي الذباب تتحرك في كل الاتجاهات 10 ثانية بعد مفاجئة لهم). قفز مسافة لا تقل عن طريق الذباب السيطرة (أي 1 أسبوع الذباب القديمة معربا عن سائق THGal4، انظر أسطورة من الشكل 1) في هذا الإطار الوقت كان 2 سم. وبالتالي، استخدمنا علامة سم 2 كمرجع لتحليل أنشطة التسلق من الذباب من الأعمار والأنماط الجينية 10 ثانية بعد الشروع في سلوك مختلف. قد تتطلب هذه المعايير تعديل لمراعاة الاختلافات في سلوك الذباب اختبار (بسبب مثلا لخلفيات وراثية مختلفة، أو ظروف المختبر). لاحظ أنه في ظروف مقايسة لدينا، كل اختبار الأنماط الجينية أداؤها أسوأ أو على غرار الذباب من النمط الجيني السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ متوسط ​​نتائج من خمسة عشرالمحاكمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​صريحة كنسبة مئوية من مجموع عدد الذباب في الأنبوب (= نشاط تسلق٪)، وعدد من يكرر (N) وتعطى من قبل عدد من الأفواج المستقلة اختبار لكل الوراثي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية المختلفة على مر الزمن. ويمكن تحقيق ذلك مع ر اختبار الطالب (عند المقارنة بين اثنين من المورثات) أو تحليل ANOVA 2 في اتجاه تليها Bonferroni بعد مخصصة اختبار (عند تنفيذ مقارنات متعددة) باستخدام البرمجيات التجارية مثل GraphPad (GraphPad البرامج، Inc.La جولا، CA، الولايات المتحدة الأمريكية). </li></ol></li></ol> لاحظ نحن لدينا أداء جميع المقايسات في نفس الوقت من اليوم، في RT وتحت ظروف الإضاءة نفسها. الحفاظ على الذباب في ساعة الضوء / الظلام بيئة دورة 12 من المستحسن للسيطرة على تأثير إيقاعات الساعة البيولوجية على السلوك الحركي للذباب &#39;. 2. التيروزين المناعي هيدروكسيلازمقايسة من الجبال الدماغ كله الحلول ومخازن حل تثبيتي: امتصاص العرق 4٪ (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) غسل العازلة: 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني حجب العازلة: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.5٪ BSA تصاعد وسائل الإعلام: Mowiol-Dabco (انظر بروتوكول الموصوفة في هارلو E، لين دال، والأجسام المضادة-A دليل المختبرات، ومختبرات كولد سبرينغ هاربر الصحافة، كولد سبرينج هاربور، NY، الولايات المتحدة الأمريكية، 10:418 (1988)) إجراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الذباب في طبق تشريح مليئة ETOH 70٪ لمدة 1 دقيقة لإزالة الشمع بشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الذباب لطبق تشريح أخرى مليئة الجليد الباردة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الدماغ: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع يطير مع ما يصل الجانب البطني (اختياري: أجنحة إزالة والساقين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط استخدام واحدة من ملقط ل: سحب الرأس بعيدا عن الجسمالابقاء على الجسم وآخر على التمسك بشرة تحت العين لمنع تلف الدماغ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خرطوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الابقاء على بشرة الرأس على طرفي نقيض من شق ترك الباب مفتوحا بعد إزالة خرطوم وسحب في اتجاهين متعاكسين حتى تتم إزالة الدماغ من الكبسولة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل بشرة من الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع الأنسجة القصبة الهوائية مليئة بالهواء، وهذا سوف يمنع الدماغ من خلال تطفو الخطوات التالية الحضانة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بضعة ملليمترات قبالة الطرف من طرف P-200 ماصة ويوازن ذلك مع 0.1٪ تريتون حل X-100/PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام معدة طرف P-200 ماصة، نقل أدمغة إلى 0.5 مل أنبوب إيبندورف مليئة 0.5 مل من 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني والحفاظ على الجليد حتى تشريح كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح العقول في RT لمدة 20 دقيقة: تطبيق التناوب لطيف عن طريق وضع أنابيب إيبندورف على الرف ووضع رف على nutator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتياستخدام P-1000 الصغيرة ماصة، إضافة 0.5 مل من 0.1٪ X-100/PBS تريتون، مزيج من قبل انقلاب والسماح احتضان لمدة 1 دقيقة، كرر هذه الخطوة غسل مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة من غسل الثاني، إضافة 0.5 مل من 0.1٪ تريتون X-100/PBS والسماح احتضان عند RT لمدة 20 دقيقة؛ كرر هذه الخطوة مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة غسل أدمغة والسماح للاحتضان في عرقلة العازلة (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ تريتون X-100 و 0.5٪ BSA) لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العقول مع تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة لمكافحة TH (انظر &quot;جدول الكواشف محددة&quot;) في عرقلة الحل، لمدة يومين، في 4 درجات مئوية، مع دوران طيف (انظر الخطوة 2.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل الخطوات 2.7. و2.8 .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن أدمغة مع تخفيف 1:200 من الثانوية antibodyin عرقلة الحل، لمدة يومين، في 4 درجات مئوية، مع تناوب لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل الخطوات 2.7. و2.8 .. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح التركيب كما هو موضح في الشكل 2A: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ADD 2 X 25 قطرات ميكرولتر من تصاعد وسائط إلى غطاء زجاجي (24 × 60 مم، لا. 1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان كأسين الغطاء (حجم 18 × 18 مم، رقم 2) على تركيب وسائل الاعلام مما يترك فجوة في منتصف الشريحة واسمحوا الجافة. </li></ol> ملاحظة. تحقق من صاحب العينة على مرحلة المجهر متحد البؤر الخاصة بك. يمكنك جعل غطاء زجاجي نفس حجم 25 × 75 مم الشريحة عن طريق ربط 22 × 22 مم 1.5 غطاء زجاجي إلى واحدة من نهايات (استخدام طلاء الأظافر، والشريط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العازلة غسل، إضافة 50 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام والسماح للعقل لكي تتوازن معها من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قطع P-200 ماصة (انظر الخطوة 2.4) نقل أدمغة إلى الشريحة في الفضاء بين coverslips على اثنين وغطاء لهم مع ساترة لا. 1.5 (انظر الشكل 2A؛ لتوجيه العقول على الشريحة انظر صفحة 7). ملاحظة: هي التي شنت هذه العينات بين كأسين غطاء للسماح التصور على حد سواء الأمامي ومقر البريد المركزيالجانب rior من الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الفضاء كله بين النظارات غطاء مع تصاعد وسائل الإعلام؛ ماصة من زاوية واحدة لإزالة كل الهواء؛ اسمحوا الجافة وختم بطلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم عدد من الخلايا العصبية الدوبامين في كتلة معينة الحصول على سلسلة من المقاطع البصرية على طول المحور Z مع 1.0 ميكرون خطوة حجم باستخدام المجهر متحد البؤر (لتحديد التشريحية للمجموعات الدوبامين في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة انظر صفحة 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

فإننا نعلن أنه ليس لدينا مصالح مالية المتنافسة.

المقايسات الموصوفة هنا توفر نهجا مفيدا لدراسة دور الجينات المحددة، مما يشير إلى مسارات أو مركبات صغيرة في صيانة الخلايا العصبية DA في الشيخوخة، وكذلك في مختلف الخلفيات الوراثية المرتبطة بالمرض (استعرضت في 5). وباغت التي يسب?...

خصوصية المقايسات وصفها هنا تعتمد على استخدام خط الطيران GAL4 الذي يستغل متواليات التنظيمية من الجين هيدروكسيلاز التيروزين لتحقيق التعبير معينة في الخلايا العصبية الدوبامين 3. هيدروكسيلاز التيروزين يحفز الخطوة الأولى ومعدل منظم للفي تركيب الدوبامين. مناعية TH في الكبار يتراكب الدماغ يطير مع أن الدوبامين، مما يجعل TH مرشح جيد لتحديد الخلايا العصبية DA في الجسم الحي (انظر على سبيل المثال 6). وعلاوة على ذلك، فإن نمط التعبير عن THGal4 هو أكثر تحديدا من ذلك من GAL4 خطوط أخرى مثل DdcGal4، والذي يحتوي على متواليات التنظيمية من الجين كربوكسيل دوبا ويدفع التعبير المعدلة وراثيا ليس فقط في الخلايا العصبية DA، ولكن أيضا في الخلايا العصبية سيروتونيني المفعول ومجموعات فرعية من الخلايا الدبقية 3 . Feany وبندر (2000): لاحظ أولا أن التعبير عموم العصبية للإنسان الجين α-synuclein PD-مرتبط يسرع الفقدان التدريجي من ستاrtle التي يسببها السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية في ذبابة الفاكهة. وقد لاحظنا نتائج مماثلة باستخدام الخلايا العصبية DA-محددة خط THGal4 لدفع expressionof إلى α-synuclein التحوير 10 وتستخدم هذه ظيفية للقراءة لدراسة دور اعصاب من مسار Nrf2 في هذا ذبابة الفاكهة نموذجا للPD 14. ويتم تكييف الفحص المحددة الموصوفة هنا من 2 و 3. ذبابة الفاكهة الدماغ يحتوي على أكثر من 100 الخلايا العصبية DA، وترتيبها في لا يقل عن 5 مجموعات مختلفة (PPL1، PPL2، PAL، PPM1 / 2، PPM3) التي يمكن تصور كليا يتصاعد الدماغ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (انظر على سبيل المثال 11 و 7). انها لا تزال مثيرة للجدل سواء أو ليس عدد الخلايا العصبية DA في الانخفاض الدماغ ذبابة الفاكهة مع تقدم العمر 9 و 11، ولكن لوحظ تنكس عصبي التي تعتمد على العمر في الذباب حيث تم تحور الجينات PD-مرتبط / بإفراط (overexpressed) لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان5. التعبير عن الإنسان α-DA synuclein في الخلايا العصبية لديها مثل هذا التأثير، وبالتالي، قد استخدمت كنموذج لPD. هنا نحن تصف مقايسة لالخلايا العصبية DA الاعتماد في الدماغ كله يتصاعد باستخدام TH كعلامة الخلية. وقد تم تكييف هذا الاختبار في الفترة من 13 و 10.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو كائن نموذجا قيما لدراسة الشيخوخة والعمليات التنكسية المرضية في الجهاز العصبي. وتشمل مزايا الطاير كنظام تجريبي معرفة منشأ الجينية، فترة حياة قصيرة وإمكانية لمراقبة وتحليل كمي السلوكيات المعقدة. التعبير عن جينات مرض مرتبط في السكان العصبية محددة من الدماغ ذبابة الفاكهة، ويمكن استخدامها في تصميم نموذج لأمراض الاعصاب الإنسان مثل الشلل الرعاش والزهايمر 5. الدوبامين (DA) الخلايا العصبية هي من بين السكان العصبية الأكثر ضعفا في الدماغ البشري الشيخوخة. في مرض باركنسون (PD)، واضطراب حركة الاعصاب الأكثر شيوعا، وتسارع فقدان الخلايا العصبية DA يؤدي إلى الانخفاض التدريجي الذي لا رجعة فيه في وظيفة الحركي. بالإضافة إلى العمر والتعرض للسموم البيئية، ويتفاقم فقدان الخلايا العصبية DA بواسطة الطفرات محددة في الترميزأو مناطق المروج من عدة جينات. تحديد هذه الأليلات PD المرتبطة يوفر أساس تجريبي لاستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة تنكس عصبي من الخلايا العصبية DA في الجسم الحي. على سبيل المثال، التعبير عن الجينات البشرية α-synuclein PD-مرتبط في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية DA يلخص بعض الملامح من الأمراض التي تصيب البشر، مثل الفقدان التدريجي للخلايا العصبية DA وانخفاض وظيفة الحركي 2. وفقا لذلك، وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة في PD 8. نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي عادة استخدمت لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على عمر الخلايا العصبية DA في ذبابة الفاكهة: فحص التسلق على أساس جفل الناجم عن استجابة انجذاب بالجاذبية السلبية والتيروزين المناعية هيدروكسيلاز من الدماغ الكبار كله يتصاعد الى رصد عدد من الخلايا العصبية DA في أعمار مختلفة. في كلتا الحالتين، في التعبير المجراة من UAS رransgenes تحديدا في الخلايا العصبية DA يمكن تحقيقه باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) المروج-GAL4 خط سائق 3، 10.

لقد استخدمت المقايسات الموصوفة هنا إلى دراسة دور الإجهاد واقية المسار Nrf2 في نموذج ذبابة الفاكهة من PD 14. يعتمد هذا النموذج على التعبير عن الإنسان الجين α-synuclein في الخلايا العصبية DA باستخدام TH GAL4 السائق 2، 10. ويبين <st...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي تم وضعها لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على سن الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt;: تسلق / باغت السلبية الناجمة عن انجذاب بالجاذبية الفحص الذي يسمح لدراسة الآثار الفنية من DA الخلايا العصبية انحطاط والمناعية هيدروكسيلاز التيروزين الذي يستخدم لتحديد وإحصاء الخلايا العصبية DA كليا يتصاعد الدماغ.

تقييم الظواهر الاعصاب في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K Views.  University of Rochester Medical Center. نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي تم وضعها لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على سن الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة: تسلق / باغت السلبية الناجمة عن انجذاب بالجاذبية الفحص الذي يسمح لدراسة الآثار الفنية من DA الخلايا العصبية انحطاط والمناعية هيد...

Video: Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

تشريح والثقافة من الدوبامين والفأر Explants العقدة المخططة في ثلاثي الأبعاد فحوصات مصفوفة الكولاجين

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

الكشف عن بروتين Palmitoylation في الخلايا العصبية قرن آمون بواسطة مثقف مناعي والبورصات الأسيل، البيوتين (آبي)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

فحوصات حاسة الشم لنماذج من الماوس مرض الاعصاب

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق المناعية

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

تحليل متشابك التحوير من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.