وأيد هذه الدراسة من قبل سيول القومي للبحوث منحة جامعة (800-20140542)، وبرنامج الرواد بحوث جبهة الخلاص الوطني / MEST (2012-0009544)، وبرنامج بيو الإشارة تحليل التكنولوجيا والابتكار من جبهة الخلاص الوطني / MEST (2009-0090895)، ومنح جبهة الخلاص الوطني / MEST (2015M3A9E6028949).

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للجمعية للبحوث في بيان الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية، والمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لجنة رعاية جامعة المؤسسي الحيوان واستخدام سيول الوطنية وسيول الوطنية لجنة السلامة الأحيائية مستشفى الجامعة. 1. إعداد حقن كيت والفيروسية المتجهات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حقنة ميكروليتر مجهزة إبرة 33 G حادة تعقيمها باستخدام غاز أكسيد الإيثيلين. تمييع ناقلات فيروسية في برنامج تلفزيوني لعيار كاف في أنبوب الجزئي (أي 1 × 10 6 TU / ميكرولتر). تدفق الحقنة عدة مرات مع ناقلات فيروسية لإزالة أي الفضاء الميت في المحقنة. </li></ol> 2. حقن تحت الشبكية الفيروسية المتجهات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران البالغة (أي 6-8 أسابيع من العمر) مع حقن داخل الصفاق من خليط من tiletamiشمال شرق وzolazepam (1: 1، 2.25 ملغ / كغ من وزن الجسم)، وهيدروكلوريد زيلازين (0.7 ملغم / كغم من وزن الجسم) أو نظام التخدير مناسب بديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمدد التلاميذ مع قطرة العين من فينيليفرين 0.5٪ و 0.5٪ تروبيكاميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حقنة ميكروليتر عن طريق تحميل مع 1،5-2 ميكرولتر من ناقلات فيروسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجفن وتبرز العين للكشف عن خط الاستواء للحقن مريحة والتركيز على تحت المجهر التشغيل. الحفاظ على موقف العين يبرز حتى الانتهاء من الحقن، أو النزوح من الإبرة يمكن أن تحدث أثناء الحقن. عقد مقلة العين بقوة، ضع أصابع خارج حافة المدارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قطرة من محلول اللزجة العيون إلى سطح القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء الشريحة جولة صغيرة على الجزء العلوي من القرنية لتصور شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب ثقب صغير في مؤخرة طفيفة في حوف باستخدام العقيمة 30 G 1/2 إبرة لحقن تحت الشبكية آخر. جعل ثقب أقل شأنا FOص العين اليمنى، ومتفوقة للعين اليسرى للراحة. ملاحظة: إذا تم إجراء ثقب في الزمانية أو الأنف، فإنه من الصعب أن تكون مشمولة الجفن بعد الحقن. وينبغي بذل ثقب الأولي قليلا الخلفي لحوف لتجنب الأوعية الحوفي التي تمتد على طول حوف، ويمكن التعرف عليه بسهولة. كن حذرا لتجنب ضرب العدسة مع إبرة في حين جعل ثقب الأولي. لا تضاف شطبة كامل من الإبرة إلى تجنب عدسة ثقب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إبرة 33 G حادة من ميكروليتر حقنة من خلال ثقب ما قبل ثقب والاقتراب من الإبرة في الفضاء تحت الشبكية حتى هذه النقطة عندما يشعر مقاومة خفيفة. ملاحظة: بالنسبة للحقن تحت الشبكية، وأفضل زاوية اقتراب الإبرة حوالي 45 درجة ضد طائرة القزحية، وينبغي دفع إبرة حادة من الخلف نحو منطقة بالحليمة. وأشار مربع منقط مسار الإبرة اقترح عبر تجويف الجسم الزجاجي للinjectio تحت الشبكيةن في الشكل 1. ملاحظة: لن يكون هناك أي مقاومة عندما رأى ثقب (أو تمرير) طبقات الشبكية كما أنها لينة جدا. وبالتالي، فإن الشعور الأول للمقاومة خفيفة يشير إلى أن الإبرة وقد لمست بالفعل طبقة RPE ويجب أن يتوقف إدخال الإبرة. يجب الحرص على عدم اختراق الأنسجة صلبوية مع الضغط المفرط أنه يجب أن توضع الإبرة في الفضاء تحت الشبكية المحتملين. إذا كانت إبرة يثقب الأنسجة صلبوية بالقوة المفرطة، فإنه يدخل في المساحات المدارية المقلة دون مقاومة. (هذه الخطوة الحاسمة) </li></ol><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> الشكل 1. الرسم التخطيطي للحقن تحت الشبكية. H &amp; E الملون المقطع العرضي للعين الماوس تصور هياكل مع مسار إبرة لحقن تحت الشبكية ملحوظ (مربع منقط). التكبير: 40X، مقياس شريط:<html> 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن النواقل الفيروسية (أي 1 × 10 6 TU / ميكرولتر) بلطف في الفضاء تحت الشبكية دون الزلزال لتجنب تلف الأنسجة غير المرغوب فيها وسحب الإبرة بلطف. عقد مقلة العين بقوة خلال الحقن كما هو موضح في 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلاحظ تشكيل فقاعة تحت الشبكية بعد الحقن تحت المجهر التشغيل للتأكد من عدم وجود نزيف في شبكية العين. </li></ol><img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> ويبين الشكل 2. تحت الشبكية Belb تشكيل الشبكية دون نزف. عرض المجهري للbelb تحت الشبكية بعد الحقن تحت الشبكية تحت المجهر التشغيل تشكيل فقاعة ناجحة دون نزيف في شبكية العين.م / ملفات / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إغلاق الجفن لتغطية موقع الحقن لمنع تسرب الذاتي. عودة الفئران إلى قفص المنزل والحفاظ على قيد الحياة حتى التقييم. ملاحظة: بعد التعود الباحثون إلى الإجراءات ويتمكنوا من الحصول على نتائج قابلة للتكرار مع إجراءات سريعة من خلال تخطي هذه الخطوات (2.5 و 6 و 10) </li></ol> 3. تقييم فعالية من الجينات التسليم في الشبكية الظهارة الصبغية <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران في غرفة CO 2. استأصل العينين باستخدام المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح العيون في حل بارافورمالدهيد 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل 1 ساعة إلى عدة أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على القرنية مع ملقط غرامة وثقب القرنية مع مقص الصغرى. إزالة القرنية بعد استخدام المقص على طول حوف. إزالة العدسة مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم الجسم الهدبي مع مicro مقص السماح انفصال الشبكية. سحب بلطف شبكية العين كلها من / المشيمية / مجمع الصلبة RPE. قطع RPE / المشيمية / مجمع الصلبة شعاعيا من المحيط إلى المركز بالقرب من العصب البصري عدة مرات لجعل 4-8 أوراق لتركيب مسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه RPE / المشيمية / مجمع الصلبة لجعل الجانب RPE أسفل، وتقليم كل ما تبقى من الأنسجة في الجانب الصلبة بما في ذلك العضلات والملتحمة والعصب البصري. هذه الخطوة مهمة لجعل RPE / المشيمية / مجمع الصلبة شقة لأن أي نوع من الأنسجة المتبقية يجعل متفاوتة التعقيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المجمع مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية لأغراضك بحثية محددة (اختياري، راجع المراجع لأساليب مفصلة). شقة-جبل RPE / المشيمية / مجمعات صلبوية على شريحة زجاجية واستيعاب PBS مع الاسفنجة الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من محلول تركيب ووضع الشريحة الغطاء. مراقبة العينة لفعالية تسليم ناقلات تحت المجهر فلوريسئين. الحفاظ على العينات فيالثلاجة لمزيد من المراقبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li><li>Conlon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+potency+and+safety+studies+of+an+AAV2-mediated+gene+therapy+vector+for+the+treatment+of+MERTK+associated+retinitis+pigmentosa.">Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).</li><li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy+in+patients+with+choroideremia:+initial+findings+from+a+phase+1/2+clinical+trial.">Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial.</a> Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).</li><li>Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+platforms+for+gene+therapy+of+inherited+retinopathies.">Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies.</a> Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).</li><li>Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+delivery+of+recombinant+virus.">Intraocular delivery of recombinant virus.</a> Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).</li><li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents.">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li><li>Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+model+in+rodents+by+subretinal+injection+of+sodium+hyaluronate.">Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li><li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina.">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932 (2014).</li><li>Sahel, J. A., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+blindness.">Gene therapy for blindness.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).</li><li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors.">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector.">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li><li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy:+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium.">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li><li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium.">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li><li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina.">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li><li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration.">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration.">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice.">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li><li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity.">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذه المقالة الفيديو، وصفنا تقنية الحقن تحت الشبكية النهج الحوفي في التفاصيل مع نتائج ممثلة من RPE / المشيمية / الصلبة شقة جبل. هذا هو أسلوب سهلة ومريحة للحقن تحت الشبكية من ناقلات فيروسية في RPE. التصور المباشر لتشكيل فقاعة خلال الحقن هو خطوة هامة لتسليم دقيقة للمبتدئ?...

في طب العيون، برزت العلاج الجيني باعتباره طريقة العلاج في retinopathies الموروثة أحادية المنشأ. هناك retinopathies المرتبطة الموروثة الجينات في شبكية العين الظهارة الصبغية (RPE) بما في ذلك يبر amurosis الخلقية 1،2، التهاب الشبكية الصباغي 3، وتنكس المشيمية 4. مجال أبحاث العلاج الجيني تتوسع في كل من الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية باستخدام ناقلات فيروسية مثل فيروس الغدة -associated (AAV)، الفيروسة البطيئة (LV) واتش (الإعلان) 5. النواقل الفيروسية المختلفة لها مع الأجسام مختلفة في شبكية العين. لالعلاج الجيني آمنة وفعالة، ناقلات فيروسية ينبغي اختيار بعناية وفقا لالخلايا المستهدفة والجينات المستهدفة. مسار توصيل الجينات مهم أيضا لتوصيل الجينات فعالة لاستهداف الخلايا، وبالتالي، فإنه ينبغي اختيار بعناية أيضا. وsubret الأساليب الأكثر شيوعا اثنين للتسليم العين من ناقلات فيروسيةحقن إينال وحقن intravitreal 6. هذا الأخير، حقن intravitreal، وقد استخدم على نطاق واسع لتسليم المخدرات لعلاج اتساع الأوعية الدموية المشيمية في الرطب الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، وذمة البقعة الصفراء في اعتلال الشبكية السكري 7. يوفر الطريق Intravitreal تعرض ناقلات فيروسية لشبكية العين الزجاجية والداخلية، ولكن انتشار ناقلات لشبكية العين الخارجي محدودة. من ناحية أخرى، والطريق تحت الشبكية يوفر النقل المباشر للناقلات فيروسية إلى الفضاء المحتمل بين شبكية العين وRPE، الأمر الذي أدى إلى فقاعة محلية. ولذلك، يعتبر الحقن تحت الشبكية حاليا طريقا أكثر كفاءة لاستهداف خلايا مستقبلة للضوء وRPE. من حيث النهج الجراحية، بارس يتم اختيار مسطح كمنطقة آمنة للحقن intravitreal لتجنب الضرر شبكية العين في المرضى من البشر. ببساطة عن طريق تعديل هذا النهج على الفئران، فإننا لا يمكن حقن ناقلات فيروسية subretinally أو intravireally عبر نهج الحوفي. في هذا الفيديوالمادة، علينا أن نظهر وسيلة سهلة ومريحة للحقن تحت الشبكية من ناقلات فيروسية في الفئران RPE. بعد ثقب واحد في الخلفية لحوف مع 30 G 1/2 إبرة، يتم إدخال إبرة حادة G 33 ميكروليتر تجهيز الحقنة في الفضاء تحت الشبكية عبر موقع ثقب الحوفي. يتم حقن 2 حجم ميكرولتر إلى الفضاء المحتمل بين شبكية العين وRPE إحداث الفقاعات تحت الشبكية - ناقلات فيروسية 1.5. ويمكن تنفيذ هذا الإجراء في إطار رؤية مباشرة باستخدام الميكروسكوب الجراحي. والممارسة المتكررة يضمن النتائج القابلة للتكرار حتى من دون رؤية مباشرة لتشكيل فقاعة. وهذا سوف يساعد الباحثين على إجراء تجارب دقيقة وللوقت لتوصيل الجينات في الفئران تحت الشبكية RPE.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS Scissors S/S, 105mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555583S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33G Blunt needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NF33BL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Syringe, 10 microliter&#160;</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-KIT</td>
			<td>WPI</td>
			<td>RPE-KIT</td>
			<td>For easy one hand injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305107</td>
			<td>Initial puncture for subretinal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720&#160; (CS-3R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica operating microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LM M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresecein microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>TMO.LV-Ctr</td>
			<td>Used to dilute vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Used to dilute vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%)</td>
			<td>Hanmi</td>
			<td></td>
			<td>For dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile)</td>
			<td>Bausch&#38;Lomb</td>
			<td></td>
			<td>For topical anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Healon GV OVD</td>
			<td>Abbott Medical Optics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>For general anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun&#174; injection (Xylazine HCl)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>For general anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

لتقييم فعالية حقن تحت الشبكية على الفيروسية تنبيغ الجينات بموجب هذا البروتوكول، استخدمنا المتاحة تجاريا ناقلات LV مع CMV المروج التعبير عن كل GFP وطلب تقديم العروض للمؤشر. ومنزوعة النواة العينين بعد الفترة الزمنية المناسبة وفقا للغرض البحث. للحصول على نتائج التمثيلية،...

Watch this Scientific Journal Video about Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

الحوفي-النهج تحت الشبكية حقن الفيروسية المتجهات للعلاج الجيني في الفئران الشبكية الظهارة الصبغية

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

limbal-approach-subretinal-injection-viral-vectors-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.9K Views.  Seoul National University College of Medicine. Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Video: Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide range of neurological and psychiatric disorders, and memory enhancement in age-related cognitive decline and neurodegenerative diseases. We describe a laboratory protocol for transcranial photobiomodulation therapy (PBMT) in mice. Aged BALB/c mice (18 months old) are treated with a 660 nm laser transcranially, once daily for 2 weeks. Laser transmittance data shows that approximately 1% of the incident red light on the scalp reaches a 1 mm depth from the cortical surface, penetrating the dorsal hippocampus. Treatment outcomes are assessed by two methods: a Barnes maze test, which is a hippocampus-dependent spatial learning and memory task evaluation, and measuring hippocampal ATP levels, which is used as a bioenergetics index. The results from the Barnes task show an enhancement of the spatial memory in laser-treated aged mice when compared with age-matched controls. Biochemical analysis after laser treatment indicates increased hippocampal ATP levels. We postulate that the enhancement of memory performance is potentially due to an improvement in hippocampal energy metabolism induced by the red laser treatment. The observations in mice could be extended to other animal models since this protocol could potentially be adapted to other species frequently used in translational neuroscience, such as rabbit, cat, dog, or monkey. Transcranial photobiomodulation is a safe and cost-effective modality which may be a promising therapeutic approach in age-related cognitive impairment.

Photobiomodulation therapy is an innovative noninvasive modality for the treatment of a wide range of neurological and psychiatric disorders and can also improve healthy brain function. This protocol includes a step-by-step guide to performing brain photobiomodulation in mice by transcranial light delivery, which can be adapted for use in other laboratory rodents.

بروتوكول للعلاج Photobiomodulation Transcranial في الفئران

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

في فيفو إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الغلية المقيمة في الخلايا العصبية المشتركة عن طريق الحقن داخل الدماغ من ناقلات الفيروسية

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging

Begin by securing the anesthetized mouse onto a stereotaxic frame with ear bars. Apply ophthalmic ointment on the mouse's eyes to prevent drying, and maintain the body temperature of the mouse at 37 degrees Celsius with a thermostatic heating pad. After shaving the fur and sterilizing the surgical site, inject lidocaine, tilidine, and meloxicam.Once the skin over the SC is removed, clean the skull with a cotton swab. Adjust the stereotaxic frame until the skull surface is flat. Using a drill, create a whole 0.5 millimeter lateral, and 0.42 millimeter anterior to the lambda, until the dura is exposed.Inject an adeno-associated virus, or AAV, expressing GCaMP6m, at depths of one millimeter and 1.6 millimeters from the Lambda using a beveled glass micro-pipette. After the injection, slowly withdraw the injector and proceed with the implantation of the head plate.

حقن البناء الفيروسي (AAV) في القولون العلوي للفأر لتصوير الكالسيوم

تسليم البزل القطني ل AAV9 في الفئران اليافعة للعلاج الجيني للجهاز العصبي المركزي

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

تسليط الضوء على المؤلف: تقييم فعالية العلاج الجيني داخل القراب في الفئران اليافعة

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

توصيل النواقل داخل القراب في الفئران اليافعة عن طريق حقن الصهريج القطني

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...