Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+types,+neurosecretory+cells,+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens.">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329 (2004).</li><li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells.">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li><li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion.">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2+-sensing+receptor.">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy.">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881 (2014).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells.">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li><li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li><li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon.">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li><li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids.">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li><li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy.">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Boh&#243;rquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li><li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1.">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li><li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin.">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells:+characteristics+and+potential+targets.">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li><li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+hormone+PYY(3-36)+physiologically+inhibits+food+intake.">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li><li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

الدكتور ساتيش Medicetty هو موظف من ويحصل على 100٪ من الراتب Renovo العصبية شركة. ولكن هذا لا يغير التزام مقدم البلاغ إلى سياسات إن الرب على البيانات والمواد المشاركة. يعلن أي تضارب في المصالح للمؤلفين المتبقية.

<html> chemosensation الهضمي يبرز بوصفه مجالا جديدا ومثيرا في مجال البحوث الطبية الحيوية. هذا هو في جانب كبير منه بسبب اكتشاف مستقبلات الذوق وظيفية في الخلايا enteroendocrine 18. وقد أظهرت الدراسات اللاحقة أن الخلايا enteroendocrine تعبر عن مستقبلات معينة على المواد الغذائية، بما في ذلك الكربوهيدرات، والدهون، والأحماض الأمينية 5،6،19،20. وكان العامل المحفز لهذه الاكتشافات تطوير الفئران المراسل، في الخلايا التي enteroendocrine وfluorescently المسمى 20. وضعنا واحد من هذه الفئران، والفأر PyyGFP، لدراسة الخلايا enteroendocrine من الأمعاء الدقيقة القاصي والقولون 17،21. هذه الخلايا هي التي تهم لأنها تفرز PYY ومثل الجلوكاجون الببتيد 1، وكلاهما المحرضات بالشبع 22،23. في ذلك الوقت، كان حساب فائقة الهيكلي الكامل لهذه الخلايا في عداد المفقودين، والتي كنا نعتقد أمر أساسي لفهم آليات يشير الخاصة بهم. ontent &quot;&gt; هنا، وصفنا على طريقة بصريا لسد متحد البؤر المجهري مع SBEM. ويشار إلى الأسلوب كما Cocem3D، الأمر الذي سمح لنا لتوثيق التركيب الدقيق الكامل للخلايا enteroendocrine. لقد ذكرت أن هذه الخلايا لديها neuropod يحتوي على ثلاثة أرباع كل من الحويصلات الإفرازية 8. وفي neuropod، هناك neurofilaments ومثل الكثير من المحاور العصبية، ورعايتها من قبل neuropods الخلايا الدبقية المعوية 8. والأهم من ذلك، هو على الرغم من هذه neuropods أن enteroendocrine خلايا الاتصال فعليا إلى الخلايا العصبية التعصيب الأمعاء و القولون 9. واحدة من نقاط القوة في cocem3D هو بساطته. الحد من عينة الأنسجة في كتلة التي يمكن تصويرها من قبل مبائر وSBEM يسهل التعرف على خلية معينة داخل الأنسجة. ويمكن تحديد الحويصلات الإفرازية وعضيات أخرى بكل سهولة في القرار 7 نانومتر / بكسل. لأنه يتم التخلص منها المقاطع في SBEM، المزيد من بروسسالغناء من الأنسجة لتحديد بروتينات معينة ليس خيارا في هذه المرحلة. ومع ذلك، وتطوير أساليب مثل آتوم 24، التي يتم الاحتفاظ المقاطع من كتلة الأنسجة، ومن المرجح أن تمكين من التعرف على بروتينات معينة في الخلية. تحديد موقع محدد من المستقبلات حسي كيميائي على خلايا enteroendocrine هي المعلومات الأساسية لتطوير علاجات العقاقير لعلاج السمنة، لأن الخلايا enteroendocrine هي واجهة الحسية بين الطعام في القناة الهضمية والشبع في الدماغ.

الحياة داخل خلية تحدث في الزمان والمكان. وغالبا ما تتم دراسة التغيرات على مر الزمن باستخدام المجهر مرور الزمن جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير مضان، مثل فائقة الدقة المجهر. الفضاء، ولا سيما ترتيب عضيات داخل الخلية أو الخلية الى خلية التفاعلات، لا يمكن إلا أن تستمد من خلال حساب كامل للبنية الخلية على ما يرام. يمكن حساب شامل لهيكل الخلية غرامة أيضا يجلب الوضوح الى وظيفة الجينوم في الحالات التي يكون فيها الجينوم هو متاح، مثل C. ايليجانس الخيطية 1 أو placozoa tricoplax شقة الملتصقة 2. المسلسل المجهر باجتزاء الإلكترون هو الآن استنساخه وفعالة وقت، وذلك بفضل مهمة أقل تكلفة لتطوير تكنولوجيات المجهر الإلكتروني 3D الآلي، مثل المسلسل كتلة وجه المسح الإلكترون المجهري 3 (SBEM). الحاجة إلى المعلومات الهيكلية لتوضيح وظيفة واضحة جدا في سل معينأنواع لتر حيث تعتمد الدالة على المادية الخلية الى خلية التفاعلات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية، أو الخلايا الظهارية الحسية. نحن مهتمون بشكل خاص في توضيح كيفية transduced إشارات حسية من المواد الغذائية في تجويف الأمعاء إلى إشارة كهربائية أن ينظم في نهاية المطاف السلوكيات مشهي. والدائرة هي معقدة ولكنها تبدأ في جدار الأمعاء حيث تأتي المواد الغذائية في اتصال مع الخلايا الظهارية الحسية، تسمى خلايا enteroendocrine. على عكس الخلايا الظهارية الحسية الأخرى، مثل الخلايا الذوقية، وفرقت الخلايا enteroendocrine في جميع أنحاء ظهارة الأمعاء في نسبة 1-1000 4-7. ونتيجة لذلك، فقد كان من الصعب تحديد ودراسة، ومنذ فترة طويلة أنها كان ينظر فقط كمصدر للهرمونات القناة الهضمية. ولكن مع تطور الفئران مراسل مضان خلية محددة، وظيفة حسية معقدة من هذه الخلايا في الظهور. باستخدام أحد هذه الفئران المراسل، الببتيد YY-GFP (PyyGFP) الماوس، وجدنا أن enteroendocrالمعهد الوطني للإحصاء الخلايا لها ذيل حشوية البارز الذي نحن اسمه neuropod. ظهور neuropods اقترح وظيفة الحفظ في خلية الاتصال إلى الخلية. وبالتالي، فإننا معللة ذلك من خلال توثيق التركيب الدقيق للخلية enteroendocrine، ويمكن أن تستمد وظيفة neuropods. وكانت الحاجة إلى فهم هيكل ذيلا في زنزانة فرقت التي من الصعب تحديد المبرر الرئيسي لتطوير طريقة للجمع بين المجهري متحد البؤر وSBEM. تم التعرف على خلية ذات الاهتمام باستخدام PyyGFP enteroendocrine خلية محددة الفئران مراسل. سمح لنا طريقة لتوثيق التركيب الدقيق الكامل للخلية enteroendocrine وneuropod لها. ضمن neuropods، وجدنا السمات الهيكلية من المحاور العصبية، وخارج neuropods، وجدنا علاقة جسدية لالدبقية المعوية 8. في الواقع، neuropods تحتوي على حوالي 70٪ من جميع الحويصلات الإفرازية يشير دورا أساسيا في وظيفة إفرازية من هذه الخلايا. بناء علىالبيانات الهيكلية، وفي الآونة الأخيرة وجدنا أنه من خلال هذه neuropods، خلايا enteroendocrine والخلايا العصبية التعصيب الأمعاء تشكيل الدائرة الظهارية العصبية، مماثلة لتلك التي من خلايا الذوق في اللسان 8،9. كشف مثل هذه السمات آليات حسي كيميائي الجهاز الهضمي تنبع من البيانات الهيكلية التي تم جمعها باستخدام هذا الأسلوب المجهري مترابط. ونعتقد أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة في مناطق أخرى من بيولوجيا الخلايا، لا سيما عندما فرقت الخلايا داخل الأنسجة في نسبة منخفضة جدا. أشرنا إلى الأسلوب كما متحد البؤر مترابط ومتسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني في 3D (Cocem3D). يتكون أسلوب الخطوات الرئيسية التالية: تشريح الأنسجة، والفحص المجهري متحد البؤر، والتصوير SBEM، SBEM ومتحد البؤر ارتباط الصورة، وتجزئة اليدوية. بالمقارنة مع الطرق المترابطة أخرى، فإن مفهوم بسيط إلى حد ما لأن الإرتباط المادي بدلا من المواد الكيميائية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

ترسيم التركيب الدقيق للخلية مهم لفهم وظيفتها. يمكن أن يكون هذا المشروع شاقة لأنواع الخلايا نادرة تنتشر في جميع أنحاء الأنسجة المصنوعة من أنواع الخلايا المختلفة، مثل الخلايا enteroendocrine من ظهارة الأمعاء. وكانت هذه المجسات الجهاز الهضمي من الطعام والبكتيريا من الصعب دراسة لأنها فرقت بين الخلايا الظهارية الأخرى بنسبة 1: 1000. مؤخرا، تم إنشاؤها الفئران المعدلة وراثيا مراسل لتحديد الخلايا enteroendocrine عن طريق مضان. واحد من هؤلاء هو الببتيد YY-GFP الماوس. باستخدام هذا الفأر، قمنا بتطوير طريقة لربط متحد البؤر والمسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني. أطلقنا على هذه الطريقة cocem3D وتطبيقه لتحديد خلية enteroendocrine محددة في الأنسجة وكشف النقاب عن التركيب الدقيق للخلية في 3D. حل cocem3D غير كافية لتحديد عضيات صغيرة مثل الحويصلات الإفرازية وللتمييز أغشية الخلايا لحجم إعادةndering. Cocem3D يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التركيب الدقيق 3D من أنواع معينة من الخلايا الأخرى في الأنسجة وطنهم.

تم استخدام أسلوب المقدمة هنا لدراسة التركيب الدقيق للخلية معينة داخل طبقة من ظهارة. الخلية من الفائدة في هذه الحالة هي الخلية enteroendocrine بعيد المنال. وقد تم التعرف عليهم في الموقع ممكنا إلا في السنوات القليلة الماضية مع تطور الفئران مراسل مضان خلية محددة. في عام 2011، وضعنا ماوس التي المروج من هرمون PYY يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء 17. في هذا PyyGFP الماوس، وتتميز الخلايا enteroendocrine في الجزء الأقصى من الأمعاء الدقيقة والقولون بسهولة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. كان هذا نموذج الفأر أساسا لتحديد كتلة الأنسجة التي تحتوي على خلية enteroendocrine وبمعالجة ذلك SBEM. يشار طريقة ارتباط هنا كما cocem3D وبنيت على البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 10،11. الاستفادة المثلى من أبعاد كتلة الأنسجة هو أمر حاسم لالارتباط. في التجارب الأولية،تقرر أن في كتلة الأنسجة 300 ميكرون طويل × 50 ميكرون سميكة يتم تقليل عدد الصور SBEM إلى أدنى حد ممكن في حين تغطي الجسم كله من الخلايا في المصالح. ويبين الشكل 1A يتجاهل من تشريح باستخدام تهتز شفرة microtrome ل الحصول على كتلة الأنسجة مع الأبعاد الصحيحة. ويتم الحصول على ما لا يقل عن 100 الكتل قبل الفرز من خلال لهم لاختيار تلك مع خلايا سليمة من الفائدة. يتم تصوير كتل اختيارها بواسطة المجهر متحد البؤر وصورة ض مداخن متباعدة بصريا كل 1 ميكرون (الشكل 1B و C). 1D الشكل يبين وجهة نظر المقدمة حجم خلية enteroendocrine في الدقاق من الفأرة. في neuropod بارزة تمتد تحت الخلايا الظهارية لل~ 60 ميكرون. تم العثور على خلية من الفائدة عن طريق الربط بين مبائر ض المداخن مع صورة SBEM من الوجه كتلة بأكمله. ويقدم مثالا هنا كتلة من القولون البعيدة من PyyGFPالماوس. بعد الحصول متحد البؤر Z-مداخن (الشكل 2A)، وجزءا لا يتجزأ من كتلة في طبقة رقيقة من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز (الشكل 2B). وهذا أمر ضروري للتلاعب لاحق من الكتلة. فمن المهم للحفاظ على التوجه للكتلة شقة ممكن لتتناسب مع شرائح الضوئية مع شرائح SBEM. في الشكل 2C، يظهر صورة ممثل من وجهه كله من كتلة الأنسجة. أجزاء من هذا الرقم وقد نشرت سابقا في Bohorquez وآخرون، 2014 (8). وكان ذلك مترابطا في وقت لاحق مع صورة مبائر مع الأخذ في الاعتبار معالم الأنسجة والأبعاد. ويبين الشكل 2D تراكب من متحد البؤر وSBEM صورة كتلة، وكشف عن الموقع الدقيق لدينا خلية من الفائدة. مرة واحدة وقد تم التعرف على الخلية، ويتم التصوير SBEM في قرار عالية بما فيه الكفاية لتحديد الحويصلات الإفرازية وعضيات الخلايا الأخرى. مجموعة البيانات قدم سعادةتم تصويرها في إعادة 7 نانومتر لكل بكسل كما تم التقاط صور من كتلة كل 70 نانومتر. مجموعة البيانات الواردة 643 الصور التي تمتد 45 ميكرون من عمق الأنسجة. وحلق بضعة ميكرونات أثناء التصوير الأولي من الوجه كتلة بأكمله في التكبير المنخفض. وقد اكتسب الخام مجموعة البيانات SBEM في .dm3 شكل وتحويلها إلى .tiff لمعالجة لاحقة. تم اقتصاص كومة SBEM باستخدام برنامج فيجي المساعد &quot;المحاصيل (3D)&quot; كتلة لتحتوي فقط على المنطقة من اهتمام. هذا يقلل من كمية الذاكرة RAM اللازمة لجعل حجم. تم التعرف على الخلية موقفها وحويصلات إفرازية، ومجزأة باستخدام برنامج Imaris الشكل 3 يحتوي على التقديم في 3D الخلية enteroendocrine. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> الشكل 1: المتلازم متحد البؤر المجهري (A) سير العمل لتشريح قطعة منالأنسجة المعوية في منديل كتلة 300 × 50 ميكرون سميكة. (B) كتلة النسيج التمثيلي للأبعاد الصحيحة. لاحظ أن كتلة الأنسجة من هذه الأبعاد من الأمعاء الدقيقة الماوس يمتد حوالي 3 الزغب أو، في حالة القولون حوالي 8 الخبايا. (C) وزغابة في الأمعاء الدقيقة تحتوي على خلية من الفائدة. (D) A متحد البؤر ض المكدس المقدمة في 3D باستخدام برنامج Imaris يظهر خلية enteroendocrine مع neuropod بارزة تعمل تحت ظهارة الأمعاء. الأزرق = دابي وصمة عار النووية. الحانات = 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> الشكل 2: كتلة وجه المسلسل المجهر الإلكتروني (A) صورة متحد البؤر من سيلي.المديرية كتلة من أنسجة القولون تحتوي على خلايا PyyGFP enteroendocrine (الأخضر) من الفائدة. (B) حالما يتم تصويرها الكتلة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، وجزءا لا يتجزأ من ذلك، ثم شقة في انخفاض ذوبان الاغاروز باستخدام الشرائح الزجاجية. تضمين كتلة الأنسجة في الاغاروز يسهل التلاعب لاحق، والشق في الزاوية اليسرى يساعد على جبل كتلة داخل SBEM في الاتجاه الصحيح. (C) SBEM صورة وجه الكتلة. (D) ارتباط البيانات مبائر مع SBEM لتحديد خلية من الفائدة (السهم الأبيض). يتم تعديل الصور في ج، د من هذا الرقم من Bohorquez وآخرون، 2014 8. الأزرق = دابي وصمة عار النووية. الحانات = 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> الشكل 3: بيانات جعلها في 3D (A) حجم جعل من خلية enteroendocrine باستخدام برنامج Imaris. تحتوي الخلية على neuropod محملة حويصلات إفرازية. للحصول على وصف كامل للالتركيب الدقيق للخلية enteroendocrine، يرجى الرجوع إلى Bohórquez وآخرون، 2014 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

متلازم متحد البؤر و3D المجهر الإلكتروني لخلية حسية معينة

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Video: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

الجمع بين الخلية الانقسامية المزامنة وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لدراسة دور البروتينات المتعددة الوظائف دورة الخلية أثناء الانقسام

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي بواسطة المجهر الإلكتروني الضوئي المترابط في المقطع

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

تصوير بيروكسيد الميتوكوندريا في خلايا الخميرة الحية باستخدام mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث الميتوكوندريا - mtHyper7 Biosensor للتحليل تحت الخلوي 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

تصوير mtHyPer7 ، وهو مستشعر حيوي نسبي لبيروكسيد الميتوكوندريا ، في خلايا الخميرة الحية

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...