Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. סינתזה של אירידיום מורכב (III) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 53.6 מ&quot;ג (50 μmol) של [עיר (PPy) 2 -Cl] 2 ולפזר ב 5 מיליליטר של מתילן כלוריד. להוסיף את הפתרון הזה לבקבוק 50 מיליליטר Erlenmeyer מצויד בבר ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 26.2 מ&quot;ג (100 μmol) של AgOTf ולפזר ב 5 מיליליטר של מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את AgOTf המומס ל[ עיר (PPy) 2 -Cl] 2 פתרון ומערבבים במשך שעה 1. הערה: תרחיף בצבע קרם אמור לגרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לסנן את התרחיף דרך סיליקה ג&#39;ל לתוך בקבוקון DRAM 25 x 95 מ&quot;מ ולהתנדף ממס שנותר באמצעות מאייד סיבובי (5-10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שרוב הממס הוסר, לבדוק ששאריות צהובות שמנוניות נשארה בבקבוקון. לשאריות זה, להוסיף 1 מיליליטר של מתנול מחדש לפזר את המוצר וLyophilize 1-2 ימים להניב המוצר המוצק הצהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפיין את עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 + המוצר (Ir1) על ידי H &lt;sup&gt; 1 NMR (בCDCl 3), ESI ו- UV-Vis כפי שתואר לעיל. 23 </li></ol> 2. אינטראקציות של Ir1 עם חומצות אמינו שונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2 מ&quot;מ של Ir1 במתנול (MW 537.10 g / mol). מערבולת כדי להבטיח פירוק המוצק מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן של חומצות אמינו ומולקולות הביולוגיות הבאות בHEPES 100 מיקרומטר פתרונות שנאגרו מלוח (HBS, 100 מ&quot;מ HEPES, 137 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4) עלא, ASP, Cys,, איל, יס, סר, נסה, ואל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​כל חומצת אמינו 100 μl לתוך צלחת 96-גם שחורה. להוסיף של HBS 100 μl לצלחת לשמש כריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 μl של פתרון 2 מ&quot;מ Ir1 לכל דגימה ולנער את הצלחת על שייקר צלחת במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לרכוש את ספקטרום הפליטה של ​​הדגימות באמצעות קורא 96-גם צלחת (365 לשעבר / 400-700). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת במכשיר ולפתוח את תוכנת צלחת הקורא להגדיר ניסוי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את Exp החדשeriment לקרוא סריקת הקרינה עם אורך גל עירור של 365 ננומטר ורוחב חריץ של 9 ננומטר עם אופטיקה במיקום העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הפליטה 300-700 ננומטר עם גודל צעד של 5 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים לניתוח נתונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות לצלחת 96-היטב ברורה ותמונת הפליטה באמצעות transilluminator UV. </li></ol> 3. כותרות של Ir1 עם BNT-II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 מ&quot;מ מניות של BNT-II (MW 8,233.6 g / mol) בהרוורד, כמו גם פתרון 2 מ&quot;מ של Ir1 במתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפתרון המניות, להכין 1 מיליליטר של 100 מיקרומטר BNT-השני בהרוורד. מערבולת צינור microcentrifuge כדי להבטיח המדגם הוא מעורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל 100 מיקרומטר BNT-השני בחצי בHBS לריכוז סופי של 1.56 מיקרומטר BNT-השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לכל דילול 100 μl, בשלושה עותקים, עם HBS משמש כריק, לבארות של צלחת גם 96. לכל דגימה, להוסיף 2.5 μl של 2 מ&quot;מ Ir1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shמתקין את הצלחת למשך 10 דקות על שייקר צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלחץ, לקרוא את עוצמת הפליטה ב 510 ננומטר (עירור ב 365 ננומטר) באמצעות קורא צלחת 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת במכשיר ולפתוח את תוכנת צלחת הקורא להגדיר ניסוי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הניסוי החדש לקרוא נקודת סיום הקרינה עם אורך גל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​510 ננומטר. הגדר את רוחב החריץ עבור שני אורכי הגל ל9nm, עם אופטיקה במיקום העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחת ולייצא את הנתונים לניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות לצלחת 96-היטב ברורה ותמונת טיטרציה באמצעות transilluminator UV. </li></ol> 4. בזמן אמת קינטי ניתוח של מערכת Ir1 / BNT-II שימוש Biolayer Interferometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ הקינטית (KB; פוספט 1x שנאגרו מלוח עם 0.02% Tween-20) עד 8 בארות בעמודה הראשונה של צלחת 96-היטב שחורה ולהכניס את הצלחת לתוך חיישן הפלסטיקבעל. להעביר בזהירות 8 (II) חיישני נת&quot;ע Ni לעמודה הראשונה בבעל הפלסטיק כך שהטיפים מושעים בבארות של מאגר. מניחים את בעל הפלסטיק בצד השמאל של מכשיר אינטרפרומטריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מיליליטר של פתרון 0.5 מיקרומטר של BNT-השני בKB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 μl של פתרון 10 מיקרומטר של Ir1 בKB, וסדרתי לדלל בחצי עד 0.156 מיקרומטר בKB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחת חדשה 96 שחורים גם, פיפטה 200 μl של KB לכל 8 הבארות בעמודה A ו- C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה הצלחת, 200 μl פיפטה של ​​פתרון 0.5μM BNT-השני לבארות בעמודה B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 200 μl של כל דילול של Ir1 לעמודת D, החל KB כריק בD1 גם. הוסף את דילולים כך שהבארות להגדיל בריכוז Ir1 את הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת זה במכשיר בצד הימין של הצלחת המכילה חיישנים מראש הרטבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת אינטרפרומטריה biolayer, להגדיר kinet בסיסיIC ניסוי על ידי הגדרת הטיפים צלחת, assay, וחיישן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את הצלחת, בחר עמודה על המסך, לחץ לחיצה ימנית, ולבחור את ההגדרה המתאימה לבארות. בחר &quot;הצפת&quot; לעמודות ו- C, &quot;טען&quot; לעמודת B, ו- &quot;לדוגמא&quot; לטור ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את assay בכרטיסייה הבאה על ידי הוספת השלבים הבאים (לחץ על &quot;הוסף&quot;): איזון (מותאמת אישית), 60 שניות; טוען, 120 שניות; Baseline, 60 שניות; איגוד, 120 שניות; ודיסוציאציה, 300 שניות. בחר את צעד האיזון ולחץ לחיצה כפולה על חזור על עמודת A. לטעינה (העמודה B), Baseline (העמודה C), האגודה (העמודה D), ודיסוציאציה (עמודת C). בחר את חיישני Ni (II) נת&quot;ע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור ללשונית הבאה ולאשר כי החיישנים נמצאים בעמודה על בעל חיישן פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את הניסוי מתואר בצורה נכונה, להכניס את שם הקובץ, להבטיח כי &quot;ניסוי עיכוב&quot; מסומן, ו&quot; עבור. &quot;עיתונות NOTE: בשל האופי האוטומטי של המכשיר, לאחר שהניסוי הקינטית מתואר, הצעדים יתרחשו כמתוכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהקינטית הריצה תושלם, לעבד את הנתונים בתוכנת העיבוד סיפקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על התיקייה עם הקובץ של עניין בחלק התחתון של הלוח בצד השמאל. לאחר מכן, לחץ לחיצה כפולה על התיקייה המתאימה תחת &quot;קינטיקס&quot; בחלק העליון של הלוח. לעבור ללשונית העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת החיסור בצד השמאל כדי לפתוח את מסך בחירת חיישן. לחץ לחיצה הימנית על גם A4 ולשנות את הסוג גם להפניה ובכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה לצד יישור ציר Y, ​​ולהבטיח את הצעד שנבחר הוא Baseline. ציין את טווח הזמן להיות חמש שניות האחרונות של הבסיס (כ 55-60 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבה לתיקון Inter-צעד ובחר יישור לדיסוציאציה. ודא שתיבת Savitzky-Golay הסינון נבדק ותהליך העיתונות &quot;נתונים! ̶1; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור ללשונית ניתוח. ודא כי &quot;האגודה ודיסוציאציה&quot; היא הבחירה לצעדים כדי לנתח ושהדגם הוא 1: 1. בחר בכושר מקומי, מלא ולחץ &quot;Curves Fit!&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את כל הקימורים בטבלה ולחץ על זכות להגדיר את כל הקימורים לצבע אחד. בשלב הבא, בחר גלובלי בכושר (מלא), מקובצים לפי צבע וRmax לא צמוד על ידי חיישן. לחץ על &quot;Curves Fit!&quot; לקבל נתונים קינטיקה הגלובלית. </li></ol></li></ol> 5. ביום-חרוז איתור של BNT-השני וrcHRP-II עם Ir1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר כל אחד מפתרון 1 מיקרומטר של BNT-השני וrcHRP-השני בהרוורד עם Tween (HBST; HBS עם 0.025% Tween 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל כל חלבון בחצי בHBST לריכוז סופי של 15.6 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​דילול כל 100 μl, בשלושה עותקים, לצלחת 96-היטב לבנה, עם דילולים בהזמנה מנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר של עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של 50 מיקרומטר Ni (II) חלקיקים מגנטיים נת&quot;ע agarose לכל דילול גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור microcentrifuge המכיל חלקיקים המגנטיים לאחר כל pipetting כדי להבטיח את החלקיקים להישאר מושעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על שייקר צלחת במשך 15 דקות כדי לדגור דגימות עם החלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה זה, למקם את הצלחת על מגנט צלחת 96-היטב ולהמתין 30 שניות לחלקיקים לצאת מפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, למשוך את המדגם המקורי ולהשליך לפח אשפה. הסר את הצלחת מהמגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של HBST זה גם בעזרת פיפטה הרבה. לשאוב את החיץ מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשטוף את החלקיקים המגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחזרה אל המגנט ולהמתין 30 שניות לחלקיקים לצאת מפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה הרבה, למשוך את 200 μl של חיץ ולהשליך לפח אשפה. הסר את הצלחת מהמגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.8 througפעמים h 5.10 שני להשלים שלוש כביסות של החלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לHBST 100 μl לכל חלקיקים מגנטיים המכילים גם אחרי 2.5 μl של 2 מ&quot;מ Ir1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקיקים עם Ir1 על שייקר צלחת במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לקרוא את עוצמת הפליטה ב 510 ננומטר (עירור ב 365 ננומטר) באמצעות קורא צלחת 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת במכשיר ולפתוח את תוכנת צלחת הקורא להגדיר ניסוי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הניסוי החדש לקרוא נקודת סיום הקרינה עם אורך גל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​510 ננומטר. הגדר את רוחב החריץ עבור שני אורכי הגל עד 9 ננומטר, עם אופטיקה במיקום העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחת ולייצא את הנתונים לניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות לצלחת 96-היטב ברורה ותמונת טיטרציה באמצעות transilluminator UV. </li></ol>

<ol>
	<li>Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+Care+Diagnostics:+Status+and+Future.">Point of Care Diagnostics: Status and Future.</a> Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+tracking+fluorescence+microscopy+in+mitochondria+reveals+highly+dynamic+but+confined+movement+of+Tom40.">Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40.</a> Scientific Reports. 1, (2011).</li><li>Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Biosensors+and+Microarrays.">DNA Biosensors and Microarrays.</a> Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).</li><li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Lighting+up+cells:+labelling+proteins+with+fluorophores.">Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+protein+detection+using+enzyme-labeled+gold+nanoparticle+probes.">Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes.</a> Analyst. 135, 327-331 (2010).</li><li>Almeida, M., Carabineiro, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+nanogold+in+human+tropical+diseases:+research,+detection+and+therapy.">The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy.</a> Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).</li><li>Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Trends+in+the+Use+of+Transition+Metal&#8211;Ligand+Complexes+for+Applications+in+Electroluminescent+Devices.">New Trends in the Use of Transition Metal&#8211;Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices.</a> Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).</li><li>Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+centered+ligand+field+excited+states:+Their+roles+in+the+design+and+performance+of+transition+metal+based+photochemical+molecular+devices.">Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices.</a> Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).</li><li>Lamansky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Phosphorescent+Bis-Cyclometalated+Iridium+Complexes:+Synthesis,+Photophysical+Characterization,+and+Use+in+Organic+Light+Emitting+Diodes.">Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).</li><li>Ho, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+structure+and+oxygen-sensing+properties+of+Iridium(iii)-containing+coordination+polymers+with+different+cations.">Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations.</a> Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).</li><li>McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclometalated+Iridium(III)+Aquo+Complexes:+Efficient+and+Tunable+Catalysts+for+the+Homogeneous+Oxidation+of+Water.">Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).</li><li>Ma, D. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Selective+Luminescent+Switch-On+Probe+for+Histidine/Histidine-Rich+Proteins+and+Its+Application+in+Protein+Staining.">A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).</li><li>Ma, D. -. L., He, H. -. Z., Leung, K. -. H., Chan, D. S. -. H., Leung, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Luminescent+Transition-Metal+Complexes+for+Biomedical+Applications.">Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).</li><li>Leung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Metal-Based+Inhibitor+of+Tumor+Necrosis+Factor-&#945;.">A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-&#945;.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).</li><li>You, Y., Nam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photofunctional+triplet+excited+states+of+cyclometalated+Ir(iii)+complexes:+beyond+electroluminescence.">Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence.</a> Chemical Society Reviews. 41 (21), 7061-7084 (2012).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Iridium(III)+Complexes+with+Tunable+Emission+Color+as+Phosphorescent+Dyes+for+Live+Cell+Imaging.">Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging.</a> Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonemissive+Iridium(III)+Complex+That+Specifically+Lights-Up+the+Nuclei+of+Living+Cells.">A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).</li><li>Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine-rich+glycoprotein:+A+novel+adaptor+protein+in+plasma+that+modulates+the+immune,+vascular+and+coagulation+systems.">Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems.</a> Immunology, &amp; Cell Biology. 83, 106-118 (2005).</li><li>Panton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+an+unusual+protein+of+Plasmodium+falciparum:+histidine-rich+protein+II.">Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).</li><li>Schneider, E. L., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+Binding+to+the+Histidine-Rich+Protein+II+from+Plasmodium+falciparum.">Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum.</a> Biochemistry. 44, 979-986 (2004).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropical+infectious+diseases:+Diagnostics+for+the+Developing+World.">Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).</li><li>Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Antigenic+Peptides+of+Histidine-Rich+Protein+II+of+Plasmodium+falciparum:+Dendrimeric+Biomineralization+Templates.">Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).</li><li>Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterizations+of+cyclometalated+iridium(III)+solvento+complexes.">Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes.</a> Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).</li><li>Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Resource+Method+for+Extracting+the+Malarial+Biomarker+Histidine-Rich+Protein+II+To+Enhance+Diagnostic+Test+Performance.">Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance.</a> Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).</li><li>Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drivers+of+biodiagnostic+development.">Drivers of biodiagnostic development.</a> Nature. 462, 461-464 (2009).</li><li>Li, M. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium(iii)+complex+for+determination+of+antibiotics.">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ככלי אבחון מבוסס microparticle הגיעו לחזית טכנולוגית אבחון המודרנית, זיהוי של מולקולות ביולוגיות יעד ישירות על פני השטח של החלקיקים הוא יתרון גדול. שיטות מסורתיות מולקולריות זיהוי, כגון ELISA וPCR, הן יתרון, בכך שהם יכולים להשיג גבולות נמוכים מאוד של זיהוי 25. עם זאת, מבחני אלה דורשים חומרים כימיים נרחבים ופרוטוקולים ארוכים. assay זה נועד לחקות אינטראקציות כריך ELISA-סוג ללא הזמן ודרישות מגיב (איור 5). בנוסף, עלות הבדיקה Ir1 לדגימה הייתה מוערכת להיות סביב אגורה, ואילו העלות של נוגדנים לELISA טיפוסי היא .20-.30 $ למדגם. מאז השיטות שתוארו לעיל מסתמכות על בדיקה אירידיום cyclometalated לגילוי של הסמן ביולוגי המלריה, בדיקה זו לא תהיה רגישה למצבי כישלון משותפים לשיטות זיהוי אחרות (כלומר. Quenchi fluorophoreng והשפלה נוגדן / אנזים). היסטידין הוא ייחודי בתכונות מחייבות המתכת שלה. העבודה המתוארת מנצלת תופעה זו על ידי החלפת הנוגדנים בכריך ELISA טיפוסי עם מתחמים המכילים מתכת. Ni (II) נת&quot;ע לוכד rcHRP-II על פני השטח של החלקיקים וIr1 מסמן את הנוכחות של החלבון. השלב הקריטי ביותר בassay מאפשר חלקיקים המגנטיים לערבב עם המדגם והבדיקה. בצלחת ELISA 96-היטב, מולקולות ביולוגיות וחומרים כימיים להגיע לשיווי משקל עם המשטח דו ממדים של תחתית הבאר. יש חלקיקים מגנטיים הנטייה להתיישב מחוץ לפתרון בשל הליבה שלהם הצפופה תחמוצת ברזל, שתפחית את אתרי קישור הזמינים. כך, החלקיקים חייבים להיות מעורבים בזמן assay כדי להבטיח מקסימאלי מחייב. בעת תכנון מגיב לאבחון מחלה, יש לזכור צורה של מדגם מטופל, כמו גם את הריכוז הפיזיולוגי של הסמן הביולוגי. למלריה, הריכוז של PF HRP-השני בדם של חולה יכול להשתנות מpicomolar הנמוך עד גבוה של ננו-מולר. בעוד assay זה רלוונטי מבחינה קלינית לרמות גבוהות יותר של זיהום, המגבלה של זיהוי צריכה להיות משופרת על מנת לזהות חולים ללא תסמינים עם picomolar הנמוך במחזור PF HRP-השני. בשיטות שתוארו לעיל, &quot;לעבור על&quot; אות שנוצרה על ידי Ir1 מתרחשת בנוכחות של היסטידין. בעוד הסמן הביולוגי המלריה הוא עשיר בהיסטידין, חלבונים בסרום אחרים, כגון אלבומין בסרום אדם וגליקופרוטאין העשיר היסטידין, היו לעורר תגובת אות עם החללית. זה היה בתורו יוביל לאבחון חיובי שגוי. זה הופך את לכידתו של החלבון על פני השטח של חלקיקי צעד מועיל, שבחלבון של עניין ניתן לחלץ במהירות ממדגם מטופל. בנוסף, עיצוב חללית bifunctional, שזוגות פפטיד העשיר היסטידין לאלמנט הכרה מולקולרית חזק (כלומר. Aptamer), יכול להוסיף שכבה נוספת של סגוליות לassay. הפפטיד יהיה עמוס אירידיום לפני הצימוד לaptamer. בעיצוב כזה, הבדיקה Ir1 היציבה עדיין יכולה להיות מנוצלת תוך השגת היעד ספציפי עם aptamer. זה היה מאפשר ליישום של החללית כדי לזהות HRP-השני ילידים במטריצה ​​מורכבת (כלומר. פלזמה או כל דם) ולהפחית את תופעות מחייבות שאינם ספציפיות. על מנת לשפר את האות של בדיקות אבחון מהירות יותר, assay יכול להיות משולב בתוך מערכת electrochemiluminescent (ECL), שבו ניתן לאתר PF HRP-השני בRDTs כקריאת נתונים אלקטרוכימיים 26. הבדיקה אירידיום הדור הבאה זה יהיה מאוד לשפר assay ELISA שלנו על-חרוז לגילוי של סמנים ביולוגיים למחלות.

תיוג colorimetric וניאון הוא שיטה חשובה לזיהוי והמעקב של מולקולות ביוכימיים ותהליכי 1,2. סמני הניאון הנפוצים ביותר הם צבעי משקל מולקולרי נמוכים אורגניים 3,4, אבל לא תמיד יש מולקולות אלה תכונות אופטיות אידיאלית. צבעי ניאון נוטים photobleaching, לעתים קרובות יש משמרות סטוקס קטנות, וייתכן שיש לי עירור חופף וספקטרום פליטה. תיוג colorimetric מושגת לעתים קרובות על ידי השימוש בתוויות האנזימטית, שיש לי אות מוגברת שימושית ב5,6 כימות immunoassay. אנזימים אלה יש גם החסרונות שלהם, כוללים רגישות, תנאי תגובה, וחיי מדף קצר מצע. מאפיינים אלה נוטים לדרוש immunoassays ושיטות תיוג חלבון צריך להיעשות בתנאים מבוקרים היטב באמצעות ריאגנטים יקרים. מתחמי מעבר מתכת emissive נחקרו כגישה תיוג חלופית FOr זיהוי ביוכימיים. בפרט, cyclometalated עיר (III) נחקר בהקשר של דיודות אורגניות פולט אור (OLEDs) 7-9 חמצן חישת 10, קטליזה 11, וחלבון / תא מכתים 12-14. בצילום גבוה ויעילות קוונטית לעשות סוג כזה של בדיקות מועמד טוב לזיהוי biomolecule 15,16. נמצא בעבר כי cyclometalated עיר (III) מתחמים, של הצורה [עיר (C ^ N) 2 (solv) 2] +, באופן בלתי הפיך להיקשר היסטידין ולעורר תגובת אות כחולה-ירוקה 12,17. מתחמים אלה שאינם emissive במדינת solvento, אבל כאשר היסטידין מחליף את מולקולות ממס ונקשר למרכז המתכת, הם משחררים אות זרחנית עזה לאחר קרינת UV גל ארוך. אות זו מתרחשת רק לאחר החלפת יגנד, והוא התוצאה של אלקטרון מדינת שלישייה המרגיע למדינת הקרקע באמצעות ההפעלה של העברת מטען ליגנד מתכת (3 מ&quot;ל<html> CT) והעברה ליגנד מרוכז (3 LC) מסלולי 8,15. מתחמים אלה עלולים לשמש כבדיקות לגילוי חלבוני היסטידין עשיר. חלבוני היסטידין עשיר ורמות הרגולציה שלהם הם חשובים במחלות רבות, לרבות שחמת כבד, סרטן, והפרעות thrombic. 18 חלבון Plasmodium falciparum היסטידין העשיר השני (pfHRP-II) בפרט הוא סמן ביולוגי תוקף היטב לזיהום טפיל מלריה. חלבון זה הוא 67 kDa ומכיל 34% היסטידין, בעיקר במוטיבי AHHAHHAAD חוזר מאפיין 19. חוזר היסטידין אלה יכולים להיקשר יונים חופשי מתכת 19 וheme קומפלקסי 20 בדם מארח. pfHRP-השני מזוהה בדרך כלל בהגדרות נמוך משאב באמצעות בדיקות immunochromatographic מהירות אבחון (RDTs), אבל בדיקות אלה הן לעתים קרובות לא מדויקות בשל תנאי מדגם, ריכוז סמן ביולוגי נמוך, תקני ייצור עניים, והשפלה נוגדן 21. &quot;Jove_content&quot;&gt; בדיקות זרחניות מבוסס מתכת כגון עיר cyclometalated (III) מתחמים שתוארו לעיל הם אפשרויות אטרקטיביות לגילוי pfHRP-השני בשל כריכתם סלקטיבית של היסטידין ומאפייני סטאבילה ופליטה היעילה שלהם. במאמר זה, השימוש ב[ עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) כדי לזהות BNT-השני, לחקות פפטיד קנים של pfHRP-II הוא חקר 22. קינטיקה של אינטראקציה זו הייתה במעקב בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אינטרפרומטריה biolayer. Assay גם מותאם לפורמט ELISA-סוג על-חרוז, שבו גבולות של ננו-מולר של זיהוי הושגו. assay זה מחזיק יתרונות על פני ELISAs המסורתי כי זה יכול להתבצע בתחת 2 שעות עם חומרים כימיים ללא נוגדנים, במקום שעות 4-5 וריאגנטים ביולוגיים הנדרשים עם ELISAs הטיפוסי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

עבודה זו מתארת ​​את הסינתזה של אי emissive, cyclometalated עיר (III) מורכב, עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), אשר מעורר אות מהירה, חיים ארוכים זרחנית כאשר מתואם לhistidine- מכיל חלבון משותק על פני השטח של חלקיקים מגנטיים. סינתזה של Ir1, בתשואות גבוהות, היא O מלא / N וכרוך פיצול של ההורה cyclometalated עיר (III) דימר-כלורו גישור לשני שווה של מתחם solvated. כדי לאשר סגוליות, כמה חומצות אמינו נבדקו לפעילות תיאום כאשר הוסיפו לבדיקה המסונתזת, והיסטידין רק עורר תגובת אות. באמצעות BNT-השני, לחקות פפטיד קנים של הסמן הביולוגי המלריה חלבון היסטידין העשיר השני (pfHRP-II), הבדיקה אירידיום קבלה תוקף ככלי לזיהוי HRP-השני. השפעות מרווה נרשמו בטיטרציה BNT-II / Ir1 בהשוואה לL-היסטידין / Ir1, אבל אלה יוחסו למכשול ותלת הסטריplet מרווה מדינה. Biolayer אינטרפרומטריה שימשה כדי לקבוע קינטיקה של אינטראקציה של Ir1 עם BNT-השני בזמן אמת. ברגע שהמערכת הייתה מותאמת, המגבלה של זיהוי של rcHRP-השני באמצעות הבדיקה נמצאה כי 12.8 ננומטר בפתרון. כאשר חלבון זה היה משותק על פני השטח של חלקיקים מגנטיים agarose 50 מיקרומטר, המגבלה של זיהוי הייתה 14.5 ננומטר. התגובה החזקה של אות בדיקה אורגנית זה, כמו גם גמישותה של שימוש בפתרון או משותק על פני השטח, יכולה להשאיל את עצמו לכיוון מגוון רחב של יישומים, משימוש אבחון להדמיה.

כפי שניתן לראות באיור 1, הסינתזה של קומפלקס solvento הפיצול המעורב Ir1 של גשר כלוריד בדימר ההורה על ידי משקעים של כלוריד בצורה של AgCl מסיס ועמותה של מולקולות מים למרכז המתכת. ההיווצרות של Ir1 אושרה על ידי H 1 NMR וESI. בנוסף, להקות UV לעין אופייניות להעברת מטען ליגנד המתכת וπ π-מעברים * חולקו לקשת, אימות היווצרות Ir1 נוספת. זה solvated מוצגים מורכבים לא אופי emissive כאשר נרגש ב365 ננומטר. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> איור 1:. סינתזה ואפיון של Ir1 תגובת פיצול גשר כלוריד של Dichlorotetrakis (2 (2-pyridinyl) פניל) diiridium (III) ליצירה מורכבת aquo עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 </תת&gt; + (Ir1). עם התוספת של L-למתחם aquo במאגר המימי, אות ניאון מופעל. ברגע שמורכב היה מסונתז ומאופיין, הסלקטיביות חומצת אמינו נותחה, כפי שתוארה לעיל באמצעות אנלוגי אירידיום דומה 17. איור 2A מראה כי היסטידין רק עורר תגובת אות ב 510 ננומטר, כאשר נרגש ב365 ננומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> איור 2: חומצת אמינו הסלקטיביות וכותרות של Ir1 עם פפטידים עשירים היסטידין () אינטראקציה של 200 מיקרומטר של חומצות אמינו שונות (Cys, סר, ASP, Glu, Phe, יס, Arg, Tyr, TRP,) עם 50 מיקרומטר. Ir1 בHBS. סריקות רפאים נלקחו מ400-700 ננומטר בגל עירור של 365 ננומטר בצלחת גם שחורה 96. אות ביחידות הקרינה היחסית (RFU) מכל חומצות אמינו בהיסטידין esides (זכר שחור מקווקו) היה זניח. הריכוזים (B) של ננו-מולר של BNT-II (▪) וrcHRP-II (♦) היו טיטרציה עם Ir1 בHBS. פפטידים העשירים היסטידין הודגרו עם החללית במשך 15 דקות בתמיסה לפני קריאת הפליטה ב 510 ננומטר לאחר עירור עם 365 ננומטר אור. גבול של זיהוי חושב כערך של x כאשר y = ריק 3σ. זה &quot;מתג על-&quot; של הזרחני של חללית אירידיום מתרחש משום שמדינת הגופייה הנרגשת (MLCT / LC 1 1) לעיר (III) bioconjugate עוברת מעבר intersystem למדינה מתרגשת השלישייה (3 MLCT), כאשר היסטידין מתואם למרכז המתכת. בדיקה זו הייתה מוחלת על BNT-השני פפטיד חקיין של הסמן הביולוגי המלריה חלבון Plasmodium falciparum היסטידין העשיר השני (PF HRP-השני). בטיטרציה של BNT-II עם Ir1, תגובת אות תלויה ריכוז נצפתה ( <stronז&gt; איור 2). HRP-השני רקומביננטי (rcHRP-II) הציג גם תגובה דומה בפתרון. גבולות זיהוי של BNT-השני וrcHRP-השני בפתרון היו 54.8 ננומטר ו12.8 ננומטר, בהתאמה. באמצעות שימוש בטכניקות אינטרפרומטריה biolayer, K D של Ir1 מחייב BNT-השני משותק על פני השטח ניקל (II) נת&quot;ע נמצא 2.05 מיקרומטר (איור 3). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> איור 3: בזמן אמת קינטי ניתוח של Ir1 עם אינטרפרומטריה BNT-השני Biolayer לניתוח הקינטית של ריכוזים שונים של Ir1 מחייבים BNT-II על פני השטח של ניקל חיישן זכוכית (II) נת&quot;ע.. לאחר equilibrating החיישנים בKB (מחוז), החיישנים נטענים עם 0.5 מיקרומטר BNT-II (אזור ב &#39;). ברגע שפפטיד נטען על החיישנים, בסיס הוקם (C מחוז) לפני מדידת איגוד Ir1 לBNT-II (אזור ד &#39;). לאחרתקופה של עמותה, החיישנים ממוקמים בחזרה לKB למדוד דיסוציאציה (E אזור). תהליך הניתוח הקינטית כל לוקח פחות מ -30 דקות. כאשר מעבר מ assay מבוסס פתרון לפלטפורמת חלקיקים מגנטי, מורכבות הנוספות של החלקיקים במערכת היו צריכות להילקח בחשבון. זה היה ידוע מהעבודה קודמת, שהחלקיקים אלה ביעילות מחייבים את PF הסמן הביולוגי המלריה HRP-השני. 24 צלחות ניאון שחורות עבדו היטב עבור assay הפתרון לתאר לעיל, אך צלחות הלבנות היו מתאימות יותר לפלטפורמת הגילוי על-חלקיקים, כפי שניתן לראות ב איור 4 א. בצלחת לבנה, האור משתקף בחזרה למדגם, ובכך מאפשר לספיגה טובה יותר על ידי Ir1 קשורה אל פני השטח של החלקיקים. בassay על-חלקיקים, המגבלה של זיהוי של rcHRP-השני הייתה נחושה להיות 14.5 ננומטר (איור 4). המגבלה של זיהוי לrcHRP-השני ב- פתרון ועל-חרוז היתה statistically אותו מבוסס על מבחן t מזווג (p = .731). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> איור 4:. הבדל בחרוז איתור של BNT-השני וHRP-II () בין האות המזוהות מIr1 חייב BNT-II על פני השטח של 50 מיקרומטר ניקל חלקיקי agarose (II) נת&quot;ע מגנטי בשחור 96 גם צלחת (קו מוצק) לעומת צלחת לבנה 96-היטב (קו מקווקו). החלקיקים התלהבו עם 365 ננומטר אור, והפליטה נמדדה ב 510 ננומטר. כותרות (B) של rcHRP-השני משותקים על החלקיקים המגנטיים וזוהו באמצעות Ir1. גבול של זיהוי חושב כvalue של x כאשר y = ריק 3σ. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> איור 5: ייצוג סכמטי של איתור בחרוז של rcHRP-II עם Ir1 תכנית כללית של HRP-השני מחייבת את פני השטח של ניקל (II) נת&quot;ע חלקיקים ומסומנים עם Ir1.. החלקיקים מודגרת עם פפטיד העשיר היסטידין במשך 15 דקות. לאחר תקופת דגירה זה, החלקיקים נשטפים עם HBST באמצעות מגנט, כדי למשוך את החלקיקים מהפתרון. לבסוף, חלקיקי פפטיד מחויבים מודגרת עם Ir1 עבור שעה 1 לפני קריאת הפליטה ב 510 ננומטר לאחר עירור עם 365 ננומטר אור.

Watch this Scientific Journal Video about IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II at JoVE.com

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

אירידיום (III) פלורסנט בדיקה לאיתור של חלבון המלריה ביומרקר היסטידין העשיר החלבון-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.1K Views.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Video: IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

Osmometer Nanoliter הרומן LabVIEW המופעל לחקירות חלבון מחייב קרח

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

סינתזה של Indoxyl-גליקוזידים לאיתור של פעילויות glycosidase

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC המדידה של ה- DNA חמצון ביומרקר, 8-אוקסו-7,8-Dihydro-2&#39;-deoxyguanosine, בתאים בתרבית ורקמות בעלי החיים

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE - Native נקה ג&#39;ל eluted שבר נוזלי אלקטרופורזה מילכוד

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

סינתזה של חלבון Bioconjugates<em&gt; דרך</em&gt; כימיה ציסטאין-maleimide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

מבחן צבע ספוט ככלי הרב, שעורר איתור מהיר של Cathinones סינתטי

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

נשימה אוסף ילדים למען גילוי סמן מחלה

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

הכנה ויישום של ביוסנסור בקטריאלי חדש לאיתור שוערת של שאריות ירי

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

אירידיום (III) פלורסנט בדיקה לאיתור של חלבון המלריה ביומרקר היסטידין העשיר החלבון-II

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video