Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

모든 동물 관리 및 실험은 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. Cocem3D는 이전에 발행 프로토콜 10,11의 조합으로부터 비롯 및 PyyGFP 리포터 마우스 (12)를 사용하여 특정 장 내분비 세포를 연구하기 위해 여기에 적용 하였다. 이 방법은 용이하게 상업적으로 이용 가능한 형질 리포터 생쥐를 이용하여 관심있는 다른 셀들에 적용될 수있다. 상호 공 초점 현미경, 시리얼 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBEM) 및 3D 렌더링에 데이터 : 상기 방법은 세 개의 섹션에 설명되어있다. 상호 공 초점 현미경 이 섹션의 목적은 상호 공 초점 및 SBEM 영상을 허용 차원의 원위부 대장에서 조직 세그먼트를 수확하는 것입니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다 1. 수확 조직 <ol><li> 준비PBS 중 50 μg의 / ㎖ 헤파린 용액 10 ㎖. </li><li> 10 케타민의 ㎖ (100 ㎎ / ㎖)과 자일 라진의 1 ㎖ (20 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 자일 라진 / 케타민 마취제 주식을 준비합니다. <ol><li> 0.1M PBS에 4 : 자일 라진 / 케타민 재고 1을 희석. </li></ol></li><li> PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 0.1 % 글루 타르 알데히드가 포함 된 고정액 용액 100 ㎖를 준비합니다. </li><li> 자일 라진 / 케타민 마취제의 치사량으로, 6-10주 된 PyyGFP 마우스를 마취. 마우스 무게 20g 당 0.15 ml의 복강 마취제를 주입한다. </li><li> 꼬리 또는 발가락을 곤란하게하여 적절한 마우스 마취를 확인하고 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 사용합니다. </li><li> 정착액 intracardially (10)를 관류하는 변수 흐름 연동 펌프를 사용합니다. 수술 가위를 사용하여 (13cm 길이) 컷 장, 심장, 폐를 노출 복강을 엽니 다. 좁은 패턴 곡선 집게 (12cm 길이)와 마음을 잡고 연동 펌프에서 나​​비 바늘 (19 G)를 삽입 전NTO는 뇌실을 떠났다. 즉시, 봄 직선 가위 (길이 4mm)과 우심방을 잘라. 2 ml의 속도로 관류 / 분 먼저 마우스의 꼬리까지 15 분 동안 빙냉 고착성 용액 후 헤파린 1 분 동안 용액과 함께 완전히 강성이다. 주 : 장 점막에 작은 용기의 파열을 방지하기 위해 느린 속도로 관류하는 것이 매우 중요하다. 혈관의 파열은 조직의 미세 구조를 손상됩니다. 관류가 적절한 경우, 간은 3 ~ 5 분 이내에 색상으로 연한 설정해야합니다. </li><li> 사용 작은 가위는 복강을 열고 원위부 직장에 맹장과 접합부에서 전체 대장을 절제. 얼음처럼 차가운 PBS에서 조직을 놓습니다. PBS에 잠겨있는 동안, 작은 스프링 가위 장간막 따라 대장을 오픈. </li></ol> 2. 조직 세그먼트를 해부 및 고정 <ol><li> 메스를 사용하여 원위 결장에서 약 6 작은 조직 세그먼트 (2 ㎜ × 2)를 자른다. 시트 O에서이 작업을 수행F 치과 왁스의 PBS 몇 방울에 빠져들. </li><li> 4 ° C에서 3 시간 동안 정착 용액에 조직 세그먼트를 포스트 - 수정. </li></ol> 3. 마이크로 해부 조직 블록 <ol><li> 아가 PBS에서 5 % 저 융점을 준비하고 45 ℃에서 수조에 보관. </li><li> 5 % 저 융점 아가로 오스 표준 크기 조직 테크 Cryomold 같은 작은 플라스틱 컨테이너를 사용하여 조직 세그먼트를 임베드. </li><li> 진동 블레이드 마이크로톰에 포함 된 섹션을 마운트하고 얼음처럼 차가운 PBS로 버퍼 트레이를 입력합니다. </li><li> 0.8 진폭 0.04 mm / sec의 속도로 300 μm의 조직 스트립을 잘라. 주 :이 시점에서, 조직 스트립은 아가 로스로부터 탈락된다. </li><li> 다시 포함 아가로 오스 300 μm의 조직 스트립을하​​고 vibratome의 블레이드에 수직으로 마이크로톰에 그들을 탑재합니다. </li><li> vibratome를 사용하여, 50 ㎛의 두께로 조직 스트립을 절단. 참고 : 최종 조직 블록이 약 300 ㎛ 폭 × 50 μm의 두께이어야한다. 이 Dimensions는 장 내분비 세포의 두께가 15 ~ 20 μm의 neuropod의 길이는 30 ~ 70 nm의 사이에있는 것으로 나타났다 파일럿 공 초점 실험에서 최적화되어 있습니다. 셀의 배향 조직 블록의 표면에 평행 한 경우, 따라서 전체 셀은 50 μm의 두께로 조직을 300 ㎛ 폭의 블록 내에 포함 할 수있다. 관심의 조직과 세포 유형에 따라 이러한 차원을 다릅니다. </li><li> 4 ° C에서 PBS에서 조직 블록을 저장합니다. </li></ol> 4. 공 촛점 이미징 <ol><li> 4,000 : 1 PBS에 DAPI를 희석하여 핵 얼룩 솔루션을 준비합니다. </li><li> 5 분 DAPI 핵 얼룩의 조직 블록을 품어. 참고 : DAPI 염색은 공 초점 및 SBEM 이미지의 상관 관계에 도움이 그들의 핵에 의해 구별 개별 셀을 용이하게한다. </li><li> 충전 된 유리 슬라이드에 장착 조직 블록은, PBS의 몇 방울을 추가로 커버 슬립 커버. </li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 블록을 식별그대로 융모 관심 PyyGFP 세포와 S와 Z-스택을 광학 섹션을 얻기 위해 그들을 군데. <ol><li> 1 μm의 광학 부분의 Z-스택을 얻기 위해 20X / 0.8 자이스 계획 고차 색지움 목표를 사용합니다. </li><li> Z-스택 들어, 다른 셀에 관계를 결정하기 위해 405 nm의 (DAPI)을위한 채널을 사용하여, 488 nm의 내생 GFP 관심 셀 국산화, 미분 간섭 대비 (DIC)은로 세포의 상대적인 위치를 결정 루멘. </li><li> 1,024 픽셀 이상의 이미지 해상도를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 아가로 오스 5. 임베딩 블록 <ol><li> PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 2.5 % 글루 타르 알데히드가 포함 된 고정액 10 ㎖를 준비합니다. </li><li> 신중 조직 블록을 손상시키지 않고 얻어 유리 슬라이드에서 커버 슬립을 슬라이드 커버 슬립의 가장자리에 PBS를 첨가하여 유리 슬라이드에서 조직 블록을 제거한다. 그런 다음, 1 슬라이드에서 조직 블록을 전송하는 미술 붓을 사용하여0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 2.5 % 글루 타르 알데히드 정착액을 포함하는 microcentrifuge 관. </li><li> 포스트 수정 조직 블록 O / N 4 ° C에서. </li><li> PBS로 조직 블록을 전송합니다. 그런 다음, 5 %는 두 개의 유리 슬라이드 사이에 그들을 끼워 아가 저 융점의 평면 블록을 포함. 주 : 아가로 오스의 얇은 층에 임베드 블록은 염색시 후방 조작을 용이. </li><li> 광장에서 아가로 오스를 잘라 위 편에 홈을 만든다. 주 :이 단계는 후속 단계에서 배향을 유지하기 위해 필요하다. </li><li> 추가 처리까지 4 ° C에서 PBS로 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 보관 블록. </li></ol> 직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경 (SBEM) 이 섹션에서는 조직 블록이 준비하고 낮은 배율로 SBEM으로 몇 군데. 블록 얼굴 이미지 조사는 관심있는 셀을 포함하는 영역을 식별하기 위해 공 초점 데이터와 상관된다. 지역 일단식별되고, 조직은 7 ㎚ / 화소, 70 nm 인 슬라이스의 해상도로 촬상된다. 이것은 해결하고 다른 세포 소기관에서 큰 밀도가 핵심 분비 소포를 구분하기에 충분했다. 장 내분비 세포에서 소포 이런 종류의 직경이 13 내지 100 nm 사이에 150 다릅니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다 6. 염색 조직 절편 <ol><li> PBS에서 조직을 제거하고 0.1 M cacodylate 버퍼에 세 번, 5 분 각각 린스. </li><li> 1 시간에 0.1 % 탄닌산 대 스테인 블록 세포막 (14)의 콘트라스트를 향상시키기 위해, 0.1 M cacodylate 완충액에 용해시켰다. </li><li> 게시 된 프로토콜 (11)에 따라 이후의 염색 및 조직의 탈수를 수행합니다. Deerinck 등을 다음과 같습니다. 프로토콜은 이러한 솔루션을 준비 : 1) 1 % (W / V) thiocarbonhydrazide (THC) 2) 아스 파르 테이트 솔루션을 선도; 3) 1 % 우라 닐 아세테이트, 4) 오스뮴 tetraoxyde / 황 혈염 (OSO 4 / K 페로). 4 % OSO 4 배 혼합1 [10 ML의 H 2 O에 K 페로과 0.86g 나 Cacodylate을 0.3g을] K 페로 재고 : 1 비율은 OSO 4 / K 페로을 확인합니다. 주 : 아가로 오스에 매립 조직을 갖는 염색 중에 취급을 용이하게한다. 조심스럽게 이후의 수지 침투에 대한 아가로 오스를 제거합니다. </li><li> 린스 후, 세 시료 0.1 M cacodylate 버퍼 시간, 5 분마다, 및 4 ℃에서 2 시간 동안 OsO4 / K 페로 용액으로 염색. </li><li> 60 ℃에서 30 분 동안 TCH와 초순수 세 번, 5 분마다, 그리고 얼룩에 씻어. </li><li> 실온에서 60 분 동안 2 % OSO 4 (NO K 페로)를 초순수에 세 번, 5 분 각각의 얼룩을 씻어. 초순수 다시 세 번, 5 분마다 린스. </li><li> 4 ℃에서 / 1 % 우라 닐 아세테이트 O와 N을 얼룩. 초순수에 세 번, 5 분마다 린스. </li><li> 60 ℃에서 30 분 동안 리드 아스 파르 테이트와 얼룩. 초순수에 세 번, 5 분마다 린스. </li><li> solutio에 세척하여 조직을 탈수에탄올의 농도가 증가함에 따라 NS. 50 %, 75 %, 85 %, 95 %, 및 절대 100 % 에탄올로 2 회, 각각 5 분간 린스. 끝에서 프로필렌 옥사이드로 2 회, 10 분간 각 섹션을 헹군다. </li></ol> 수지 7. 침투 및 포함 조직 섹션 <ol><li> 수지는 상업적 있음 키트를 사용하여 블록을 침투. EPON 임베딩 키트를 사용하여 수지에 포함 된 조직. 48 %의 에폭시 수지, 20 % DDSA ml의 30 % NMA 용액 및 2 % DMP30의 수지 혼합물을 준비한다. 5 분 동안 격렬 수지 혼합물을 교반하여 다음 기포 표면에 올 수 있도록 30 분 동안 진공 상태에서 혼합물을 놓는다. </li><li> 1 프로필렌 옥사이드와 수지를 혼합 : 1의 비율을 힘차게 흔들어. 조직에서 최종 탈수 린스를 제거하고, 프로필렌 옥사이드와 혼합 수지를 추가합니다. 회 전자의 O의 샘플과 장소 바이알 / N 및 유리 병 상한선을 둡니다. 다음 날, 갓 EPON 수지를 추가 한 회에 90 분 동안 혼합한다. </li><li> 그들을 끼워 가능한 평면 수지에 포함 된 블록서로 (15)에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 액체 이형제 경화 된 유리 슬라이드 사이. </li><li> 블록이 평탄 매립되면, 60 ° C에서 48 시간 동안 첨가 블록을 경화. </li><li> 블록을 해제 떨어져 슬라이드를 당깁니다. </li></ol> 8. 설치 및 이미지에 대한 조직 블록을 트리밍 <ol><li> 해부에서 블록 트리밍 전에 관심있는 세포를 포함하는 영역을 식별 용이하게하기 위해 공 초점 현미경의 것과 수지에 매립 조직 블록의 방향과 일치. </li><li> 수동으로 다운 ~ 500 X 500 μm의 블록 얼​​굴에 수지 포함 된 블록을 낸다. </li><li> 30 분 동안 전도성 에폭시 및 건조를 포함하는 핀에 평면 블록을 탑재합니다. 그런 다음, 60 ℃에서 표면 건조 O / N의 블록 평면 배치. </li><li> 코트 콜로이드 실버 액체와 블록. CO를 용이하게하기 위해 직각 블록의 슬라이싱을 위해 조직 절편 평면 유지직렬 블록 얼​​굴과 공 초점 현미경을 rrelating. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> 이미지 SBEM 시스템이 장착 된 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 블록 (E · G., 3View). </li><li> 설정 초기 두께 ~ 2 μm의 단위에서 부와 조직의 얼굴이 블록에서 나온다까지 잘라. </li><li> 전체 블록 얼​​굴의 surver 이미지를 획득. </li><li> 피지 소프트웨어를 사용하여, 정착시 16 염색 샘플 워핑위한 공통 분모와 계정을 생성하도록 직렬 블록 얼굴 및 공 촛점 현미경 모두의 측정을 수행. </li><li> 공 초점 이미지의 좌표에 분모를 곱하여 블록의 얼굴에 관심 영역을 찾습니다. 참고로, 미세 융모, 술잔 세포, 또는 고유 층의 위치와 같은 다른 구조적 특징을 사용합니다. </li><li> 이자의 이미지 영역 2.25 kV의 높은 진공 모드에서 7 nm의 / 픽셀 (또는 15,147X 배율). 슬라이스 단위로 설정해야합니다70 nm 이하에서. </li><li> 원시 16 비트 .dm3 형식 SBEM 데이터를 수집합니다. </li></ol> 표면 분할 10. 최적화 SBEM는 이미지 <ol><li> 8 비트 티파니 원시 .dm3 형식에서 SBEM 이미지를 변환합니다. </li><li> 피지에서 0.8 가우스 흐림 필터를 사용하여 이미지를 .TIFF 필터링합니다. </li><li> 원래 크기의 25 %로 설정 데이터를 스케일과 세트를 처리하기 위해 필요한 RAM 메모리의 양을 최소화 .TIFF 스택으로 저장. </li><li> 변환 모드에서 피지 플러그인 &quot;SIFT와 선형 스택 정렬&quot;을 사용하여 SBEM 이미지의 스택을 맞추고 &quot;작물 3D&quot;플러그인을 사용하여립니다. 주 : 상기 분할 자르기 및 볼륨 렌더링을 위해 필요한 RAM 메모리의 양을 감소하는 데 도움이. </li></ol> 3D의 데이터 렌더링 11. 공 초점 현미경 <ol><li> 자동이 &quot;면&quot;도구의 모드를 능가하여 Z-스택을 재구성. 그림 1D는, REC를 보여줍니다절대 강도로 0.126 μm의에서 표면 영역의 세부 사항에 부드러운 옵션을 사용하여 각 채널의 onstruction 및 임계 값. </li></ol> 12. 직렬 블록 얼​​굴 SEM 참고 : 수동 데이터 분할은 매우 시간 소모적 인 절차와 몇 주가 걸릴 수있는 절차를 렌더링 할 수있는 기능에 따라입니다. Bohórquez 등의 알에 제시된 비디오와 그림 분할. 2014 8은 수동으로 수행과 노동의 약 500 시간을 걸렸다. 그것은 분할 프로세스를 시작하기 전에 렌더링을 필요로하는 필수 기능의 우선 순위를하는 것이 좋습니다. 절차는 다음과 같다 : <ol><li> 그리기 모드에서 &quot;면&quot;도구와 관심의 셀을 렌더링 수동 세그먼트와 볼륨에 50 밀리의 드로잉 모드에서의 &quot;윤곽&quot;옵션을 사용합니다. </li><li> 부드러운 렌더링 또는 빠른 렌더링을 위해 매 5 조각의 셀의 모든 조각에 윤곽을 추적합니다. </li><li> 수출 최종 메신저300 DPI 이상의 해상도에서 &quot;스냅 샷&quot;툴을 사용하여 세. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

박사 사티 Medicetty은의 직원과 Renovo 신경 Inc의에서 100 % 급여를 수신 그러나,이 데이터를 공유 및 재료에 조브 정책에 대한 저자의 준수를 변경하지 않습니다. 관심 없음 충돌이 남아있는 저자 선언되지 않습니다.

<html> 위장 chemosensation는 생물 의학 연구에서 흥미로운 새로운 분야로 부상하고있다. 이는 장 내분비 세포 (18)의 기능적 미각 수용체의 발견으로 큰 부분이다. 후속 연구는 장 내분비 세포가 탄수화물, 지질 및 아미노산 5,6,19,20를 포함하여 영양소, 특정 수용체를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견을위한 촉매 요소는 장 내분비 세포가 형광 물질 (20)로 표시되는 리포터 마우스의 개발이었다. 우리는 원위부 소장과 대장 17,21의 장 내분비 세포를 연구하기 위해,이 마우스 하나, PyyGFP 마우스를 개발했다. 그들은 물림 22,23 유도제이다 둘 PYY 및 글루카곤 유사 펩티드 1 분비 때문에 이러한 세포는 관심이다. 당시,이 세포의 전체 초 구조 계정은 우리가 그들의 신호 메커니즘을 이해하는 것이 필수적 생각하는, 누락되었습니다. &quot;ontent은&gt; 여기에서, 우리는 SBEM와 공 초점 현미경을 해소하기 위해 시각적 방법을 설명했다. 방법은 우리가 장 내분비 세포의 전체 미세 구조를 문서화 할 수 있습니다. 우리는이 세포가 3 ~ 포함 neuropod이보고 한 허용 Cocem3D로 불린다 세포를 장 내분비이 neuropods 물리적 뉴런에 연결하지만 분비 소포 8의 모든 분기. neuropod 내에서이 neurofilaments 및 신경 축삭 같은 많은있다, neuropods이 장 신경 교세포 (8)에 의해 양육된다. 더 중요한 것은이 장을 지배하는과 콜론 9. cocem3D의 장점 중 하나는 단순하다. 공 초점에 의해 촬영하고 SBEM은 조직 내의 특정 셀의 식별을 용이하게 할 수있는 블록에 조직 샘플을 감소시킨다. 분비 소낭 및 다른 소기관 7 ㎚ / 화소의 해상도를 용이하게 식별 될 수있다. SBEM의 섹션이 폐기되기 때문에, 추가로 사전 처리특정 단백질을 식별하기 위해 조직의 노래하는 것은이 시점에서 옵션을 선택하지 않습니다. 그러나, 조직 블록으로부터 부분이 보존되는 아툼 (24) 등의 방법의 개발, 셀 내의 특정 단백질의 식별을 가능하게 할 가능성이있다. 장 내분비 세포는 뇌의 포만 창자 음식 간의 인터페이스 감각 때문에 장 내분비 세포에 화학 감각 수용기의 특정 위치를 결정하는 것은, 비만 약물 요법의 개발에 필수적인 정보이다.

세포 내 인생은 시간과 공간에서 일어난다. 경시 변화는 종종 초해 현미경 같은 형광 이미징 기술과 결합 경과 현미경을 사용하여 연구된다. 공간은, 세포 또는 세포 간 상호 작용 내부 소기관의 배열, 특히, 단지 셀의 미세 구조의 전체 계좌에 의해 유도 될 수있다. 셀의 미세 구조의 광범위한 계정은 C. 같은 유전체를 사용할 경우에 게놈 기능 선명 해 엘레 선충 1 평면 placozoa의 tricoplax는 2 adherens. 직렬 단면 전자 현미경 해주기 효율적인 재현성, 시간 및 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경 (3) (SBEM) 같은 자동화 된 3 차원 전자 현미경 기술의 개발, 덜 비싼 태스크 덕분이다. 기능을 규명하는 구조 정보의 필요성은 특정 CEL 매우 분명하다이러한 뉴런, 아교 세포, 또는 감각 상피 세포와 같은 기능이 물리적 세포 간 상호 작용에 따라 L 타입. 우리는 창자의 루멘의 영양소에서 감각 신호가 궁극적으로 appetitive 행동을 조절하는 전기 신호로 형질 도입하는 방법을 아는데 특히 관심이 있습니다. 회로는 복잡하지만 영양분 감각 상피 세포라는 장 내분비 세포와 접촉 여기서 소장의 벽에서 시작한다. 이러한 미각 세포 등의 다른 감각 상피 세포와 달리, 장 내분비 세포는 천 4-7 하나의 비로 창자 상피 전반에 걸쳐 분산된다. 결과적으로, 그들은 식별하고 연구하기 어려웠으며, 오랜 시간 동안 그들은 단지 소화관 호르몬의 소스로 간주 하였다. 그러나 셀 고유 형광 리포터 생쥐의 발달이 세포의 복잡한 감각 기능이 등장하고있다. 이 기자 마우스 중 하나, 펩티드 YY-GFP (PyyGFP) 마우스를 사용하여, 우리는 그 enteroendocr 발견오프라인 세포는 우리가 neuropod라는 저명한 세포질 꼬리를 가지고있다. neuropods의 외관은 세포 간 통신에 보존 된 기능을 제시 하였다. 그러므로, 우리는 장 내분비 세포의 미세 구조를 문서화하여 neuropods의 함수가 유도 될 수 있음을 추론했다. 식별하기 어려운 분산 셀 부속물의 구조를 이해하기 위해 필요 공 초점 현미경과 SBEM을 결합하는 방법을 개발하기위한 주된 이론적 근거이다. 관심 셀 PyyGFP 장 내분비 세포 특이 리포터 생쥐를 이용하여 확인 하였다. 이 방법은 우리가 장 내분비 세포와 neuropod의 전체 미세 구조를 문서화하는 것을 허용했다. neuropods 내에서, 우리는 신경 세포의 축색 돌기의 구조적 특징을 발견하고, neuropods 외부, 우리는 장 아교 세포 (8)에 대한 물리적 관계를 발견했다. 실제로, neuropods 이러한 세포의 분비 기능에 필수적인 역할을 제안 모든 분비 소포의 약 70 %가 포함되어 있습니다. 에 구축구조적 데이터는보다 최근 우리는 이러한 neuropods 통해서, 장 내분비 세포와 뉴런 직감 혀의 미각 8,9 세포의 것과 유사한 neuroepithelial 회로를 형성 지배하는 것을 발견했다. 구조적 데이터에서 비롯 위장 화학 감각 메커니즘 등의 기능을 폭로하는 것은이 상호 현미경 방법을 사용하여 모였다. 우리는이 방법은 세포가 매우 낮은 비율로 조직 내에서 분산 특히 세포 생물학의 다른 분야에서 유용하게 사용될 수 있으리라 생각합니다. 우리는 3D (Cocem3D)에 상관 공 초점 및 직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경 등의 방법이라고. 방법은 다음과 같은 주요 단계로 구성되어 조직의 절개, 공 초점 현미경, SBEM 영상, SBEM 및 공 초점 이미지의 상관 관계 및 수동 분할을. 상관이 아닌 물리 화학적 상호 때문에 다른 방법에 비해, 개념은 비교적 간단하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

셀의 미세 구조의 묘사는 그 기능을 이해하는 것이 중요하다. 여기에는 장 상피의 장 내분비 세포 등 다양한 세포 유형, 만들어진 조직 전반에 걸쳐 확산 드문 세포 유형에 대한 발굴 프로젝트가 될 수 있습니다. 1000 : 그들은 1의 비율로 다른 상피 세포 사이에 분산되어 있기 때문에 음식과 세균이 위장 센서 공부하기 어려운되었습니다. 최근, 트랜스 제닉 리포터 생쥐 형광 의해 장 내분비 세포를 식별하기 위해 생성되었다. 그 중 하나는 펩티드 YY-GFP 마우스이다. 이 마우스를 사용하여, 우리는 촛점과 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경을 상관하는 방법을 개발 하였다. 우리는 방법 cocem3D 이름과 조직의 특정 장 내분비 세포를 식별하고 3D로 세포의 미세 구조를 공개하는 데 적용. cocem3D의 해상도 볼륨 RE에서 세포막을 분비 소낭 작게 소기관를 식별하고 구별하기에 충분ndering. Cocem3D 쉽게 그 나라의 특정 조직에서 다른 세포 유형의 3 차원 미세 구조를 연구하기 위해 적응 될 수있다.

여기에 제시된 방법은 상피 세포의 층 내의 특정 셀의 미세 구조를 연구하기 위해 사용되었다. 이 경우, 관심있는 세포는 어려운 장 내분비 세포이다. 원위치에서의 식별은 셀 고유 형광 리포터 생쥐의 개발 지난 몇 년간 가능했다. 2011 년에는 호르몬 PYY의 프로모터는 녹색 형광 단백질 17의 발현을 구동하는 마우스를 개발했다. 이 PyyGFP 마우스에서 소장과 대장의 말단 부분의 장 내분비 세포는 쉽게 자외선에서 구별된다. 이 마우스 모델은 장 내분비 세포를 함유하는 조직 블록을 식별하고 SBEM 위해 그것을 처리하도록 재단 하였다. 상관 방법은 cocem3D 여기라고하고 이전에 출판 프로토콜 10, 11에 지어졌다. 조직 블록의 크기를 최적화하는 것은 상관 중요하다. 예비 실험에서,그것이 관심 셀의 몸 전체를 덮으면서 조직 블록에서 300 μm의 긴 × 50 μm의 두께 SBEM 이미지의 수를 최소한으로 감소된다는 것을 결정 하였다.도 1a는 진동 블레이드 microtrome로를 사용하여 해부의 간과를 도시 오른쪽 치수 조직 블록을 얻었다. 적어도 100 블록은 관심의 손상 세포를 가진 사람을 선택하는 그들을 통해 정렬하기 전에 얻을 수있다. 선택된 블록이 공 초점 현미경 및 이미지 Z-스택에 의해 촬영되는 광학적마다 1 ㎛ (그림 1B 및 C)를 이격되어있다. 그림 1D 마우스의 회장의 장 내분비 세포의 볼륨 렌더링 뷰를 보여줍니다. 그 유명한 neuropod는 ~ 60 μm의에 대한 상피 세포 아래에 확장합니다. 관심 셀 블록 전체 얼굴 SBEM 이미지와 공 초점 Z-스택들을 상관시킴으로써 발견된다. 예 PyyGFP의 원위부 대장에서 블록으로 여기에 제시쥐. 촛점 Z - 스택 (도 2A)를 얻은 후, 블록은 저 융점 아가로 오스의 얇은 층 (도 2b)에 내장된다. 이 블록의 후속 조작이 필요하다. 그것은 SBEM 슬라이스 광학 슬라이스 일치 최대한 평탄한 블록의 방향을 유지하는 것이 중요하다. 도 2c에서, 대표 화상은 조직 블록의 얼굴 전체의 도시된다. 이 그림의 일부가 이전에 Bohorquez 등의 알에 발표되었다. 2014 년 8. 이것은 이후에 계정 조직의 랜드 마크와 크기를 고려하여 공 초점 이미지와의 상관 관계를 보였다. 그림 2D는 계시, 블록의 공 초점 및 SBEM 이미지의 오버레이를 보여줍니다 관심의 우리의 세포의 정확한 위치. 셀이 식별되면, SBEM 촬상 소포는 분비하고 다른 세포 소기관을 식별하기에 충분히 높은 해상도로 수행된다. 데이터 세트는 그 제시블록의 이미지는 모든 70 나노 미터를 찍은 것처럼 다시는 픽셀 당 7 nm에서 이미지화했다. 데이터 세트는 조직 깊이 45 μm의 스팬 (643)의 이미지를 포함 하였다. 마이크론은 낮은 배율에서 전체 블록 얼​​굴의 초기 이미징 동안 면도있다. 원시 SBEM 데이터 세트는 .dm3 형식으로 취득 및 후속 처리를 위해 티파니로 변환되었다. SBEM 스택은 관심의 영역을 포함하도록 피지 소프트웨어 플러그인 &quot;자르기 (3D)&quot;블록을 이용하여 자른 하였다. 이것은 볼륨 렌더링에 필요한 RAM 메모리의 양을 감소시킨다. 셀 위치 및 분비 소낭에 의해 식별 및 Imaris 소프트웨어를 사용하여 분할 하였다. (3) 장 내분비 세포에서의 3D 렌더링을 포함 도표. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> 그림 1 :. 상호 공 초점 현미경 () 워크 플로우의 조각을 해부하다조직에 장 조직은 300 × 50 μm의 두께를 차단합니다. (B) 오른쪽 치수의 대표 조직 블록. 쥐 소장에서 이러한 치수 조직 블록 결장 약 8 소낭의 경우, 약 3 또는 융모 걸쳐 유의. 관심의 세포를 함유하는 소장 (C) 융모. Imaris 소프트웨어를 사용하여 3D로 렌더링 (D) 공 촛점 Z - 스택은 눈에 띄는 neuropod이 장 상피 아래에 실행하는 장 내분비 세포를 보여줍니다. 블루 = DAPI 핵 얼룩. 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> 그림 2 : 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 (A) 실리의 공 초점 이미지.관심 PyyGFP 장 내분비 세포 (녹색)를 포함 콜론에서 cted 조직 블록. 블록은 공 초점 현미경에 의해 촬상되면, (B)는, 그 다음, 아가 로스 유리 슬라이드를 이용하여 저 융점의 평면 매립. 아가로 오스의 조직 블록을 포함하면 이후의 조작을 용이하게하고, 왼쪽 모서리에있는 홈이 오른쪽 방향으로 SBEM 내에서 블록을 탑재하는 데 도움이됩니다. 블록의 얼굴의 (C) 화상 SBEM. SBEM와 공 초점 데이터 (D)의 상관 관계는 관심 (흰색 화살표)의 셀을 식별합니다. C와이 그림의 D에서 이미지 Bohorquez 등.에서 수정 된 2014 년 8. 블루 DAPI 핵 얼룩을 =. 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> 그림 3 :. Imaris 소프트웨어를 사용하여 장 내분비 세포의 데이터가 3D로 렌더링 () 볼륨 렌더링. 세포가 분비 소포로 포장 neuropod가 포함되어 있습니다. 장 내분비 세포의 미세 구조에 대한 자세한 설명은 Bohórquez 등. 2014 년 8을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K 조회수.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

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Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

연구

생물학

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

mtHyper7을 사용한 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 과산화물 이미징

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 연구의 발전 - 세포 내 분석을 위한 mtHyper7 바이오센서 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...