The authors would like to acknowledge the technical assistance of Alfred Gunasekaran in electron microscopy studies at the Institute of Micromanufacturing at Louisiana Tech University, and Dr. Jim McNamara for assistance with additional microscopy studies. The work described was supported in part by Louisiana board of Regents PKSFI Contract No. LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 and the James E. Wyche III Endowed Professorship from Louisiana Tech University (to M.D.).

1. التخطيط للتجارب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم nanocomposites النحاس اللازمة لتخليق. على هذا الأساس، واختيار عدد من قوارير صغيرة الحجم (25 سم 2)، أو قوارير أكبر على النحو المبين أدناه في إعداد المواد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهذا التوليف، استخدام 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2 و 40٪ على الأقل الرطوبة. ضمان أن مثل حاضنة متاح، وأنه لن تكون منزعجة بشكل متكرر خلال الفترة من التوليف (حوالي 24 ساعة). تنبيه: افتتاح المتكررة وإغلاق الحاضنة بالتأكيد سوف يسبب التقلبات في درجات الحرارة مما قد يؤدي إلى تغير تركيب الهياكل بمركب متناهي في الصغر. </li></ol> 2. إعداد المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع المواد الطازجة قبل بدء التجربة، وذلك بإضافة المواد الصلبة للمذيبات الحق قبل التوليف هو أن تبدأ. حفظ حلول المخزون من المواد السيستين والنحاس الانطلاق في السائل لزمن طويل بefore لا ينصح التجربة وربما يؤدي إلى نتائج متباينة. فتحت مرة واحدة من البائع، والحفاظ على المواد الأولية الجافة عن طريق لف الجزء العلوي من الحاويات مع parafilm. ملاحظة: يتم استخدام بروتوكول التالي كمثال لردود الفعل في 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة باستخدام 7 ميكرولتر من السيستين، 6643 ميكرولتر من الماء المعقم، و 350 ميكرولتر من CNPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 ملغ / مل حل النانوية النحاس وزنها عن طريق لا يقل عن 2 ملغ من CNPS. ارتداء قفازات المتاح خلال هذه الخطوة لمنع اتصال ممكن من CNPS مع الجلد. وضع النانوية في فارغة معقمة 16 مل قارورة زجاجية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى القارورة التي تحتوي على CNPS، إضافة الماء منزوع الأيونات معقمة في حجم مناسب لجعل 2 ملغ / مل حل ودوامة الحل لمدة 20 ثانية لتوفير تشتت الجسيمات النانوية قبل بدء التوليف (يوصى 1 مل على الأقل إجمالي حجم). لا تملأ أكثر من نصف الطريق قنينة بالماء وهذا سوف تمنع الاختلاط من قبل vortexing. CNPS فيلل يستقر بسرعة إلى قاع القارورة وسوف تظهر داكنة اللون (الرمادي إلى الأسود). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الحل CNP لمدة 17 دقيقة في RT لتوفير التشتت القصوى من CNPS قبل بداية التوليف. فحص دوري للتأكد من أن CNPS خلط المقرر أن صوتنة. بعد صوتنة ناجحة، CNPS تظل معلقة في حل لمدة 30 دقيقة على الأقل، وسوف يكون الحل داكنة اللون. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن خارج كتلة كافية من السيستين لجعل الحل / مل 72.9 ملغ لتوليف. منذ سيستين ليست قابلة للذوبان في الماء مباشرة، ضع السيستين وزنه في سفينة وزنها التحجر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى وزنها عاء يحتوي سيستين، إضافة كمية كافية من عقيم، 1 M هيدروكسيد الصوديوم، بحيث سيستين يذوب تماما. على سبيل المثال، ويحل 7.29 ملغ من السيستين تماما في 100 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، لجعل 72.9 ملغ / مل حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على ظروف معقمة، تنفيذ هذه الخطوة في العقيمة الأنسجة تدفق الثقافة غطاء محرك السيارة. تنبيه: هيدروكسيد الصوديومفي 1 M التركيز هو الكاوية، وحتى ارتداء القفازات القابل للتصرف خلال هذه الخطوة لمنع الاتصال من المركز هيدروكسيد الصوديوم مع الجلد </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في نسيج الثقافة العقيمة غطاء محرك السيارة، إضافة 7 ميكرولتر من سيستين مع 6643 ميكرولتر من الماء المعقم لتركيب قارورة معقمة أولا، واسمحوا احتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع غطاء القارورة تنفيس (فضفاضة) لتوفير فعالة الاختلاط. Resuspend و2 ملغ / مل حل CNP قبل vortexing لمدة 30 ثانية، منذ CNPS واستقروا بعد خطوة صوتنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حلا كافيا CNP إلى قارورة التوليف (باستخدام تقنية معقمة) للحفاظ على نسب المكون التالي: الجمع بين 1 أجزاء سيستين، 50 أجزاء CNPS، و 949 أجزاء من الماء المعقم في 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة لبدء عملية التجميع. على سبيل المثال، لحجم التوليف 7 مل، والجمع بين 7 ميكرولتر من محلول المخزون السيستين، و 350 ميكرولتر من CNPS، و6643 ميكرولتر من الماء المعقم. استبدال الغطاء على القارورة وتشديد بحيث يكون SECURه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجمع بين جميع المكونات لتركيب، مزيج برفق في قارورة من قبل يحوم 4-5 مرات. ضع قارورة في الحاضنة CO 2 وتنفيس القارورة من خلال تخفيف الغطاء بحيث يكون هناك تبادل الغازات داخل وخارج القارورة خلال التوليف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح التوليف لتشغيل في الحاضنة لمدة ما يقرب من 24 ساعة. خلال التوليف، يمكن للمرء أن يلاحظ، مع المجهر والعين، وتشكيل المركبة الخطية للغاية. ملاحظة: عملية تشكيل الهياكل قد يحدث فجأة، بمعنى أن الهياكل من الصعب في البداية للكشف، ثم ظهور العائدات بسرعة إلى الكثافة المتزايدة. ولذلك قد يحدث قبل تشكيل 24 ساعة. ويمكن أيضا ملاحظة هذه العملية عن طريق العين مرة واحدة تصبح هياكل أكبر ويزيد من كثافتها. بينما جيل من الهياكل يمكن ملاحظتها على مر الزمن تحت المجهر والعين في نقطة زمنية لاحقة، انقطاع مستمر للشروط التوليف ودرجة الحرارة سوف يؤدي إلى الفقراءالنتائج التوليف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء توليف biocomposites التي كتبها السد بإحكام القارورة تجميع وتخزين وعاء في الثلاجة (4 ° C). الهياكل، مرة واحدة ولدت، وتظل مستقرة في هذا النموذج لمدة سنة على الأقل. تسمية قارورة مع الظروف التوليف، بما في ذلك مكونات المستخدمة، تاريخ التوليف، وفترة حضانة من التوليف قبل الإنهاء. </li></ol> 3. تجميع عن طريق كبريتات النحاس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ التوليف التجميع الذاتي عن طريق استبدال CNPS مع كبريتات النحاس والملح. باستخدام تقنية معقمة، ويحل على الأقل 2 ملغ من كبريتات النحاس بكميات كافية من الماء منزوع الأيونات عقيمة لجعل 2 ملغ / مل حل. بلورات كبريتات النحاس تذهب بسهولة إلى حل في هذا التركيز، ولكن دوامة القارورة إذا لزم الأمر، وتفتيش من قبل العين لضمان تذاب كل البلورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إعداد كبريتات النحاس وتنفيذ التوليف كما هو موضح سابقا، ولكن استبدال CNPS مع كبريتات النحاس. ملاحظة: تم العثور على nanocomposites الذاتي تجميعها باستخدام كبريتات النحاس كمادة أولية ليكون أكثر اتساقا في شكل نهائي من لهياكل توليفها من CNPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء تركيب biocomposites كبريتات النحاس بالنسبة للمركبات CNP (الخطوة 2.6) وتخزينها على المدى الطويل في 4 ° C. </li></ol> 4. توصيف والتعامل مع Biocomposites بعد التوليف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز biocomposites المستمدة من CNPS ومن كبريتات النحاس التي كتبها الضوء الأبيض المجهر 9 والإلكترون المجهري 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوصيف والتفتيش على biocomposites بعد التوليف عن طريق المجهر الضوئي الأبيض، واستخدام مجهر مقلوب كما المركبة سوف تستقر في السطح السفلي من القارورة في غضون بضع دقائق من وضع قارورة شقة، ويمكن بعد ذلك جلبت الى التركيز. استخدام الإعداد حقل مشرق على المجهر لتحقيق أقصى قدر من التناقض بين biocomposites والمتوسطة السائل. المركبات المشتقة من CNPS وشرطيفي كبريتات سوف يظهر كل منهما واضحا للمبهمة في اللون، ولكن سوف المجاميع CNP غير المتفاعل تظهر مظلمة جدا في اللون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كاميرا رقمية متصلة المجهر لالتقاط الصور من المركبة. وسيراعى مجموعة من أطوال لهياكل الفردية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوصيف والتفتيش على biocomposites بعد التوليف وبعد تخزين عند 4 درجات مئوية، والسماح قوارير أن يأتي إلى RT لمدة 15 دقيقة على الأقل كما قوارير سوف تكثف في البداية على إزالة من الثلاجة، والتي سوف تحجب فعالية التركيز أثناء تأدية التصوير المجهري. بعد السماح موازنة لRT، ومسح الأسطح العلوية والسفلية من القارورة مع منشفة ورقية نظيفة لتحقيق أقصى قدر من جودة التصوير المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند العمل مع أو التصوير المركبة التي تم تخزينها على المدى الطويل، دوامة القارورة لمدة 30 ثانية إلى فصل كتل من المواد المركبة التي تشكل أثناء وجوده في الثلاجة. بعد vortexing ل، وفحص الهياكل مع هيئة التصنيع العسكري مقلوبroscope لضمان أن المجاميع وفصلها، وكرر vortexing لالضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقلوب المجهر الضوئي الأبيض لتقييم فعالية تجميع لتجربة معينة باستخدام CNPS. على سبيل المثال، وتوثيق وجود أو عدم وجود المتفاعل CNPS في قوارير التوليف تستخدم لbiocomposites CNP المستمدة من قوارير مع معلمات مختلفة مثل الوقت من التوليف. ملاحظة: فردية CNPS صغيرة جدا أن نلاحظ مع المجهر الضوئي، ولكن غير المتفاعل CNP المجاميع سوف تظهر مستديرة الشكل والأشياء المظلمة، وعلى النقيض من توليفها بنجاح CNP-المركبة التي سيكون لها نسبة عالية الجانب، شكل خطي، و سيكون لديك مجموعة من أطوال مختلفة. تجنب إجراء توليف لفترة طويلة جدا لفترة من الوقت قبل إنهاء الخدمة، لأن هذا سيؤدي في تشعبت للغاية &quot;قنفذ&quot; الهياكل نوع، التي يصعب تفريق في الهياكل الفردية تشكلت مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقلوب الضوء الأبيض المجهر لتقييم فعاليةمن التوليف لتجربة معينة باستخدام كبريتات النحاس. منذ كبريتات النحاس يذهب تماما في حل باستخدام هذا البروتوكول، فإن الحل يبدو أقل المظلم من الحل من التوليف باستخدام CNPS. توثيق حجم ومدى المركبة كبريتات النحاس من خلال مقارنة قوارير مع الظروف التوليف مختلفة مثل الوقت من التوليف قبل الإنهاء. ملاحظة: ستكون المركبة توليفها بنجاح تظهر مجموعة من أطوال مختلفة. تجنب إجراء توليف لفترة طويلة جدا لفترة من الوقت قبل إنهاء الخدمة، لأن هذا سيؤدي في المجاميع تشعبت للغاية من المواد المركبة، وبعضها سيكون &quot;قنفذ مثل&quot; في الهيكل، والتي يصعب تفريق في الهياكل الفردية تشكلت مرة واحدة . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التركيز biocomposites بعد التوليف، حلول أجهزة الطرد المركزي المركبة في أنبوب الطرد المركزي. إضافة 6 مل من أي هياكل CNP المشتقة أو الهياكل المستمدة من كبريتات النحاس لأنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقةفي 500 x ج في RT لتشكيل بيليه. لأحجام أصغر، إضافة 500 ميكرولتر من الهياكل في حل إلى 0.6 مل أنابيب الحجم. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج في RT لمدة 10 دقيقة على الأقل لتشكيل بيليه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي لمدة ما يكفي من الوقت (10 دقيقة على الأقل لmicrofuges)، حفظ بيليه يمكن ملاحظتها في الجزء السفلي من الأنبوب حيث تتركز الهياكل عن طريق إزالة بعناية السائل طاف فوق بيليه. ويبدو أن الهياكل Biocomposite المستمدة من كبريتات النحاس الأزرق في اللون والهياكل المستمدة من CNPS هي أكثر قتامة (الرمادي إلى الأسود). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المزيد من المواد المركبة لهذا الأنبوب وتكرار هذه العملية في نفس أنبوب للتركيز هياكل إذا رغبت في ذلك. لتفريق الكريات المركزة، إضافة حجم المطلوب من حل للأنبوب، ودوامة لمدة 10-30 ثانية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هياكل يصوتن بمجرد تشكيلها، لنقل متوسط ​​حجم السكان (أطوال) من هياكل لخفض القيم. هياكل مكان في الماء منزوع الأيونات معقمة ويصوتن لفي LeAST 10 دقيقة. باستخدام هذه العملية، مع مرور الوقت، والهياكل تصبح مجزأة وأصغر في متوسط ​​طول (انظر الشكل 6 من النص). تغييرات الوثيقة في أحجام المركبة مع أوقات صوتنة مختلفة باستخدام الأبيض مقلوب المجهر الضوء والكاميرا الرقمية. </li></ol>

<ol>
	<li>Klinman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+copper-enzyme+family+of+dopamine+beta-monooxygenase+and+peptidylglycine+alpha-hydroxylating+monooxygenase:+resolving+the+chemical+pathway+for+substrate+hydroxylation.">The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation.</a> The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).</li><li>Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentiality+of+copper+in+humans.">Essentiality of copper in humans.</a> The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).</li><li>Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oxide+nanoparticles+are+highly+toxic:+a+comparison+between+metal+oxide+nanoparticles+and+carbon+nanotubes.">oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).</li><li>Parekh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+nanoencapsulation+of+camptothecin+with+improved+activity.">Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity.</a> International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).</li><li>Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-clad+fibers:+a+metal-based+biological+strategy+for+hard+flexible+coatings.">Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings.</a> Science. 328, 216-220 (2010).</li><li>Keyson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CuO+urchin-nanostructures+synthesized+from+a+domestic+hydrothermal+microwave+method.">CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method.</a> Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).</li><li>Liu, B., Zeng, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscale+organization+of+CuO+nanoribbons:+formation+of+'dandelions'.">Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'.</a> J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+synthesis+of+self-assembled+Cu2S+nanostructures+through+a+template-free+polyol+process+for+the+degradation+of+organic+pollutant+under+visible+light.">Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light.</a> Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).</li><li>Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Aspect+Ratio+Bio-Metallic+Nanocomposites+for+Cellular+Interactions.">High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions.</a> IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).</li><li>Montes-Burgos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+nanoparticle+size+and+state+prior+to+nanotoxicological+studies.">Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies.</a> Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).</li><li>Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+in+biological+media+by+fetal+bovine+serum+(FBS).">Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS).</a> Langmuir. 27, 843-850 (2011).</li><li>Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+coffee-ring+effect+by+shape-dependent+capillary+interactions.">Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions.</a> Nature. 476, 308-311 (2011).</li><li>Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+and+Other+Studies+on+a+Copper&#8211;Cystine+Complex.">Electron Microscopic and Other Studies on a Copper&#8211;Cystine Complex.</a> The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).</li><li>Furia, E., Sindona, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+of+L-cystine+with+metal+cations.">Complexation of L-cystine with metal cations.</a> Journal of Chemical &amp; Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).</li><li>Hawkins, C., Perrin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polynuclear+Complex+Formation.+II.+Copper+(II)+with+Cystine+and+Related+Ligands.">Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands.</a> Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).</li><li>Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computed+distribution+of+copper+(II)+and+zinc+(II)+ions+among+seventeen+amino+acids+present+in+human+blood+plasma.">The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma.</a> Biochem. J. 121, 549-555 (1971).</li><li>Jensen, L. S., Maurice, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+sulfur+amino+acids+on+copper+toxicity+in+chicks.">Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks.</a> The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).</li><li>Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+synthesis+of+copper+nanoparticles+by+chemically+controlled+reduction+for+applications+of+inkjet-printed+electronics.">Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics.</a> Nanotechnology. 19, 415604 (2008).</li><li>Hume, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+coiled-coil+protein+microfibers.">Engineered coiled-coil protein microfibers.</a> Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

أثناء تقييم الآثار السامة المحتملة للمواد متناهية الصغر بما في ذلك CNPS، لوحظ أن أكثر على المدى الطويل، تحولت CNPS من توزيع الجسيمات في البداية أكثر تشتتا ل، مجمعة أكبر (الشكل 2). في بعض الحالات، وهذه التشكيلات شديدة التجميع التي أنتجت في طبق زراعة الخلايا، في ظل...

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions 1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form 3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels 5. In studying the potential toxic effects of nanomaterials 4, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 &#176;C and 5% CO2), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.
By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called &#8220;urchin&#8221; and &#8220;nanoflower&#8221; type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 &#176;C or greater 6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described. 
One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells 4. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs 9. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells. 
In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media 10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported 9. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described &#8220;coffee ring effect&#8221; 12 and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mini Vortexer</td>
			<td>VWR (https://us.vwr.com)</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Model # 2425-2</td>
			<td>VWR (https://us.vwr.com)</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td>Current model calalog # 98000-360</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)</td>
			<td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td>
			<td>C2500-R</td>
			<td>Model Prism R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Centrifuge Model Z323K</td>
			<td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td>Current model Z206A catalog # C0206-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Ultrasonic Cleaner)</td>
			<td>Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)</td>
			<td>1510R-MTH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius (http://dataweigh.com)</td>
			<td></td>
			<td>Model CP225D similar model CPA225D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 Inverted Light Microscope</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP71 microscope digital camera</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>external power supply unit- white light for Olympus microscope</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x, 20, and 40x microscope objectives</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)</td>
			<td>model S-4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)</td>
			<td>model Libra 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench</td>
			<td>Envirco (http://envirco-hvac.com)</td>
			<td>model PNG62675</td>
			<td>Used for sterile cell culture technique</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of scalable, metallic high-aspect ratio nanocomposites in a biological liquid medium

والهدف من هذا البروتوكول هو وصف تركيب اثنين biocomposites جديدة مع هياكل ارتفاع نسبة الجانب. تتكون biocomposites من النحاس والسيستين، وإما النانوية النحاس (CNPS) أو كبريتات النحاس المساهمة عنصر معدني. ويتم تجميع في السائل تحت الظروف البيولوجية (37 ° C) وشكل المركبة الذاتي تجميعها بعد 24 ساعة. تشكلت مرة واحدة، هذه المركبات هي درجة عالية من الاستقرار في كل وسائل الإعلام السائلة وفي شكل المجففة. المركبة مقياس من النانوية لمجموعة الصغرى في الطول، ومن بضعة ميكرونات إلى 25 نانومتر في القطر. أظهر الانبعاثات مجال المجهر الإلكتروني مع التحليل الطيفي التشتت الطاقة الأشعة السينية (EDX) أن الكبريت كان حاضرا في هياكل خطية NP المشتقة، في حين أنه كان غائبا عن المواد CNP ابتداء، مما يؤكد سيستين كمصدر من الكبريت في nanocomposites النهائية . خلال توليف هذه النانوية والصغرى المركبة الخطية، مجموعة متنوعة من أطوال شارعيتم تشكيل uctures في السفينة التوليف. وقد تجلى صوتنة من الخليط السائل بعد التوليف للمساعدة في السيطرة على متوسط ​​حجم الهياكل التي كتبها تناقص متوسط ​​طول الوقت مع زيادة صوتنة. منذ البنى المتشكلة مستقرة للغاية، لا التكتل، وتتشكل في الطور السائل، ويمكن أيضا أن تستخدم الطرد المركزي للمساعدة في التركيز وعزل المركبات تشكيلها.

ويبين الشكل 1 تخطيطي تدفق الرسم البياني للخطوات تركيب لتشكيل biocomposites الخطية الموصوفة في هذا العمل. CNPS أو كبريتات النحاس عن بدء مواد وجنبا إلى جنب مع الماء المعقم لتشكيل 2 ملغ / مل حل، وهذا الحل هو مختلطة وsonicated لتوفير حتى الخليط، ثم يتم خلط هذا الحل النحاس في نس...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium at JoVE.com

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

نحن هنا نقدم بروتوكول لتجميع الرواية، وارتفاع تبلغ نسبة أبعادها biocomposites في ظل الظروف البيولوجية ووسائل الإعلام السائلة. وbiocomposites مقياس من نانومتر إلى ميكرومتر في القطر والطول، على التوالي. النانوية النحاس (CNPS) وكبريتات النحاس جنبا إلى جنب مع السيستين هي المكونات الرئيسية للالتوليف.

جيل من تحجيم، لامع عالية الارتفاع Nanocomposites نسبة في البيولوجية السائل المتوسطة

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

generation-scalable-metallic-high-aspect-ratio-nanocomposites

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Views.  Centenary College of Louisiana.  نحن هنا نقدم بروتوكول لتجميع الرواية، وارتفاع تبلغ نسبة أبعادها biocomposites في ظل الظروف البيولوجية ووسائل الإعلام السائلة. وbiocomposites مقياس من نانومتر إلى ميكرومتر في القطر والطول، على التوالي. النانوية النحاس (CNPS) وكبريتات النحاس جنبا إلى جنب ...

Video: Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, each offering its own advantages and shortcomings5,6. Most prominently, due to the microscale device dimensions, a high modulus is required to facilitate implantation into living tissue. Conversely, the stiffness of the device should match the surrounding tissue to minimize induced local strain7-9. Therefore, we recently developed a new class of bio-inspired materials to meet these requirements by responding to environmental stimuli with a change in mechanical properties10-14. Specifically, our poly(vinyl acetate)-based nanocomposite (PVAc-NC) displays a reduction in stiffness when exposed to water and elevated temperatures (e.g. body temperature). Unfortunately, few methods exist to quantify the stiffness of materials in vivo15, and mechanical testing outside of the physiological environment often requires large samples inappropriate for implantation. Further, stimuli-responsive materials may quickly recover their initial stiffness after explantation. Therefore, we have developed a method by which the mechanical properties of implanted microsamples can be measured ex vivo, with simulated physiological conditions maintained using moisture and temperature control13,16,17. 
To this end, a custom microtensile tester was designed to accommodate microscale samples13,17 with widely-varying Young's moduli (range of 10 MPa to 5 GPa). As our interests are in the application of PVAc-NC as a biologically-adaptable neural probe substrate, a tool capable of mechanical characterization of samples at the microscale was necessary. This tool was adapted to provide humidity and temperature control, which minimized sample drying and cooling17. As a result, the mechanical characteristics of the explanted sample closely reflect those of the sample just prior to explantation.
The overall goal of this method is to quantitatively assess the in vivo mechanical properties, specifically the Young's modulus, of stimuli-responsive, mechanically-adaptive polymer-based materials. This is accomplished by first establishing the environmental conditions that will minimize a change in sample mechanical properties after explantation without contributing to a reduction in stiffness independent of that resulting from implantation. Samples are then prepared for implantation, handling, and testing (Figure 1A). Each sample is implanted into the cerebral cortex of rats, which is represented here as an explanted rat brain, for a specified duration (Figure 1B). At this point, the sample is explanted and immediately loaded into the microtensile tester, and then subjected to tensile testing (Figure 1C). Subsequent data analysis provides insight into the mechanical behavior of these innovative materials in the environment of the cerebral cortex.

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

A method is discussed by which the in vivo mechanical behavior of stimuli-responsive materials is monitored as a function of time. Samples are tested ex vivo using a microtensile tester with environmental controls to simulate the physiological environment. This work further promotes understanding the in vivo behavior of our material.

اختبار Microtensile التي تسيطر عليها بيئيا للميكانيكيا على التكيف nanocomposites والبوليمرات لل<em&gt; خارج الحي</em&gt; توصيف

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

التوليف من ألياف نانوية أساس كيراتين للهندسة الطبية الحيوية

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

بالتناوب المغناطيسي Microgels الجيلاتين الهجين-الميدان الاستجابة لرقابة الإصدار المخدرات

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Preparation of Monodomain Liquid Crystal Elastomers and Liquid Crystal Elastomer Nanocomposites

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and as soft robots. Here, we demonstrate the preparation of shape-responsive liquid crystal elastomers (LCEs) and LCE nanocomposites along with characterization of their shape-responsiveness, mechanical properties, and microstructure. Two types of LCEs &#8212; polysiloxane-based and epoxy-based &#8212; are synthesized, aligned, and characterized. Polysiloxane-based LCEs are prepared through two crosslinking steps, the second under an applied load, resulting in monodomain LCEs. Polysiloxane LCE nanocomposites are prepared through the addition of conductive carbon black nanoparticles, both throughout the bulk of the LCE and to the LCE surface. Epoxy-based LCEs are prepared through a reversible esterification reaction. Epoxy-based LCEs are aligned through the application of a uniaxial load at elevated (160 &#176;C) temperatures. Aligned LCEs and LCE nanocomposites are characterized with respect to reversible strain, mechanical stiffness, and liquid crystal ordering using a combination of imaging, two-dimensional X-ray diffraction measurements, differential scanning calorimetry, and dynamic mechanical analysis. LCEs and LCE nanocomposites can be stimulated with heat and/or electrical potential to controllably generate strains in cell culture media, and we demonstrate the application of LCEs as shape-responsive substrates for cell culture using a custom-made apparatus.

We demonstrate the preparation of siloxane-based and epoxy-based liquid crystal elastomers (LCEs) and LCE nanocomposites. The LCEs are characterized with respect to reversible strain, liquid crystal ordering, and stiffness. As a potential application, we demonstrate their use as shape-responsive substrates in a custom device for active cell culture.

إعداد Monodomain الكريستال السائل اللدائن والكريستال السائل المرنة Nanocomposites

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...