מחקר זה נתמך על ידי סיאול האוניברסיטה הלאומית מענק המחקר (800-20140542), תכנית פיוניר המחקר של NRF / MEST (2012-0009544), וניתוח הטכנולוגיה התכנית ביו-האיתותים החדשנות של NRF / MEST (2009-0090895), וגרנט של NRF / MEST (2015M3A9E6028949).

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לעמותה למחקר בהצהרת חזון ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, וההנחיות והתקנות שנקבעו על ידי הוועדה מוסדית אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים והשימוש סיאול הלאומית וסיאול הלאומית ועדת בטיחות ביולוגית בבית חולים האוניברסיטאי. 1. הכנת ערכת הזרקה ווקטורים ויראליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק microliter מצויד במחט קהה 33 G המעוקרים באמצעות גז אתילן אוקסיד. לדלל את הווקטורים ויראליים בPBS לכייל נאות בצינור מיקרו (כלומר, 1 x 10 6 TU / μl). לשטוף את המזרק מספר פעמים עם וקטורים ויראליים כדי להסיר כל שטח מת במזרק. </li></ol> 2. הזרקת subretinal של וקטורים ויראליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים הבוגרים (כלומר, 6-8 שבועות) עם זריקת intraperitoneal של התערובת של tiletamine וzolazepam (1: 1, 2.25 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) וhydrochloride xylazine (0.7 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) או משטר הרדמה מתאים חלופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרחב תלמידים עם ירידה של 0.5% עין phenylephrine וtropicamide 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק microliter על ידי טעינה עם 1.5 - 2 μl של וקטורים ויראליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העפעף ובולט לעין כדי לחשוף את קו המשווה להזרקה נוחה ולהתמקד במתחת למיקרוסקופ ההפעלה. לשמור על מיקום העין בלטו עד גמר ההזרקה, או עקירה של המחט יכול להתרחש במהלך ההזרקה. להחזיק את גלגל העין בחוזקה, למקם את האצבעות מחוץ לשפת מסלולית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של פתרון viscoelastic עיניים אל פני השטח של הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית כיסוי עגול קטנה בחלק העליון של הקרנית כדי להמחיש את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב חור קטן באחורי קלה לימבוס באמצעות מחט סטרילית 30 G 1/2 להזרקת subretinal נוספת. הפוך את החור נחותים FOr עין ימין, ומעולה לעין השמאל לנוחות. הערה: אם החור הוא עשה בזמן, או באף, זה קשה להיות מכוסה על ידי העפעף לאחר ההזרקה. לנקב ראשוני צריכים להיעשות מעט אחורי לימבוס, כדי למנוע את כלי limbal אשר לרוץ לאורך ימבוס וניתן לזהות בקלות. להיות זהיר כדי להימנע מפגיעה בעדשה עם מחט בעת ביצוע הניקור הראשוני. אל תכניס את כל השיפוע של המחט, כדי למנוע ניקור עדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט הקהה 33 G של מזרק microliter דרך החור המנוקב מראש ומתקרב למחט לתוך חלל subretinal עד הנקודה שבה התנגדות קלה מורגשת. הערה: להזרקת subretinal, זווית הגישה הטובה ביותר של המחט היא כ -45 מעלות נגד מטוס איריס, והמחט הקהה יש דחף בדיעבד כלפי אזור peripapillary. כיכר מנוקדת הצביעה על מסלול המחט הציע על פני חלל הזגוגית לInjectio subretinaln באיור 1. הערה: לא יהיה התנגדות הרגישה כאשר פירסינג (או הפטירה) שכבות רשתית כפי שהם רכים מאוד. לפיכך, התחושה הראשונה של התנגדות מתונה מצביעה על כך שהמחט כבר נגעה בשכבת הרשתית והחדרת המחט צריכה להיפסק. היזהר שלא לחדור לרקמות scleral עם לחץ מוגזם בגלל המחט צריכה להיות ממוקמת בחלל subretinal הפוטנציאלי. אם המחט מפוצצת רקמות scleral ידי כוח מופרז, הוא נכנס לתוך חללי מסלולית extraocular ללא התנגדות. (שלב זה הוא קריטי) </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי תרשים של הזרקת subretinal. H &amp; E סעיף מוכתם צלב של העין העכבר המתארת ​​את המבנים עם מסלול מחט להזרקת subretinal המסומן (כיכר מקווקו). הגדלה: 40X, בר סולם:<html> 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הווקטורים ויראליים (כלומר, 1 x 10 6 TU / μl) בעדינות לתוך חלל subretinal ללא רעד, כדי למנוע נזק לרקמות לא רצויים ולמשוך את המחט בעדינות. החזק את גלגל העין בחוזקה במהלך ההזרקה כפי שתואר ב2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות את ההיווצרות של בועה subretinal לאחר ההזרקה תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שאין דימום ברשתית. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> איור 2. גיבוש subretinal Belb ללא רשתית דימום. מבט מיקרוסקופי של belb subretinal לאחר הזרקת subretinal תחת מיקרוסקופ ניתן לראות היווצרות בועה מוצלחת ללא דימום ברשתית.מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 53030 53030fig2large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לסגור את העפעף כדי לכסות את אתר ההזרקה לאיטום עצמי. להחזיר את העכברים לכלוב בבית ולהישאר בחיים עד ההערכה. הערה: לאחר שהחוקרים להתרגל לנהלים, הם יכולים לקבל את תוצאות הדיר עם נהלים מהירים על ידי דילוג על השלבים הבאים (2.5, 6, ו -10) </li></ol> 3. הערכת היעילות של ג&#39;ין משלוח ברשתית פיגמנט האפיתל <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכברים בתא CO 2. Enucleate העיניים באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העיניים בפתרון paraformaldehyde 4% ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 מינימום לכמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הקרנית עם מלקחיים עדינים ולנקב את הקרנית עם מיקרו מספריים. הסר את הקרנית לאחר המספריים לאורך ימבוס. הסר את העדשה עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את גוף הריסים עם מ &#39;icro-מספריים המאפשרים היפרדות רשתית. משוך בעדינות את כל הרשתית מהרשתית / דמית העין / מורכבת לובן העין. חותך את הרשתית / דמית העין / המורכב scleral רדיאלית מהפריפריה למרכז ליד כמה פעמים עצב הראייה לעשות 4-8 עלים להרכבה שטוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הרשתית / דמית העין / המורכב scleral לעשות צד הרשתית למטה, ולקצץ את כל הרקמות שנותרו בצד scleral כולל שרירים, לחמית ועצב ראייה. שלב זה חשוב לעשות הרשתית / דמית העין / מורכב scleral שטוח כי כל רקמה שנותרה הופכת אחידה מורכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מורכבת עם נוגדן ראשוני והמשני למטרות הספציפיות שלך המחקר (אופציונליות, ראה אזכור לשיטות מפורטות). שטוח הר הרשתית / דמית העין / מתחמי scleral בשקופית הזכוכית ולספוג את PBS עם ספוג סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של פתרון הרכבה ולמקם את כיסוי השקופיות. שים לב לדוגמא ליעילות של משלוח וקטור תחת מיקרוסקופ והעמסת. שמור את הדגימות בהמקרר לתצפית נוספת. </li></ol>

<ol>
	<li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Jacobson, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).</li><li>Conlon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+potency+and+safety+studies+of+an+AAV2-mediated+gene+therapy+vector+for+the+treatment+of+MERTK+associated+retinitis+pigmentosa.">Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).</li><li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+gene+therapy+in+patients+with+choroideremia:+initial+findings+from+a+phase+1/2+clinical+trial.">Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial.</a> Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).</li><li>Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+platforms+for+gene+therapy+of+inherited+retinopathies.">Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies.</a> Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).</li><li>Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraocular+delivery+of+recombinant+virus.">Intraocular delivery of recombinant virus.</a> Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).</li><li>Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+therapeutic+agents.">Intravitreal injection of therapeutic agents.</a> Retina. 29 (7), 875-912 (2009).</li><li>Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+detachment+model+in+rodents+by+subretinal+injection+of+sodium+hyaluronate.">Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye.">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), (2012).</li><li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+transplantation+of+MACS+purified+photoreceptor+precursor+cells+into+the+adult+mouse+retina.">Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932 (2014).</li><li>Sahel, J. A., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+blindness.">Gene therapy for blindness.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).</li><li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adeno-associated+virus+serotypes+efficiently+transduce+murine+photoreceptors.">Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors.</a> J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+transduction+of+ocular+cells+with+a+bovine+immunodeficiency+viral+vector.">Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector.</a> Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).</li><li>Rolling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapeutic+prospects+in+early+onset+of+severe+retinal+dystrophy:+restoration+of+vision+in+RPE65+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium.">Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).</li><li>Le Meur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+vision+in+RPE65-deficient+Briard+dogs+using+an+AAV+serotype+4+vector+that+specifically+targets+the+retinal+pigmented+epithelium.">Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium.</a> Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).</li><li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina.">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li><li>Puche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+factors+associated+with+reticular+pseudodrusen+in+age-related+macular+degeneration.">Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration.</a> Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+for+neovascular+age-related+macular+degeneration.">Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration.</a> Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+amyloid+beta+alters+the+tight+junction+of+retinal+pigment+epithelium+in+5XFAD+mice.">Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice.</a> Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).</li><li>Shin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cleavage+of+amyloid+beta+by+a+viral+protease+NIa+prevents+amyloid+beta-mediated+cytotoxicity.">Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity.</a> PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במאמר זה וידאו, שתארנו את טכניקת הזרקת subretinal limbal-גישה בפירוט עם תוצאות נציג של הרשתית / דמית העין / שטוח הר scleral. זוהי טכניקה קלה ונוחה להזרקת subretinal של וקטורים ויראליים לרשתית. הדמיה ישירה של היווצרות בועה במהלך ההזרקה היא צעד חשוב למסירה מדויקת למתחילים. יש כמה טכניקות...

ברפואת עיניים, ריפוי גנטי התגלה כשיטת הטיפול בretinopathies ירש monogenic. יש retinopathies ירושה הקשורים לגנים באפיתל של רשתית פיגמנט (RPE) כולל amurosis לבר מולדת 1,2, פיגמנטוזה רטיניטיס 3, וchoroideremia 4. שדה המחקר של ריפוי גנטי מתרחב בשני מחקרים פרה-קליניים וניסויים קליניים באמצעות וקטורים ויראליים כגון וירוס adeno -associated (AAV), lentivirus (LV) ואדנווירוס (מודעות) 5. יש וקטורים ויראליים שונים כמיהות שונות ברשתית. לריפוי גנטי בטוח ויעיל, יש לבחור וקטורים ויראליים בזהירות בהתאם לתאי מטרה וגני המטרה. תוואי מסירת הגן הוא גם חשובים למסירת גן יעילה למקד תאים, ובכך, אותו יש לבחור בקפידה, כמו גם. שתי שיטות הנפוצות ביותר למסירת התוך עינית של וקטורים ויראליים הם subretהזרקת INAL והזרקת זגוגית 6. ההזרקה האחרונה, הזגוגית, כבר בשימוש נרחב למסירת תרופה לטיפול בneovascularization choroidal בניוון רטוב הקשורות לגיל מקולרי (AMD) ובצקת מקולרית ברטינופתיה סוכרתית 7. מסלול זגוגית מספק חשיפה של וקטורים ויראליים לרשתית זגוגית והפנימית, אבל דיפוזיה של הווקטורים לרשתית חיצונית היא מוגבלת. מצד השני, מסלול subretinal מספק משלוח ישיר של וקטורים ויראליים למרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית, גרימת בועה מקומית. לכן, הזרקת subretinal נחשבת כיום דרך יעילה יותר למיקוד תאי קולטי האור ורשתית. במונחים של גישה ניתוחית, pars Plana נבחר כאזור בטוח להזרקת זגוגית כדי למנוע נזק ברשתית בחולים אנושיים. פשוט על ידי שינוי בגישה זו כדי עכברים, אנחנו יכולים להזריק וקטורים ויראליים subretinally או intravireally באמצעות גישת limbal. בסרטון הזהמאמר, אנחנו מדגימים שיטה קלה ונוחה של הזרקת subretinal של וקטורים ויראליים לרשתית עכברים. לאחר ניקור יחיד באחורי לימבוס עם מחט 30 G 1/2, מזרק microliter המצויד 33 מחט קהה G מוכנס לתוך חלל subretinal באמצעות האתר לנקב limbal. הווקטורים ויראליים של 1.5 - 2 μl נפח מוזרקים למרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית גרימת שלפוחיות subretinal. הליך זה יכול להתבצע תחת הדמיה ישירה באמצעות מיקרוסקופ הניתוחי. תרגול חוזרים ונשנים יבטיח תוצאות לשכפול גם ללא הדמיה ישירה של היווצרות בועה. זה יעזור לי החוקרים לבצע ניסויים מדויקים וחיסכון בזמן למסירת גן subretinal ברשתית עכברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VANNAS Scissors S/S, 105mm</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555583S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33G Blunt needle</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NF33BL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Syringe, 10 microliter&#160;</td>
			<td>WPI</td>
			<td>NANOFIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-KIT</td>
			<td>WPI</td>
			<td>RPE-KIT</td>
			<td>For easy one hand injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305107</td>
			<td>Initial puncture for subretinal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0720&#160; (CS-3R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica operating microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LM M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresecein microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>TMO.LV-Ctr</td>
			<td>Used to dilute vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Used to dilute vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%)</td>
			<td>Hanmi</td>
			<td></td>
			<td>For dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile)</td>
			<td>Bausch&#38;Lomb</td>
			<td></td>
			<td>For topical anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Healon GV OVD</td>
			<td>Abbott Medical Optics Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride)</td>
			<td>Virbac</td>
			<td></td>
			<td>For general anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun&#174; injection (Xylazine HCl)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td></td>
			<td>For general anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

כדי להעריך את היעילות של הזרקת subretinal על התמרה גנטית נגיפית על ידי פרוטוקול זה, השתמשנו וקטורי LV זמינים מסחרי עם אמרגן CMV להביע שני GFP וRFP למדד. עיניים enucleated לאחר תקופת הזמן המתאימה בהתאם למטרת המחקר. לקבלת תוצאות הנציג, עיניים enucleated 10 שבועות ו -20 שבועות לאחר הזרקת subretinal. ...

Watch this Scientific Journal Video about Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

limbal-approach-subretinal-injection-viral-vectors-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.9K Views.  Seoul National University College of Medicine. Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Video: Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide range of neurological and psychiatric disorders, and memory enhancement in age-related cognitive decline and neurodegenerative diseases. We describe a laboratory protocol for transcranial photobiomodulation therapy (PBMT) in mice. Aged BALB/c mice (18 months old) are treated with a 660 nm laser transcranially, once daily for 2 weeks. Laser transmittance data shows that approximately 1% of the incident red light on the scalp reaches a 1 mm depth from the cortical surface, penetrating the dorsal hippocampus. Treatment outcomes are assessed by two methods: a Barnes maze test, which is a hippocampus-dependent spatial learning and memory task evaluation, and measuring hippocampal ATP levels, which is used as a bioenergetics index. The results from the Barnes task show an enhancement of the spatial memory in laser-treated aged mice when compared with age-matched controls. Biochemical analysis after laser treatment indicates increased hippocampal ATP levels. We postulate that the enhancement of memory performance is potentially due to an improvement in hippocampal energy metabolism induced by the red laser treatment. The observations in mice could be extended to other animal models since this protocol could potentially be adapted to other species frequently used in translational neuroscience, such as rabbit, cat, dog, or monkey. Transcranial photobiomodulation is a safe and cost-effective modality which may be a promising therapeutic approach in age-related cognitive impairment.

Photobiomodulation therapy is an innovative noninvasive modality for the treatment of a wide range of neurological and psychiatric disorders and can also improve healthy brain function. This protocol includes a step-by-step guide to performing brain photobiomodulation in mice by transcranial light delivery, which can be adapted for use in other laboratory rodents.

פרוטוקול לטיפול Photobiomodulation טראנס בעכברים

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Viral Construct (AAV) Injection in Mouse Superior Colliculus for Calcium Imaging

Begin by securing the anesthetized mouse onto a stereotaxic frame with ear bars. Apply ophthalmic ointment on the mouse's eyes to prevent drying, and maintain the body temperature of the mouse at 37 degrees Celsius with a thermostatic heating pad. After shaving the fur and sterilizing the surgical site, inject lidocaine, tilidine, and meloxicam.Once the skin over the SC is removed, clean the skull with a cotton swab. Adjust the stereotaxic frame until the skull surface is flat. Using a drill, create a whole 0.5 millimeter lateral, and 0.42 millimeter anterior to the lambda, until the dura is exposed.Inject an adeno-associated virus, or AAV, expressing GCaMP6m, at depths of one millimeter and 1.6 millimeters from the Lambda using a beveled glass micro-pipette. After the injection, slowly withdraw the injector and proceed with the implantation of the head plate.

הזרקת מבנה נגיפי (AAV) בעכבר קוליקולוס מעולה להדמיית סידן

מתן ניקור מותני של AAV9 בחולדות צעירות לטיפול גנטי במערכת העצבים המרכזית

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

מחבר זרקור: הערכת יעילות הטיפול הגנטי התוך-תאי בחולדות צעירות

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...