المواد الحبيبية ، مثل سقالات MAP ، هي مواد مسامية قابلة للحقن مصنوعة من جزيئات هيدروجيل صغيرة الحجم مترابطة. يعد التحكم في جزء الجسيمات أمرا بالغ الأهمية لخصائص المواد والاستجابات الخلوية. تؤدي كسور الجسيمات المتغيرة في سقالات MAP إلى مجموعة من خصائص السقالات واستجابات الخلايا ، لكن هذه التقنية تسمح للمستخدمين بتحديد الكسر النهائي للجسيمات في سقالات MAP التي ينشئونها.
يمكن استخدام سقالات MAP لتعزيز إصلاح وتجديد الجروح المعقدة ، وكذلك لتوصيل الأدوية. يؤثر جزء الجسيمات ، على سبيل المثال ، على معدل ودرجة التسلل الخلوي والتجديد. يمكن تطبيق هذه الطريقة على جميع فئات الهلاميات المائية الحبيبية.
الآن بعد أن تمكنا من صنع سقالات MAP باستخدام كسور الجسيمات التي يتحكم فيها المستخدم ، يمكننا دراسة النشاط الحيوي لهذه المواد بشكل متكرر والتحقيق في استجابات الخلايا الفريدة ، مثل الحبس. يتطلب إعداد جيل ميكروجيل الموائع الدقيقة وقتا وصبرا بينما تتعلم التقنيات. من الأفضل أن يكون لديك أجهزة متعددة جاهزة وجاهزة في حالة مواجهة مشكلات في الإعداد.
ابدأ بإنتاج الموائع الدقيقة لحمض الهيالورونيك ، أو HA ، ونوربورنين ، أو NB ، microgels. قبل تجفيف الهلاميات الدقيقة ، قم بوزن أنبوب غطاء لولبي آمن من التبريد. ثم في غطاء معقم ، انقل الهلاميات الدقيقة المغسولة والمنقاة إلى أنبوب غطاء لولبي آمن للتبريد باستخدام ماصة إزاحة إيجابية.
أضف 70٪ إيثانول إلى الهلاميات الدقيقة المنقاة واخلطها جيدا. الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 5،000 غرام. نضح الطافي ، وإضافة 70 ٪ من الإيثانول.
تخلط جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة للتأكد من أن الهلاميات الدقيقة في قاع الأنبوب. أضف النيتروجين السائل إلى وعاء مبرد ، وضع أنبوب الكبسولات الهلامية الدقيقة لتجميد الفلاش.
بعد خمس إلى 10 دقائق ، قم بإزالة أنبوب microgels بالملقط. قم بإزالة الغطاء بسرعة ، وقم بتغطية الأنبوب بأنسجة معملية. قم بتأمين المنديل بشريط مطاطي ، وانقله إلى حاوية أو غرفة التجفيد.
قم بتحميل العينة على مجفف التجميد باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، وقم بالتجفيد عند 0.066 Torr و 63 درجة مئوية تحت الصفر. قم بوزن الهلاميات الدقيقة المجففة بالتجميد من الأنبوب قبل تخزينها في درجة حرارة الغرفة. امزج بوليديميثيل سيلوكسان ، أو قاعدة المطاط الصناعي PDMS مع عامل المعالجة بنسبة 10 إلى واحد حسب الكتلة.
يسكب خليط PDMS في طبق بتري بلاستيكي كبير ويتخلص من الغازات في المجفف لمدة 30 دقيقة ، أو حتى تختفي جميع الفقاعات. بمجرد اختفاء جميع الفقاعات ، ضع القالب المطبوع 3D بعناية في PDMS لتقليل تكوين فقاعات جديدة. ضعيها في الفرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين لعلاج PDMS.
بعد المعالجة ، استخدم سكينا أو شفرة حلاقة لتتبع محيط جهاز الثقافة برفق ، وقم بإزالة القالب بعناية. استخدم لكمة خزعة بأربعة ملليمترات لإزالة أي PDMS من قاع الآبار. قطع الأجهزة لتناسب زلة غطاء زجاجي.
استخدم شريطا لإزالة الغبار من الجانب السفلي لجهاز الثقافة. ضع زلة الغطاء الزجاجي النظيف وجهاز الثقافة على طبق ساخن عند 135 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة الرطوبة. في غطاء الدخان ، استخدم مسدس بلازما كورونا عاليا على زلة الغطاء الزجاجي والجانب السفلي من الجهاز لمدة 30 ثانية.
ثم اربط الأسطح المعالجة معا بسرعة. اضغط برفق لضمان إحكام جيد بين جهاز الثقافة وانزلاق الغطاء الزجاجي. ضع الجهاز في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل لتأمين السندات.
في اليوم التالي ، قم بتعقيم الجهاز قبل استخدامه في المختبر. بعد ذلك ، قم بإعداد الجسيمات الملدنة الصغيرة التي يسهل اختراقها ، أو مكونات سقالة MAP ، بناء على جزء الجسيمات المطلوب لزراعة الخلايا في سقالات MAP. وزن microgels المجففة بالتجميد لتحديد كتلة microgels.
ثم أعد تكوين الهلاميات الدقيقة في 84٪ من حجم MAP النهائي لوسائط الخلية بناء على النسبة المئوية للوزن المختار MAP. دع الهلاميات الدقيقة تنتفخ لمدة 20 دقيقة. قم بإذابة حمض الهيالورونيك ، أو HA-tetrazine ، ووسائط الخلية في 16٪ من حجم MAP النهائي.
بمجرد وصول الخلايا إلى نقطة الالتقاء المطلوبة ، ارفع الخلايا وعدها. نقل 10،000 خلية لكل ميكرولتر MAP إلى أنبوب جديد. الطرد المركزي للخلايا ، واستنشاق المادة الطافية من الحبيبات دون استنشاق الخلايا.
أضف الهلاميات الدقيقة والرابط المتقاطع إلى الحبيبات باستخدام ماصة الإزاحة. تخلط جيدا ، والبذور 10 ميكرولتر لكل بئر. ماصة في حركة دائرية لتوزيع الخليط بالتساوي في البئر.
اترك الكبسولات الهلامية الدقيقة تلتنق عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة قبل إضافة وسائط الخلية لملء الآبار. الحفاظ على الثقافات ثلاثية الأبعاد عند 37 درجة مئوية ، وتغيير الوسائط حسب الحاجة. لتجنب استنشاق السقالة ، قم بتثبيت طرف الماصة على طول حافة البئر العلوي.
في النقاط الزمنية المطلوبة ، قم بإصلاح العينات عن طريق استبدال الوسائط ب 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من PBS ، أو المخزن المؤقت المفضل ، وتابع التألق المناعي ، أو تلطيخ التألق باستخدام 50 ميكرولتر لكل بئر حجم العمل. تبين أن أجهزة الموائع الدقيقة ذات منطقة تركيز التدفق تنتج هلاميات دقيقة HA-NB يبلغ قطرها 50 أو 100 ميكرون.
تم تحسين وسيط تجفيف الكبسولات الهلامية الدقيقة لتقليل تكوين الهلام المبرد باستخدام 70٪ من الإيثانول. ومع ذلك ، يمكن استخدام وسائط أخرى ، مثل كحول الأيزوبروبيل والماء والأسيتونيتريل بالتبادل لتسهيل تكوين الهلام بالتبريد. لتسهيل الربط الحيوي المتعامد للكبسولات الهلامية الدقيقة HA-NB ، تم تصنيع رابط متقاطع خطي HA-tetrazine.
يظهر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي بالبروتون تعديلا ناجحا ل 11٪ من وحدات تكرار HA مع مجموعة قلادة رباعية. تم إعادة ترطيب منتج الميكروجيل المجفف بالتجميد بكميات خاصة وتلدينه لتحقيق تركيبات مختلفة من الوزن من الكبسولات الهلامية الدقيقة في سقالات MAP. تتوافق نسب الوزن هذه للكبسولات الهلامية الدقيقة في سقالات MAP مع كسور الجسيمات الفريدة.
تظهر هنا زراعة الخلايا في سقالات MAP. تم تثبيت الخلايا في ثقافة 3D في سقالات MAP في اليوم الخامس ، ملطخة وتصويرها على مجهر متحد البؤر. تظهر شرائح Z المفردة اختلافات في نمو الخلايا والسقالات التي تضم نسبة وزن مختلفة MAP.
حدد وسائط التجفيد الخاصة بك بشكل مناسب اعتمادا على ما إذا كنت تريد cryogels، أم لا. لا تخطي خطوات الحضانة ، بحيث يكون لدى microgels الوقت الكافي لتنتفخ في وسائل الإعلام. يمكن استخدام التقنيات القياسية مثل الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي والمزيد لتقييم استجابات الخلايا داخل هذه المواد الحبيبية ذات المسامية المحددة.
