الهدف الرئيسي لهذا البروتوكول هو استخدام قوة علم الوراثة إلى الأمام لتحديد الجينات التي عندما dysregulated يؤدي إلى تنكس عصبي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر نهجاً غير متحيز ومباشر لتحديد الجينات العصبية التي قد يكون من الأصعب تنفيذها في نماذج الثدييات. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الجينات الجديدة المتورطة في عملية التنكس العصبي الذي يرتبط بالعديد من حالات المرض مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون.
بالإضافة إلى تحديد الجينات العصبية، يمكن استخدام النهج الوراثي الأمامي لاكتشاف الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية الأخرى مثل وظيفة الخلايا العصبية وانتقالها. للبدء ، وجمع الذباب homozygous من خطوط تنتمي إلى مجموعة من المطفرة ENU من المسوخ Drosophila تعيين إلى الكروموسوم الثاني. اقلب الذباب الذي يتراوح عمره بين 10 و12 يومًا في غرفة الاختبار دون تخدير سطر واحد في كل مرة والسماح لهم بالتعافي لمدة خمس دقائق.
مع علامة خط خمسة سنتيمتر أسفل، اضغط بالقوة على الغرفة ثلاث مرات على لوحة الماوس وضعت على سطح صلب بحيث يبدأ كل الذباب المقايسة في الجزء السفلي. مراقبة الحركة الطيران على مدى فترة 10 ثانية. تسجيل عدد الذباب التي تصل أو تمر خط خمسة سنتيمترات في هذا الوقت، فضلا عن العدد الإجمالي للذباب اختبارها.
انتظر دقيقة واحدة قبل البدء في محاكمة ثانية. كرر إجراء نسخ متماثلة ثلاثة التجريبية كحد أدنى لكل سطر. بعد تخدير الذباب على وسادة ثاني أكسيد الكربون ، قطع رؤساء الذباب مع شفرة جراحية واستخدام فرشاة الطلاء لوضعها بلطف في ملليلتر واحد من تثبيت كارنوي في أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.
ثم تخزين الأنبوب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تأكد من غرقت رؤساء في الحل المثبت. تحت غطاء أبخرة، استخدم ماصة P1000 لاستبدال الحل المثبت بميليلتر واحد من 70٪ الإيثانول والحفاظ على العينات عند أربع درجات مئوية للتحليل في المستقبل.
باستخدام ماصة باستور، قم بنقل الرؤوس الثابتة إلى أشرطة ميكروبيوبسي وإغلاق الكاسيتات. إرسال أشرطة الكاسيت إلى منشأة علم النسيج لمعالجتها أو وضعها في آلة معالجة الأنسجة الآلية إذا كانت متوفرة في الموقع. تشغيل البرنامج لتجفيف، واضحة والتسلل إلى رؤساء مع البارافين.
ثم نقل الكاسيت في محطة التضمين البارافين مع البارافين ساخنة في 60 درجة مئوية ووضع قوالب قاعدة معدنية التي تناسب الكاسيت على محطة ساخنة. استخدام ملقط غرامة لتوجيه رؤساء بحيث يواجهون أعلى في القالب قاعدة. التوجه السليم للرأس أمر بالغ الأهمية لتحليل الأنسجة.
بعد تصلب, تقليم كل كتلة البارافين لتقليل السطح الذي سيتم تقسيمه. قطع خمسة أقسام ميكرومتر من كل كتلة على microtome. بعد ذلك، ضع شرائط البارافين المقسمة في حمام مائي ساخن عند درجة حرارة 35 درجة مئوية لمدة أقصاها خمس دقائق.
غمر شريحة مغلفة ببوليليسين في حمام الماء الساخن واستخدم قضيب خشب لوضع الأشرطة المقطعة على الشريحة. دع الشرائح تجفف الهواء طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي، استخدم شريحة أكثر دفئًا لتسخين الشرائح لمدة 15 دقيقة عند 63 درجة مئوية.
تحت غطاء الدخان، ضع الشرائح على رف تلطيخ الشريحة ووضع الحامل في HistoChoice لمدة خمس دقائق مرتين متبوعة بعدة علاجات الإيثانول والاستحمام المائي المقطر وفقًا للمخطوطة. نقل الرف إلى حاوية مليئة هاريس هيماتيوكسيلين لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق لطخة. ثم أخرج الحامل من محلول الهماتيوكسيلين وضعه تحت مياه الصنبور الجارية لمدة 10 دقائق قبل الخطوات التالية.
بعد تلطيخ، وذلك باستخدام ملقط، واتخاذ الشرائح من حل HistoChoice أو Xylene. بالتنقيط طبقة رقيقة من المتوسط دائم تصاعد على العينة ووضع بلطف غطاء على الجزء العلوي. تجنب تشكيل فقاعات.
بعد أن يتم تصلب المتوسطة المتصاعدة، ضع الشريحة تحت مجهر خفيف للحصول على صور لأقسام الدماغ التمثيلية في منتصف الفقر تقريبًا. أولاً، إعداد غذاء يحتوي على قارورة لتوليد الذباب الإناث غير التيروزيجو. بعد التخدير ثاني أكسيد الكربون، واستخدام فرشاة لنقل خمسة ذكور من خط متحولة و 10 الإناث العذراء من الفص التشويش sternopleural ودبوس على خط O في القارورة لجعل الصليب.
ضع القارورة عند 25 درجة مئوية. بعد 10 إلى 12 يوما، وجمع ما لا يقل عن 15 ذرية عذراء الإناث تحمل الكروموسوم المتحولة والكروموم علامة. عبورها إلى خمسة ذكور من خط متوازن يحمل علامة أخرى مُجْرِيةَ مُجْرِية على قِطْبِ أو ما يعادله.
بعد 10 إلى 12 يوما، وجمع ذرية الذكور heterozygous تحمل إما scutoid أو مجعد O والكروسوم يحتمل أن يعاد دمجها من الصليب. تتزاوج بشكل فردي لهم الإناث العذراء من الأسهم تحمل الكروموسوم المتحول. عشرة إلى 12 أيام في وقت لاحق، وجمع ذرية من الصليب الماضي في الغذاء الجديد الذي يحتوي على قوارير وعمر الذباب في 29 درجة مئوية إلى 10 إلى 14 يوما.
أداء الأنسجة على رؤوس ذبابة وتكرار لذرية كل عبر الفردية. مع هذه المعلومات، تنفيذ رسم خرائط نقص على منطقة ضيقة من الكروموسوم لصقل موقع الطفرة المتنحية. كل خط نقص لديه حذف منطقة مختلفة من الكروموسومات مما يسمح لهم لاستخدامها لاختبار التكملة.
بعد ذلك، عبر خطوط من عدة عوز Drosophila للكروموسوم الثاني والبحث عن غير تكملة من النمط الظاهري للمصلحة. للحصول على مرجع لتحليل تسلسل الحمض النووي، قم بتنزيل ملف تنسيق FASTA الذي يحتوي على تسلسل التوافق الجينومي لجين BRAT من FlyBase أو استخدام ملف يحتوي على نتائج تسلسل BRAT لمراقبة الخلفية الجينية، على سبيل المثال خط Drosophila المُعَد في الأصل. فتح ملفات التسلسل في محرر بلازميد A.
انتقل إلى تحرير وانقر فوق محاذاة التسلسلات. باستخدام ماوس الكمبيوتر، حدد كافة التسلسلات للمقارنة. في قائمة الإفلات، قم بالإشارة إلى التسلسل المرجعي لهذه المحاذاة.
فحص المنطقة التي تم تسلسلها لإجراء تغييرات النيوكليوتيدات بالمقارنة مع التسلسل المرجعي. إذا رغبت في ذلك، حفظ المحاذاة على جهاز كمبيوتر في تنسيق RTF عن طريق النقر على النص ثم حفظ. تنفيذ تجربة الإنقاذ عن طريق جمع ذرية F1 من كل صليب.
حدد بعناية بعيدا الموازنات ملحوظ. العمر الذباب على Drosophila الغذاء المتوسط في 29 درجة مئوية وإجراء تحليل الأنسجة على العقول للبحث عن التنكس العصبي كما كان سابقا. لإجراء تحليل العمر تعتمد على تنكس الأعصاب في 867 المسوخ، سن الذباب إلى خمسة، 15 و 25 يوما وإجراء تحليل الأنسجة اللاحقة.
يقدم هذا البروتوكول نهجًا وراثيًا أماميًا للفحص من خلال مجموعة من الذباب المُمَاجَع كيميائيًا باستخدام مقايسة متسلقة. من بين 235 خطوط homozygous ، أظهر حوالي 37٪ من الخطوط المختبرة معدل تسلق أقل من 50٪ عند اختباره في سن 10 إلى 12 يومًا. كشفت الشاشة النسيجية اللاحقة على 51 من الخطوط التي تظهر أقل معدل تمرير تسلق أن 29 من هذه الخطوط أظهرت مظهرًا مرئيًا لثقوب في ورم الأعصاب في الدماغ تتراوح بين معتدل إلى شديد يدل على التنكس العصبي.
النمط الظاهري للانعجاب العصبي في 867 الذباب هو المتنحية لأن أدمغة الذباب heterozygous 867 التي تم تجاوزها إلى سلالة من نوع البرية كانت مماثلة لتلك التي من الضوابط. خط نقص Df24116 لا يكمل النمط الظاهري 867 متحولة على أساس التسلق المقايسة. التحقق النسيجي يظهر خط نقص Df24116 لا يكمل 867 العصبية فيينوسيشن النمط الظاهري في حين Df9296 لا.
فحص النمط الظاهري الدماغ من 867 المسوخ عبرت إلى خطوط نقص إضافية أكد أن الطفرة الواردة في منطقة الجينوم الذي يتضمن الجينات BRAT. من المهم أن نتذكر خلال هذا الإجراء للعمل بدقة ودقة قدر الإمكان لأن هذا البروتوكول يجمع بين عدة خطوات والتي إذا نفذت بشكل غير صحيح يمكن أن تؤثر على تحديد المسوخ مع التنكس العصبي في الجينات المرشحة. اعتمادا على الجينات التي تم تحديدها، يمكن أن يشمل التحليل اللاحق اختبار بويضات إضافية من جين الفائدة أو التفاعلات مع الجينات التي تلعب دورا في مسارات معروفة من التنكس العصبي.
أثناء إجراء الأنسجة، تذكر التعامل مع حل الإصلاح في Carnoy بحذر لأنه يحتوي على الكلوروفورم. ارتداء القفازات واستخدامها مع التهوية الكافية بشكل مثالي تحت غطاء محرك الدخان. وبالمثل، تنفيذ كل التلطيخ الأنسجة تحت غطاء محرك الدخان.
