Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. توليف إيريديوم (III) مجمع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 53.6 ملغ (50 ميكرومول) من [عير (PPY) 2 -Cl] 2 وتذوب في 5 مل من كلوريد الميثيلين. إضافة هذا الحل إلى قارورة 50 مل مخروطي مزودة بقضيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن من 26.2 ملغ (100 ميكرومول) من AgOTf وتذوب في 5 مل من الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة AgOTf المنحل إلى [عير (PPY) 2 -Cl] (2) حل ويقلب لمدة 1 ساعة. ملاحظة: كريم الملونة الطين ينبغي أن يؤدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، تصفية الطين من خلال هلام السيليكا إلى 25 × 95 مم درهم قارورة وتتبخر من المذيبات المتبقية باستخدام المبخر الدوار (5-10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد إزالة معظم المذيبات، تأكد من بقايا الصفراء الزيتية يبقى في قارورة. لهذه المخلفات، إضافة 1 مل من الميثانول لإعادة حل المنتجات ويجفد 1-2 أيام لانتاج المنتج الصلب الأصفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 + المنتج (IR1) من خلال H &lt;سوب&gt; 1 NMR (في CDCl 3)، ESI والأشعة فوق البنفسجية فيس كما هو موضح سابقا. 23 </li></ol> 2. تفاعلات IR1 مع الأحماض الأمينية مختلفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 2 ملم من IR1 في الميثانول (MW 537.10 جم / مول). دوامة لضمان حل كامل للصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 ميكرومتر حلول من الأحماض الأمينية والجزيئات الحيوية التالية في HEPES مخزنة المالحة (HBS، 100 ملي HEPES، 137 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) علاء، ASP، السيستئين، صاحب، إيل، ليس، سر، في محاولة، فال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من كل الأحماض الأمينية إلى سوداء لوحة 96-جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من HBS لوحة لتكون بمثابة فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر من 2 ملي IR1 حل لكل عينة ويهز لوحة على لوحة شاكر لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، والحصول على أطياف الانبعاث من العينات باستخدام قارئ لوحة 96-جيدا (365 EX / 400-700 م). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الصك وفتح برنامج قارئ لوحة لإنشاء تجربة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين إكسب جديدeriment لقراءة تفحص مضان مع الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر، وعرض الشق من 9 نانومتر مع البصريات في المرتبة الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الانبعاثات 300-700 نانومتر مع حجم الخطوة من 5 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات لتحليل البيانات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى اضحة وحة 96 جيدا وصورة الانبعاثات باستخدام نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية. </li></ol> 3. معايرة IR1 مع BNT-II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ملم حل سهم BNT-II (MW 8233.6 ز / مول) في HBS فضلا عن حل 2 ملم من IR1 في الميثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من محلول المخزون، وإعداد 1 مل من 100 ميكرومتر BNT-II في HBS. دوامة أنبوب microcentrifuge لضمان عينة مختلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع متسلسل 100 ميكرومتر BNT-II بمقدار النصف في HBS إلى تركيز النهائي من 1.56 ميكرومتر BNT-II. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في ثلاث نسخ، مع HBS بمثابة فارغة، إلى الآبار من 96 لوحة جيدا. لكل عينة، إضافة 2.5 ميكرولتر من 2 ملي IR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشيخأك لوحة لمدة 10 دقيقة على لوحة شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهز، وقراءة كثافة الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 365 نانومتر) باستخدام قارئ لوحة 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الصك وفتح برنامج قارئ لوحة لإنشاء تجربة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تجربة جديدة لقراءة نقطة النهاية مضان مع الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 510 نانومتر. تعيين عرض الشق لكل من الأطوال الموجية ل9nm، مع البصريات في المرتبة الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحة وتصدير البيانات لتحليلها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى اضحة وحة 96 جيدا وصورة المعايرة باستخدام نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية. </li></ol> 4. في الوقت الحقيقي التحليل الحركي للنظام IR1 / BNT-II عن طريق التداخل Biolayer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من العازلة الحركي (KB؛ 1X الفوسفات مخزنة المالحة مع توين-20 0.02٪) إلى 8 آبار في العمود الأول من سوداء لوحة 96-جيدا وتضاف لوحة في أجهزة الاستشعار البلاستيكحامل. نقل بعناية 8 ني (II) أجهزة الاستشعار NTA إلى العمود الأول في حامل البلاستيك مثل أن النصائح التي علقت في آبار العازلة. وضع حامل البلاستيك في الجانب الأيسر من أداة التداخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 مل من 0.5 ميكرومتر حل BNT-II في KB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 ميكرولتر من 10 ميكرومتر حل IR1 في KB، وتمييع متسلسل إلى النصف وصولا الى 0.156 ميكرومتر في KB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى أسود 96 لوحة جيدا جديدة، ماصة 200 ميكرولتر من KB إلى جميع الآبار 8 في العمود A و C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس اللوحة، ماصة 200 ميكرولتر من الحل 0.5μM BNT-II إلى الآبار في العمود B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 200 ميكرولتر من كل تخفيف من IR1 في العمود D، بدءا KB كما الفراغ في D1 جيدا. إضافة التخفيفات بحيث تزيد من الآبار في تركيز IR1 أسفل العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع هذه اللوحة في الصك على يمين لوحة تحتوي على أجهزة استشعار ما قبل التبول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرنامج biolayer التداخل، وإنشاء kinet الأساسيجيم التجربة من خلال تحديد نصائح لوحة، والفحص، وأجهزة الاستشعار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعريف لوحة، حدد العمود على الشاشة، انقر على الحق، واختيار تعريف مناسب للآبار. حدد &quot;مخزن&quot; للأعمدة A و C، &quot;تحميل&quot; العمود B، و &quot;عينة&quot; لالعمود D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف الفحص في علامة التبويب التالي من خلال إضافة الخطوات التالية (انقر على &quot;أضف&quot;): موازنة (مخصص)، و 60 ثانية؛ تحميل، 120 ثانية؛ خط الأساس، 60 ثانية؛ جمعية، 120 ثانية؛ والتفكك، 300 ثانية. حدد الخطوة موازنة وانقر نقرا مزدوجا على العمود A. كرر لتحميل (العمود B)، الأساس (العمود C)، وجمعية (العمود D)، والتفكك (العمود C). حدد أجهزة الاستشعار ني (II) NTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى علامة التبويب التالية وتأكد من أن أجهزة الاستشعار في العمود A على حامل استشعار البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد ويرد التجربة بشكل صحيح، إدراج اسم الملف، تأكد من أن &quot;التجربة تأخير&quot; محددا، ثم اضغط على &quot;الذهاب&quot;. NOTE: نظرا لطبيعة الآلية الصك، مرة واحدة ويرد التجربة الحركية، سيحدث الخطوات كما كان مخططا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على المدى الحركي الكامل، معالجة البيانات في برامج معالجة المقدمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر نقرا مزدوجا على مجلد مع اسم الملف من الاهتمام في الجزء السفلي من لوحة على اليسار. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد المقابلة تحت عنوان &quot;حركية&quot; في الجزء العلوي من لوحة. الانتقال إلى علامة التبويب التجهيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع علامة في المربع الطرح على اليسار لفتح شاشة اختيار أجهزة الاستشعار. انقر بزر الماوس الأيمن على A4 جيدا وتغيير نوع جيد لالمرجعي حسنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع علامة في المربع بجانب محاذاة محور Y، وضمان الخطوة المحددة هي الأساس. تحديد نطاق الوقت ليكون خمسة ثانية الأخير من خط الأساس (حوالي 55-60 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع علامة في المربع للانتر خطوة تصحيح وحدد محاذاة إلى التفكك. تأكد من أن مربع Savitzky-غولي تصفية يتم التحقق ثم اضغط على &quot;عملية بيانات! ̶1؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى علامة التبويب تحليل. تأكد من أن &quot;جمعية والتفكك&quot; هو اختيار لاتخاذ خطوات لتحليل وأن هذا النموذج هو 1: 1. حدد المحلي، وصالح كامل واضغط على &quot;المنحنيات صالح!&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليط الضوء على جميع المنحنيات في الجدول وانقر بزر الماوس الأيمن لتعيين كافة منحنيات إلى لون واحد. بعد ذلك، حدد (كامل) صالح العالمية، التي تم تجميعها حسب اللون وRmax غير المرتبطة كتبها الاستشعار. اضغط على &quot;المنحنيات صالح!&quot; للحصول على بيانات حركية العالمية. </li></ol></li></ol> 5. على حبة الكشف عن BNT-II وrcHRP-II مع IR1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل لكل منهما من 1 ميكرومتر حل BNT-II وrcHRP-II في HBS مع توين (HBST؛ HBS مع توين 20 0.025٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متسلسل تمييع كل من البروتين بمقدار النصف في HBST إلى التركيز النهائي من 15.6 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في ثلاث نسخ، إلى بيضاء لوحة 96-جيدا، مع التخفيفات في أمر من أدنى إلى أعلى تركيز أسفل العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 10 ميكرولتر من 50 ميكرومتر ني (II) NTA الجسيمات المغناطيسية الاغاروز في كل تخفيف جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على جزيئات مغناطيسية بعد كل pipetting للضمان البقاء الجسيمات العالقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على لوحة شاكر لمدة 15 دقيقة لاحتضان العينات مع الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذه الفترة الحضانة، ووضع لوحة على 96-جيدا لوحة المغناطيس والانتظار 30 ثانية للجسيمات لتنسحب من الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية، وسحب قبالة العينة الأصلية وتجاهل كنفايات. إزالة لوحة من المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من HBST إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. ضخ عازلة صعودا وهبوطا عدة مرات لغسل الجزيئات المغناطيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة العودة إلى المغناطيس والانتظار 30 ثانية للجسيمات لتنسحب من الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية، وسحب قبالة 200 ميكرولتر من العازلة وتجاهل كنفايات. إزالة لوحة من المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.8 ماراح 5.10 مرتين لإكمال ثلاث غسلات للجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من HBST إلى كل الجسيمات المغناطيسية التي تحتوي جيدا تليها 2.5 ميكرولتر من 2 ملي IR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجسيمات مع IR1 على شاكر لوحة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، وقراءة كثافة الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 365 نانومتر) باستخدام قارئ لوحة 96-جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الصك وفتح برنامج قارئ لوحة لإنشاء تجربة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين تجربة جديدة لقراءة نقطة النهاية مضان مع الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 510 نانومتر. تعيين عرض الشق لكل من الأطوال الموجية إلى 9 نانومتر، مع البصريات في المرتبة الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحة وتصدير البيانات لتحليلها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى اضحة وحة 96 جيدا وصورة المعايرة باستخدام نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية. </li></ol>

<ol>
	<li>Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+Care+Diagnostics:+Status+and+Future.">Point of Care Diagnostics: Status and Future.</a> Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+tracking+fluorescence+microscopy+in+mitochondria+reveals+highly+dynamic+but+confined+movement+of+Tom40.">Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40.</a> Scientific Reports. 1, (2011).</li><li>Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Biosensors+and+Microarrays.">DNA Biosensors and Microarrays.</a> Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).</li><li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Lighting+up+cells:+labelling+proteins+with+fluorophores.">Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+protein+detection+using+enzyme-labeled+gold+nanoparticle+probes.">Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes.</a> Analyst. 135, 327-331 (2010).</li><li>Almeida, M., Carabineiro, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+nanogold+in+human+tropical+diseases:+research,+detection+and+therapy.">The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy.</a> Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).</li><li>Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Trends+in+the+Use+of+Transition+Metal&#8211;Ligand+Complexes+for+Applications+in+Electroluminescent+Devices.">New Trends in the Use of Transition Metal&#8211;Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices.</a> Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).</li><li>Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+centered+ligand+field+excited+states:+Their+roles+in+the+design+and+performance+of+transition+metal+based+photochemical+molecular+devices.">Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices.</a> Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).</li><li>Lamansky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Phosphorescent+Bis-Cyclometalated+Iridium+Complexes:+Synthesis,+Photophysical+Characterization,+and+Use+in+Organic+Light+Emitting+Diodes.">Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).</li><li>Ho, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+structure+and+oxygen-sensing+properties+of+Iridium(iii)-containing+coordination+polymers+with+different+cations.">Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations.</a> Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).</li><li>McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclometalated+Iridium(III)+Aquo+Complexes:+Efficient+and+Tunable+Catalysts+for+the+Homogeneous+Oxidation+of+Water.">Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).</li><li>Ma, D. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Selective+Luminescent+Switch-On+Probe+for+Histidine/Histidine-Rich+Proteins+and+Its+Application+in+Protein+Staining.">A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).</li><li>Ma, D. -. L., He, H. -. Z., Leung, K. -. H., Chan, D. S. -. H., Leung, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Luminescent+Transition-Metal+Complexes+for+Biomedical+Applications.">Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).</li><li>Leung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Metal-Based+Inhibitor+of+Tumor+Necrosis+Factor-&#945;.">A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-&#945;.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).</li><li>You, Y., Nam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photofunctional+triplet+excited+states+of+cyclometalated+Ir(iii)+complexes:+beyond+electroluminescence.">Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence.</a> Chemical Society Reviews. 41 (21), 7061-7084 (2012).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Iridium(III)+Complexes+with+Tunable+Emission+Color+as+Phosphorescent+Dyes+for+Live+Cell+Imaging.">Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging.</a> Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonemissive+Iridium(III)+Complex+That+Specifically+Lights-Up+the+Nuclei+of+Living+Cells.">A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).</li><li>Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine-rich+glycoprotein:+A+novel+adaptor+protein+in+plasma+that+modulates+the+immune,+vascular+and+coagulation+systems.">Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems.</a> Immunology, &amp; Cell Biology. 83, 106-118 (2005).</li><li>Panton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+an+unusual+protein+of+Plasmodium+falciparum:+histidine-rich+protein+II.">Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).</li><li>Schneider, E. L., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+Binding+to+the+Histidine-Rich+Protein+II+from+Plasmodium+falciparum.">Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum.</a> Biochemistry. 44, 979-986 (2004).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropical+infectious+diseases:+Diagnostics+for+the+Developing+World.">Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).</li><li>Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Antigenic+Peptides+of+Histidine-Rich+Protein+II+of+Plasmodium+falciparum:+Dendrimeric+Biomineralization+Templates.">Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).</li><li>Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterizations+of+cyclometalated+iridium(III)+solvento+complexes.">Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes.</a> Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).</li><li>Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Resource+Method+for+Extracting+the+Malarial+Biomarker+Histidine-Rich+Protein+II+To+Enhance+Diagnostic+Test+Performance.">Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance.</a> Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).</li><li>Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drivers+of+biodiagnostic+development.">Drivers of biodiagnostic development.</a> Nature. 462, 461-464 (2009).</li><li>Li, M. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium(iii)+complex+for+determination+of+antibiotics.">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

كأدوات القائم على microparticle التشخيص تأتي في طليعة التكنولوجيا التشخيصية الحديثة، والكشف عن الجزيئات الحيوية الهدف مباشرة على سطح الجسيمات هو ميزة كبيرة. طرق الكشف الجزيئي التقليدية، مثل ELISA وPCR، هي مفيدة، لأنها يمكن أن تحقق حدود منخفضة جدا من الكشف عن 25. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات تتطلب الكواشف واسعة والبروتوكولات طويلة. وقد صمم هذا الاختبار لتقليد ELISA من نوع التفاعلات شطيرة دون الوقت ومتطلبات كاشف (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، تم تقدير تكلفة التحقيق IR1 لكل عينة لتكون حول فلسا واحدا، في حين أن تكلفة الأجسام المضادة لELISA نموذجي هو 0،20-0،30 دولار للعينة. منذ الأساليب المذكورة أعلاه تعتمد على التحقيق إيريديوم cyclometalated للكشف عن العلامات البيولوجية الملاريا، فإن هذا التحقيق لا تكون عرضة للفشل وسائط مشتركة لطرق الكشف الأخرى (أي. quenchi fluorophoreنانوغرام وتدهور الأجسام المضادة / انزيم). الحامض الاميني هي فريدة من نوعها في المعادن ملزمة خصائصه. العمل الموضح يستفيد من هذه الظاهرة عن طريق استبدال الأجسام المضادة في شطيرة ELISA نموذجي مع المجمعات المعادن التي تحتوي على. ني (II) NTA يلتقط rcHRP-II على سطح الجسيم وIR1 يشير إلى وجود البروتين. الخطوة الأكثر أهمية في مقايسة هو السماح للجزيئات مغناطيسية لخلط مع العينة والتحقيق. في 96-جيدا لوحة ELISA، والجزيئات الحيوية والكواشف إلى حالة توازن مع سطح ثنائي الأبعاد من قاع البئر. الجسيمات المغناطيسية لديهم ميل إلى تسوية من حل بهم بسبب كثافة النواة أكسيد الحديد، والتي من شأنها أن تقلل من مواقع الربط المتاحة. وبالتالي، يجب أن تكون مختلطة الجسيمات خلال فترة الاختبار لضمان الربط القصوى. عند تصميم كاشف لتشخيص المرض، لا بد من أن نأخذ في الاعتبار شكل عينة المرضى وكذلك التركيز الفسيولوجي من العلامات البيولوجية. إلىالملاريا، وتركيز الجبهة الوطنية HRP-II في دم المريض يمكن أن تختلف من بيكو مولي منخفضة لnanomolar عالية. في حين أن هذا الاختبار هو ذات الصلة سريريا لتحقيق مستويات أعلى من العدوى، والحد من الكشف يحتاج إلى تحسين من أجل الكشف عن المرضى الذين يعانون أعراض مع انخفاض بيكو مولي المتداولة الجبهة الوطنية HRP-II. في الأساليب المذكورة أعلاه، فإن &quot;التبديل على&quot; إشارة الناتجة عن IR1 يحدث في وجود الحامض الاميني. في حين أن العلامات البيولوجية ملاريا غنية في الحامض الاميني، بروتينات مصل أخرى، مثل ألبومين المصل البشري والحامض الاميني بروتين سكري غنية، من شأنه أن يثير استجابة إشارة مع التحقيق. سيكون هذا بدوره يؤدي إلى تشخيص إيجابية كاذبة. وهذا يجعل من القبض على البروتين على سطح الجسيمات خطوة مفيدة في هذا البروتين من الفائدة يمكن استخراجها بسرعة من عينة المرضى. بالإضافة إلى ذلك، تصميم المسبار bifunctional، أن الأزواج على الحامض الاميني الببتيد الغنية إلى عنصر الاعتراف الجزيئي القوي (أي. aptamer)، يمكن إضافة طبقة أخرى من خصوصية للفحص. ان الببتيد تكون محملة الايريديوم قبل اقتران إلى aptamer. في مثل هذا التصميم، ويمكن للIR1 التحقيق مستقرة لا تزال تستخدم في حين تحقيق خصوصية الهدف مع aptamer. هذا من شأنه أن يسمح للتطبيق لجنة التحقيق للكشف عن الأصلي HRP-II في مصفوفة معقدة (أي البلازما أو الدم الكامل) والحد من الآثار غير الملزمة محددة. من أجل زيادة تعزيز إشارة من الاختبارات التشخيصية السريعة، ويمكن إدراج الفحص في نظام electrochemiluminescent (ECL)، حيث يمكن الكشف عن الجبهة الوطنية HRP-II على أفرقة المديرين الإقليميين كما قراءات الكهروكيميائية 26. وهذا من شأنه المقبل التحقيق الجيل الايريديوم يعزز إلى حد كبير لدينا ELISA مقايسة على حبة للكشف عن المؤشرات الحيوية المرض.

وضع العلامات اللونية والفلورسنت هو وسيلة هامة للكشف وتتبع من الجزيئات الكيميائية الحيوية والعمليات 1،2. علامات الفلورسنت الأكثر شيوعا هي منخفضة الوزن الجزيئي الأصباغ العضوية 3،4، ولكن هذه الجزيئات لا تملك دائما الخصائص البصرية مثالية. الأصباغ الفلورية عرضة للphotobleaching من، غالبا ما يكون التحولات ستوكس صغيرة، وربما متداخلة الإثارة والأطياف الانبعاثات. وكثيرا ما يتم وضع العلامات اللونية من خلال استخدام بطاقات الأنزيمية، والتي لها إشارة تضخيم مفيدة في المناعه الكمي 5،6. تتمتع هذه الانزيمات أيضا سلبياتها، بما في ذلك حساسية للضوء، وظروف التفاعل، والركيزة قصيرة الصلاحية. هذه الخصائص تميل إلى تتطلب المناعية وطرق وضع العلامات البروتين الذي يتعين القيام به في ظل الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد باستخدام الكواشف مكلفة. تم استكشافها المجمعات الانتقال المعادن انبعاثاتها كنهج بديل العلامات FOص كشف الكيمياء الحيوية. على وجه الخصوص، cyclometalated عير (III) وقد درس في سياق ضوء الثنائيات العضوية (شاشات OLED) 7-9 الأوكسجين الاستشعار 10، 11 الحفز، وبروتين / خلية تلطيخ 12-14. صمود عالية وكفاءة الكم جعل هذه الفئة من تحقيقات مرشحا جيدا للكشف عن جزيء حيوي 15،16. وجد سابقا أن cyclometalated عير (III) المجمعات، النموذج [عير (C ^ N) 2 (يذاب) 2] +، ربط بشكل لا رجعة فيه الحامض الاميني واستثارة رد فعل إشارة الأخضر والأزرق 12،17. هذه المجمعات هي غير انبعاثاتها في ولاية solvento، ولكن عندما نزوح الحامض الاميني جزيئات المذيب وبربط مركز معدنية، يطلقون إشارة الفسفورية مكثفة بعد التشعيع موجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية. هذه الإشارة يحدث إلا بعد استبدال يجند، ونتيجة لالإلكترون دولة الثلاثي الاسترخاء للدولة أرض الواقع من خلال تفعيل المعادن نقل المسؤول يجند (3 ML<html> CT) ويجند تركزت نقل (3 LC) مسارات 8،15. يمكن أن يحتمل هذه المجمعات استخدامها تحقيقات الكشف عن البروتينات الحامض الاميني الغنية. البروتينات الحامض الاميني الغنية ومستويات تنظيمها مهمة في كثير من الأمراض، بما في ذلك تليف الكبد، والسرطان، واضطرابات thrombic 18 المتصورة المنجلية الحامض الأميني غني البروتين II (pfHRP-II) على وجه الخصوص هو التحقق من صحة العلامات البيولوجية جيدا للعدوى طفيل الملاريا. هذا البروتين هو 67 كيلو دالتون ويحتوي على 34٪ الحامض الاميني، معظمها داخل مميزة AHHAHHAAD تكرار الزخارف 19. ويمكن لهذه يكرر الحامض الاميني ربط أيونات معدنية مجانا 19 و 20 الهيم مجمعات في الدم المضيف. تم الكشف عن pfHRP-II عادة في البيئات المنخفضة الموارد باستخدام الاختبارات التشخيصية السريعة المناعي (أفرقة المديرين الإقليميين)، ولكن هذه الاختبارات غالبا ما تكون غير دقيقة بسبب ظروف العينة، وانخفاض تركيز العلامات البيولوجية، معايير التصنيع الفقيرة، وتدهور الأجسام المضادة 21. &quot;jove_content&quot;&gt; تحقيقات الفسفورية القائم على المعادن مثل عير cyclometalated (III) المجمعات المذكورة أعلاه هي خيارات جذابة للكشف عن pfHRP-II بسبب من انتقائية ملزمة من الحامض الاميني ومستقر وانبعاث كفاءة ممتلكاتهم. في هذه الورقة، واستخدام [عير (PPY) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) للكشف عن BNT-II، وهو تقليد الببتيد متفرعة من pfHRP-II هو استكشاف 22. تم رصد حركية هذا التفاعل في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات biolayer التداخل. وقد تم تكييف فحص أيضا إلى تنسيق ELISA نوع على حبة، حيث تحققت حدود nanomolar من الكشف. هذا الاختبار يحمل من المزايا أكثر من ELISAs التقليدية لأنها لا يمكن أن يؤديها في اقل من 2 ساعة مع الكواشف خالية من الأجسام المضادة، بدلا من ساعة 4-5 والكواشف الحيوية المطلوبة مع ELISAs نموذجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

ويعرض هذا العمل على توليف الخالية من الانبعاثات، cyclometalated عير (III) المجمع، عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (IR1)، الذي يتسبب سريعة، المعمرة إشارة الفسفورية عندما منسقة لhistidine- تحتوي على البروتين ثبتوا على سطح الجسيمات المغناطيسية. توليف IR1، في عوائد عالية، هو O كاملة / N وينطوي على تقسيم الوالد cyclometalated عير (III) ديمر-سد كلورو إلى قسمين حكمه من مجمع الإذابة بالإكترونات. لتأكيد خصوصية، تم بحث العديد من الأحماض الأمينية لنشاط التنسيق عند إضافتها إلى التحقيق توليفها، والحامض الاميني الوحيد إلى استجابة الإشارة. استخدام BNT-II، وهو تقليد الببتيد متفرعة من العلامات البيولوجية للملاريا البروتين الحامض الأميني ريتش II (pfHRP-II)، والتحقق من صحة التحقيق الايريديوم كأداة للكشف عن HRP-II. وقد لوحظت آثار التبريد في المعايرة BNT-II / IR1 بالمقارنة مع الحامض الأميني L-/ IR1، ولكن نسبت هذه إلى عائق الفراغية وثلاثيPLET التبريد الدولة. وقد استخدم Biolayer التداخل لتحديد حركية في الوقت الحقيقي من تفاعل IR1 مع BNT-II. مرة واحدة وكان محسن النظام، تم العثور على الحد من الكشف عن rcHRP-II باستخدام مسبار لتكون 12.8 نانومتر في الحل. عندما يجمد هذا البروتين على سطح 50 ميكرون المغناطيسي الجسيمات الاغاروز، كان الحد من الكشف 14.5 نانومتر. استجابة قوية إشارة من هذا التحقيق غير العضوية، فضلا عن المرونة استخدامه في حل أو يجمد على السطح، ويمكن ان تقدم نفسها تجاه مجموعة متنوعة من التطبيقات، من استخدام التشخيص التصوير.

كما هو مبين في الشكل رقم 1، والتوليف من IR1 solvento معقد تقسيم تشارك الجسر الكلوريد في ديمر الأم ترسيب كلوريد في شكل غير قابل للذوبان أجكل وتكوين الجمعيات من جزيئات الماء إلى مركز المعدن. وأكد تشكيل IR1 التي كتبها H 1 NMR وESI. بالإضافة إلى ذلك، تم تعيين نطاقات الأشعة فوق البنفسجية مرئية المميزة ليجند المعادن نقل المسؤول وπ-π التحولات * لطيف، كذلك التحقق من صحة تشكيل IR1. هذه الإذابة بالإكترونات المعارض معقدة أي حرف انبعاثاتها عندما متحمس في 365 نانومتر. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> الشكل 1: تحضير وتوصيف IR1 رد فعل جسر كلوريد تقسيم Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) فينيل) diiridium (III) لإنشاء مجمع aquo عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 </فرعية&gt; + (IR1). عند إضافة L-بلده في مجمع aquo في المخزن المائي، يتم تشغيل إشارة الانارة جرا. مرة واحدة تم تصنيعه معقدة وتميزت، تم تحليل الانتقائية الأحماض الأمينية، كما هو موضح سابقا باستخدام الايريديوم التناظرية مماثلة (17). ويبين الشكل 2A أن الحامض الاميني الوحيد إلى استجابة إشارة في 510 نانومتر، عندما متحمس في 365 نانومتر. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> الشكل 2: الأحماض الأمينية الانتقائية والمعايرة من IR1 مع الحامض الأميني ريتش الببتيدات (A) تفاعل 200 ميكرومتر من الأحماض الأمينية المختلفة (السيستئين، سر، ASP، حمض الغلوتاميك، الفنيل ألانين، ليس، الارجنتين، صور، التربتوفان، صاحب) مع 50 ميكرومتر. IR1 في HBS. اتخذت بالاشعة الطيفية 400-700 نانومتر في الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر في السوداء 96 لوحة جيدا. إشارة في وحدات مضان النسبي (RFU) من جميع الأحماض الأمينية بكان esides الحامض الاميني (متقطع أثر أسود) يكاد يذكر. ومعاير تركيزات (B) Nanomolar من BNT-II (▪) وrcHRP-II (♦) مع IR1 في HBS. وحضنت الببتيدات الغنية الحامض الاميني مع لجنة التحقيق لمدة 15 دقيقة في محلول قبل قراءة الانبعاثات في 510 نانومتر بعد الإثارة مع 365 ضوء نانومتر. تم احتساب الحد من الكشف حيث بلغت قيمة س عندما ص = 3σ فارغة. هذا &quot;التبديل على&quot; من تفسفر لجنة التحقيق الايريديوم يحدث لأن الدولة متحمس القميص (1 MLCT / 1 LC) من عير (III) bioconjugate يخضع معبر intersystem إلى الثلاثي متحمس للدولة (3 MLCT)، عندما يتم تنسيق الحامض الاميني إلى مركز المعدن. تم تطبيق هذا التحقيق إلى BNT-II الببتيد تقليد من العلامات البيولوجية الملاريا المنجلية البروتين الحامض الأميني ريتش II (الجبهة الوطنية HRP-II). في المعايرة من BNT-II مع IR1، لوحظ وجود تركيز استجابة إشارة تعتمد ( <stronز&gt; الشكل 2B). المؤتلف HRP-II (rcHRP-II) عرضت أيضا استجابة مماثلة في الحل. وكانت حدود الكشف عن BNT-II وrcHRP-II في حل 54.8 نانومتر و 12.8 نانومتر، على التوالي. باستخدام تقنيات biolayer التداخل، ثبتوا على K D من IR1 ملزمة لBNT-II على سطح النيكل (II) NTA وجدت لتكون 2.05 ميكرومتر (الشكل 3). <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> الرقم 3: في الوقت الحقيقي تحليل الحركية من IR1 مع BNT-II Biolayer التداخل للتحليل الحركي تركيزات مختلفة من IR1 ملزمة لBNT-II على سطح النيكل (II) NTA استشعار الزجاج. بعد توازنه أجهزة الاستشعار في KB (منطقة A)، يتم تحميل أجهزة الاستشعار مع 0.5 ميكرومتر BNT-II (المنطقة B). بمجرد أن يتم تحميل الببتيد على أجهزة الاستشعار، ويتم تأسيس خط الأساس (منطقة C) قبل قياس جمعية IR1 إلى BNT-II (منطقة D). بعدفترة تكوين الجمعيات، يتم وضع أجهزة استشعار العودة الى KB لقياس تفارق (منطقة E). عملية تحليل الحركية كلها تستغرق أقل من 30 دقيقة. عند الانتقال من مقايسة على أساس حل لمنصة الجسيمات المغناطيسية، وكان تعقيد المضافة للجسيمات في النظام يجب أن تؤخذ في الاعتبار. كان معروفا من الأعمال السابقة، أن هذه الجزيئات تربط بكفاءة الجبهة الوطنية العلامات البيولوجية الملاريا HRP-II. عملت 24 لوحات الفلورية السوداء جيدا للمقايسة حل صفنا أعلاه، ولكن كانت لوحات بيضاء أكثر ملاءمة لمنصة الكشف عن الجسيمات، كما رأينا في الشكل 4A. في لوحة بيضاء، وينعكس الضوء مرة أخرى في العينة، وبالتالي السماح لامتصاص أفضل من قبل IR1 منضمة إلى سطح الجسيمات. في مقايسة على الجسيمات، والحد من الكشف عن rcHRP-II مصممة على أن تكون 14.5 نانومتر (الشكل 4B). كان الحد من الكشف عن rcHRP-II-في الحل وعلى حبة statistically نفسه على أساس المفردة اختبار (ت) (ع = 0.731). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> الرقم 4: على حبة الكشف عن BNT-II وHRP-II (A) الفرق بين إشارة الكشف عن IR1 بد أن BNT-II على سطح 50 ميكرومتر ني الجسيمات الاغاروز (II) NTA المغناطيسي في الأسود 96- كذلك لوحة (خط الصلبة) مقابل البيضاء لوحة 96-جيدا (خط متقطع). تم متحمس الجسيمات مع 365 ضوء نانومتر، وتم قياس الانبعاثات في 510 نانومتر. (B) المعايرة من rcHRP-II ثبتوا على الجسيمات المغناطيسية والكشف عنها باستخدام IR1. تم احتساب الحد من الكشف باعتبارها زارة شؤون المحاربين القدامىLUE من س عندما ص = 3σ فارغة. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> الشكل 5: التمثيل التخطيطي للكشف على حبة من rcHRP-II مع IR1 مخطط عام لHRP-II ملزمة لسطح النيكل (II) NTA الجسيمات وصفت مع IR1. يتم تحضين الجسيمات مع الحامض الاميني الببتيد الغني لمدة 15 دقيقة. بعد هذه الفترة الحضانة، يتم غسلها جزيئات مع HBST باستخدام المغناطيس، من أجل سحب الجسيمات من الحل. وأخيرا، يتم تحضين الببتيد ملزمة الجسيمات مع IR1 لمدة 1 ساعة قبل قراءة الانبعاثات في 510 نانومتر بعد الإثارة مع 365 ضوء نانومتر.

Watch this Scientific Journal Video about IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II at JoVE.com

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

الايريديوم (III) الفلورسنت التحقيق للكشف عن البروتين ملاريا العلامات البيولوجية الحامض الأميني ريتش بروتين-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

iridiumiii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein-biomarker

Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.0K Views.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Video: IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

ابفيف تعمل مقياس التناضح نانولتر رواية للتحقيقات الجليد بروتين ملزمة

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

فحص الكمية والنوعية من التفاعلات الجسيمات الجسيمات الغروية عن طريق مسبار Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

الترسيب التوازن من البروتين غشاء صغير قليل وحدات تشكيل: تأثير الحامض الأميني إضافة بروتون على Pentameric الاستقرار

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

اختبار الألوان الموضعية كأداة افتراضية للكشف السريع عن كاثينونيس الاصطناعية

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

جمع التنفس من الأطفال لاكتشاف العلامات البيولوجية المرض

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

اعداد وتطبيق البكتيريا الجرثومية الجديدة للكشف المفترض لبقايا الطلقات النارية

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

الجانب التقني من التوليف الآلي والتقييم الحركي في الوقت الحقيقي من [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. The single-probe, a microscale sampling and ionization device, can be coupled with a mass spectrometer for on-line, rapid SCMS analysis of cellular constituents under ambient conditions. Previously, the single-probe SCMS technique was primarily used to measure cells immobilized onto a substrate, limiting the types of cells for studies. In the current study, the single-probe SCMS technology has been integrated with a cell manipulation system, typically used for in vitro fertilization. This integrated cell manipulation and analysis platform uses a cell-selection probe to capture identified individual floating cells and transfer the cells to the single-probe tip for microscale lysis, followed by immediate mass spectrometry analysis. This capture and transfer process removes the cells from the surrounding solution prior to analysis, minimizing the introduction of matrix molecules in the mass spectrometry analysis. This integrated setup is capable of SCMS analysis of targeted patient-isolated cells present in body fluids samples (e.g., urine, blood, saliva, etc.), allowing for potential applications of SCMS analysis to human medicine and disease biology.

An integrated cell manipulation platform is developed for use in conjunction with a single-probe mass spectrometry setup for the on-line analysis of individual suspension cells under ambient conditions.

منصة معالجة الخلية المتكاملة مقرونة بمسبار واحد لتحليل قياس الطيف الكتلي للأدوية والأيض في خلايا تعليق واحدة

Single cell mass spectrometry (SCMS) enables sensitive detection and accurate analysis of broad ranges of cellular species on the individual-cell level. ...