Name: enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
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The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

주 : 절차는 신선하거나 냉동 플래시 조직에서 수행 될 수있다. 우리는 혈구와 혈장 단백질 적색을 제거하기 위해 박리시 PBS 매우 혈관 조직 관류를 권장합니다. 우리는 고정으로 고정 된 조직의 절차를 수행하지 않는 것이 좋습니다 (예, 화학 가교) 탈세 포화를 방해하고도 크게 후속 질량 분석 분석을 손상시킬 수 있습니다. 전체 절차를 위해, 우리는 단백질과 펩타이드 회복을 극대화하기 위해 낮은 유지 튜브 및 피펫 팁의 사용을 권장합니다. 조직 또는 종양의 1 탈세 포화 참고 : 시작하기 전에, 시약을 준비하고 각 버퍼의 원하는 볼륨 (구획 단백질 추출 키트와 함께 제공) 프로테아제 억제제를 추가합니다. 모든 샘플은 버퍼 및 SDS의 강수량을 방지 RT에서 유지 될 필요가 버퍼 CS 제외한 실험 기간 동안 얼음에 보관해야itation. 주 : 프로토콜은 상이한 pH 및 추출물의 세포 내 단백질을 순차적 불용성 ECM 단백질 (도 1, 표 1 농축 염 및 세제의 다른 양을 함유 완충액에서 인큐베이션 시리즈를 사용하여 상기의 사용에 대한 대안에 대해서도 논의 참조 상업 키트) 여기에 자세한. 아래에 주어진 시약의 볼륨은 조직 또는 종양 (표 1 참조) 100mg을위한 것이며, 적절히 조정할 필요가있다. <ol><li> 조직이 완전히 파괴되어 균일 한 현탁액이 얻어 질 때까지 조직 균질화기를 사용하여, 프로테아제 억제제를 함유하는 완충액 C의 500 μL에 100 mg의 조직을 균질화. 주 : 추가 디옥시리보 뉴 클레아 제 I (최종 농도 200 μg의 / ㎖, 제조업체의 지시에 따라 재구성)와 A (20 ㎍ / ㎖, 제조업체의 지시에 따라 재구성 된 최종 농도) 리보 뉴 클레아버퍼 N. </li><li> 세포 용해 단백질의 연속 추출 <ol><li> 세포질 단백질의 추출. 4 ° C에서 20 분 동안 튜브 회전에 균질을 품어. 이후 웨스턴 블롯 분석 (예상 결과 섹션과 그림 2 참조) 균질의 작은 나누어지는 (20 μL 10 μL)를 저장합니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 균질을 원심 분리기. 깨끗한 튜브에 뜨는을 수집,이 웨스턴 블롯 분석의 세포질 (C) 부분을 구성하는 것입니다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결. </li><li> 세척하기 위해, 프로테아제 억제제를 함유하는 W 완충액 400 μL에 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양한다. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 균질을 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 추출하려면, 핵 단백질, 버퍼 N 150 μL 단백질 분해 효소 억제제를 함유하는 펠렛을 재현 탁, deoxyribonucleaSE 및 리보 뉴 클레아 제 I과 4 ℃에서 30 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양한다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 깨끗한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 일단이 단계를 반복 : 두 번째로 샘플을 원심 분리 한 후, 이전 뜨는로 뜨는을 추가 :이 웨스턴 블롯 분석의 핵 (N)의 일부를 구성한다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결. 그런 다음, 단계 1.2.3에 따라 세척을 수행합니다. </li><li> 막 단백질을 추출하기 위해, M 완충액 100 ㎕ 프로테아제 억제제를 함유하는 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 30 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양한다. 4 ℃에서 30 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 </li><li> 깨끗한 튜브에 뜨는을 수집 :이 웨스턴 블롯 분석의 막 (M) 부분을 구성하는 것입니다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결. </li><li> 2 펠렛을 재현 탁, 세포 골격 단백질을 추출하려면프로테아제 억제제를 함유하고 RT에서 30 분 동안 회전 튜브에 시료를 배양 완충액 CS 00 μL. 펠렛가 완전히 용해되지 않습니다. 우리는 펠렛의 중단을 관찰까지 피펫 팅에 의해 아래로 펠렛을 방해하는 것이 좋습니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 깨끗한 튜브에 뜨는을 수집합니다. 이 시점에서 펠릿 (비디오 참조)의 크기를 더 감소를 표시합니다. </li><li> 버퍼 C 포함 된 단백질 분해 효소 억제제의 150 μL에 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 튜브 회전에 샘플을 품어. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 수집하고 이전 상층 액에 추가 :이 웨스턴 블롯 분석의 세포 골격 (CS) 부분을 구성하는 것입니다. 플래시는 -80 ° C에서이 부분과 저장을 동결. </li><li> 추가 세척을 수행합니다. PBS 500 ㎕의 프로테아제 억제제를 함유하는 펠렛을 재현 탁차 4 ℃에서 5 분 동안 튜브 회전에 샘플을 품어. 4 ℃에서 5 분 동안 16,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 상층 액을 버린다. 이 단계를 세 번 반복합니다. 참고 : 세제의 모든 흔적은 펩타이드 (제 3 장 참조)에 이전에 단백질의 소화에 광범위한 세척에 의해 제거 될 필요가있다. 이 시점에서, ECM 강화 펠렛 플래시 냉동 할 수 있고, -80 ° C에 보관. 펠릿의 크기는 출발 물질에 불용성 (ECM) 단백질의 양과 탈세 포화의 효율에 의존하는 것에주의. </li></ol></li></ol> 2. SDS-PAGE와 서양의 얼룩에 의해 탈세 포화 / ECM 농축 품질 모니터링 <ol><li> 전체 조직 추출물의 10 ~ 20 μL 나누어지는 및 램 믈리 버퍼 100 mM의 DTT를 포함와 중간 분수 50 μL 분취 액을 섞는다. 100 mM의 DTT를 함유 3X 램리 완충액 ECM 풍부한 불용성 분획을 재현 탁. 주 : 그는 농도를 상승DTT 및 SDS 비교적 불용성 ECM 단백질의 가용화에 도움. </li><li> SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리하고 니트로 셀룰로오스 막에 전사. </li><li> 세포질, 핵, 막, 세포 골격과 ECM 분수의 각각의 단백질 담당자를 모니터링하는 항체를 사용하여 면역 블롯을 수행 (대표 결과 섹션, 표 2 및 그림 2 참조). </li></ol> 질량 분석기 분석을위한 펩티드 단백질의 3 인 - 솔루션 소화 참고 : SDS의 탈세 포화 절차 및 제거 후 얻어진 펠렛은이 단백질이 펩타이드로 분해 될 필요가 질량 분석에 의해 추가 분석을 위해 불용성 ECM 단백질에 매우 충실. 이 단계는 샘플의 단백질 농도를 측정하기에 ECM 단백질 불용성의 결과, 그것이 가능하지 않은 것처럼, 그 참고. 우리는 따라서 ECM-enri을 소화 시약의 볼륨을 제공ECM 강화 펠렛 (표 3)의 크기 (mm) 또는 건조 중량을 기준으로 펩타이드 CHED 샘플. 중탄산 암모늄, 우레아, DTT, 요오도 아세트 아미드와 트리 플루오로 아세트산 용액 모두 새로 제조 할 필요가있다. <ol><li> ECM 강화 펠렛 8 M 우레아의 적절한 양을 첨가함으로써 ECM 농축 샘플을 재현 탁 10mm의 최종 농도를 추가 DTT (표 3 참조). 37 ° C에서 2 시간 동안 1400 rpm으로 연속 교반하면서 인큐베이션. 주 :이 시점에서 ECM 단백질이 완전히 용해되지 않고 가시적 큰 단백질 입자를 원심 분리 또는 여과에 의해 폐기되지 않아야한다. 서스펜션은 탈 글리코 실화와 소화 (동영상 참조)에 따라 삭제됩니다. </li><li> 알킬화 <ol><li> HPLC 등급 물에 요오도 아세트 아미드 솔루션을 준비합니다. RT로 냉각시키고, 샘플을 25 mM의 최종 농도 요오도 아세트 아미드를 추가한다. 완전한 알킬화, DTT : 요오도 아세트 아미드의 비율이 1 사이 여야 : 2이다.5, 1 : 3이다. </li><li> RT에서 30 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션. </li></ol></li><li> 탈 글리코 실화 : 참고 : 탈 글리코 실화는 탄수화물 측 N에 의해 수정 된 펩티드의 식별을 방해 체인 글리코 실화를 -linked을 제거하기 위해 필요합니다. <ol><li> 100 mM 중탄산 암모늄 pH가 8.0이 M 우레아로 희석 PNGaseF 적당량 추가 (표 3 참조). 37 ° C에서 2 시간 동안 1400 rpm으로 연속 교반하면서 인큐베이션. </li></ol></li><li> 소화 <ol><li> 리스-C를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 1,400 rpm에서 연속 교반 배양한다. 트립신을 추가하고 37 ℃에서 1,400 rpm으로 O / N에서 연속 교반 배양한다. 참고 : 8M 우레아의 초기 재구성시 흐린 시작 ECM 풍부한 서스펜션은 O / N 소화 (동영상 참조) 한 후에도 나타납니다. </li><li> 37 ° C에서 추가로 2 시간 동안 1,400 rpm에서 연속 교반 샘플에 트립신의 두 번째 나누어지는을 추가하고 품어. &lt;/ 리&gt; </ol></li><li> 산성화 <ol><li> 소화가 완료되면, 새로 제조 한 50 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)와 함께 샘플을 산성화하여 트립신을 불 활성화. 샘플 우리는 시간에 50 % TFA의 1.5 μl를 첨가하고 (동영상을 참조)의 pH 페이퍼를 이용하여 용액의 pH를 측정하는 펩티드 액 1 μl를 사용하여 제안의 pH &lt;2에 도달한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 16,000 XG에서 산성화 샘플을 원심 분리기. 깨끗한 낮은 유지 관에 뜨는을 수집합니다. 이 시점에서, 펩티드 용액을 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 탈염 주 :이 마지막 단계는 일반적으로 자신의 바람직한 방법에있어서 질량 분석 설비에서 수행된다. <ol><li> 이전 단백질 체학 분석, 진공 농축기에서 농축하여 새로 제조 된 60 % 아세토 니트릴, 0.1 % 트리 플루오로 아세트산으로 용출 샘플 및 펩티드는 탈염. 갓 준비한 3 % acetonitr에서 펩티드를 재현 탁ILE, 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (8). 주 : 탈염 후, 펩티드 용액의 농도 측정법에 의해 측정 될 수 있음을 (예상 결과 섹션을 참조). </li><li> 이제 다시 질량 분석 기능의 최적의 절차에 따라, 질량 분광기 시료를 분석한다. 주 : 우리는 출판물 8을 참조 질량 분석법을 사용하는 ECM의 조성물을 특성화 관심 연구자 장려 - LC-MS / MS 매개 단백질 식별 정보 및 데이터 분석을위한 질량 분석 데이터 검색을 포함한 더 상세한 설명을 제공한다 (10) 및 웹 사이트 우리가 8 경제력에 실리 matrisome 주석 도구를 사용하여. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

수정 우리는 8 열 조직 및 종양 유형에서 ECM 농축이 정확한 순서를 채용하더라도 - (10)는, 프로토콜의 수정은 다음의 경우에 고려되어야한다 : 중간 분획 ECM 단백질 1) 검출. 피브로넥틴과 라미닌을 위해 전술 한 바와 같이, 서로 다른 조직이나 종양 유형의 세포 외 매트릭스는, 자신의 추출율 / 불용성 다를 수 있습니다. 예를 들어, 섬유 성 조직 또는 조직의 리모델링 ECM 매우 동적 뒤집 것으로 생각되며, 따라서 하나는 12보다 쉽게 추출 될 그 조직 ECM 단백질의 높은 비율을 관찰하는 것이다. ECM 단백질이 검출 된 분획에 따라, 우리는 ECM 단백질의 추출을 야기하거나 공정을 생략하는 단계의 배양 시간을 줄이는 것을 제안. 2) DECM 강화 펠렛 세포 내 성분의 상당한 부분의 금 속 탐. 일부 조직 또는 종양 유형 비 세포 : ECM은 특히 높은 (예, 간, 비장, 비 종양 조직 형성)이다. 이 경우에는 (특히 세포 골격 단백질 및 / 또는 히스톤)에 의한 세포 내 단백질 ECM 풍부한 분획의 상당한 오염이 관찰 될 수있다. 효율적으로, 우리는 버퍼 M 및 / 또는 버퍼 CS (모두 포함하는 세제,이 일반적으로 풍부한 세포 내 단백질을 소모)에 두 번 배양을 반복하는 것이 좋습니다 세포 내 단백질을 소모합니다. 또 다른 대안은 (다음 문단 참조)이 아니라 상대적으로 더 가용성 ECM 단백질의 고갈을 초래할 수 있음을주의하여 높은 세제 농도가 다른 버퍼를 사용하는 것이다. 상업용 키트를 사용하여 3) 대체. 우리는 이리저리 버퍼의 정확한 조성물을 얻었다 독점적 이유로 못했다구획되지 단백질 추출 키트의 공급 업체를 해요. 그러나, 우리는 표에 유사한 추출을 수행하기 위해 정의 된 세제와 집에서 만든 버퍼 (NP-40, 나트륨 데 옥시 콜레이트와 SDS)의 농도를 사용하여 우리 자신의 경험을 바탕으로 한 노트를 포함했다. 최근의 연구는 또한 ECM 단백질 13 탈세 포화를 유지하는 버퍼의 pH의 중요성을 강조 하였다. 기술의 한계 여기에 제시된 방법은 ECM 단백질이 본질적으로 더 불용성 가장 세포 내 단백질보다 사실에 의존한다. 그러나, 탈세 포화 방법은 여기에서 설명 확실히 같은 일부 성장 인자 또는 ECM-리모델링 효소로서 ECM 내에 존재하는 수용성 성분을 추출한다. 설명 된 바와 같이 단단히 ECM 단백질에 결합 ECM 관련 단백질이 준비 시료에서 단백질 체학에서 검출되었지만,이 방법은 완전히의 구성을 프로파일 너무 엄격 할 수 matrisome 관련단백질. 다른 방법에 대해 기술의 중요성 중간 단계를 생략 할 수 있거나 ECM 단백질의 손실을 방지하거나 각각 세포 내 단백질 오염의 고갈을 증가 반복 : 다른 방법을 통해 여기에 제시된 방법의 장점은 관심 ECM의 성질에 맞게 될 수 있다는 것이다. 이 방법은 단지 후속 펩타이드 제제 및 질량 분석계와의 간섭을 방지하기 위해 오프 린스 세제의 최소량을 사용한다. 마지막으로, 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 제제를 소화하기 위해 여기에 설명 된 방법은 또한 단백질이 용해 될와 &quot;조&quot;ECM - 풍부 분획에서 수행 될 수 요구하지 않는 장점을 갖는다. (예를 들어 구아니딘 하이드로 클로라이드와 같은)를 이용하는 대안 chaotropes 탈세 포화 방법 질량 분광기하는 ECM의 구성을 연구 한 ㄴEEN은 (14에서 검토) 문헌에보고 된 15, 16 및 연골, 심장 (17), 유선 (18) 및 혈관 (19) 및 (20) 사구체 기저막의 ECM 조성물의 특성을 질량 분석기와 결합하여 사용되어왔다. 추천 ECM의 분석 이후의 단백질 체학에 대한 충실 경우 트립신이 부분 ECM의 소화와 ECM 단백질과 펩티드의 손실이 발생할 것으로 세포를 소화 트립신을 사용 탈세 포화 방법은 사용할 수 없습니다. 콜라게나 제 소화 조직 중단을 돕기 위해 사용되는 것 인 경우가 ECM 분해 및 ECM 단백질 및 펩티드의 상실을 초래 마찬가지로,주의 깊게 감시 할 필요가있다. 인 - 솔루션 대에서 젤 소화? ECM 단백질 3X 램리 완충액 때에도 100mm의 DTT, 분리 PO (6 % SDS를 함유), 가교 매우 불용성이며SDS 겔에 오를리. 따라서에서 젤 소화 바람직한 방법이 아니다. 미래의 응용 프로그램 또한 여기서 설명하지는 않지만, 탈세 포화 동안 수집 중간 분획의 각각의 조성물은 또한 질량 분석에 의해 분석 될 수 있음을 주목할 필요가있다. 아주 작은 샘플 (즉, 인간의 생체 검사) 또는 공부를 할 때 특히 도움이 될 수있는 정보가 다른 세포 분수에 요구 될 때.

세포 외 기질 (ECM)는 부분적으로 세포와 정의에 대한 건축 지원 및 고정을 제공 가교 및 당화 단백질, 조직 &#39;생 역학적 특성 1, 2의 복잡한 메쉬 작업입니다. ECM 단백질은 또한 세포에 직접적으로 그들의 수용체 (예를 들어, 인테그린, syndecans 등)을 통해 또는 3 시그널링 성장 인자를 변조함으로써 신호. ECM 따라서 등 증식, 생존, 편광, 분화, 이동, 같은 세포 과정의 주요 규제이다 생물 물리학 및 생화학 적 신호를 제공합니다 ECM은 생리학, 개발 및 4 노화에 중요한 역할을한다. 또한, 같은 심장 혈관 질환, 섬유증, 근골격계 질환, 암 등 여러 가지 병리,에 의해 발생하거나, ECM의 변경을 초래. 또한, ECM은 줄기 세포 틈새의 유지에 기여 번째 키 ECM 분자 식별지원 stemness에서 조직 공학 및 재생 의학 (5)에 직접 응용 프로그램을해야합니다. 그러나, 그것의 중요성에도 불구하고, ECM이 남아있다 최근까지 6 underexplored. 실리에서 분석은 ECM과 ECM 관련 단백질의 앙상블로 정의 matrisome는, 인간 및 마우스 모두 게놈 -1,7,8,8-에서 수백 유전자의 제품을 포함하는 것을 밝혔다. 그러나, ECM 단백질의 불용성은 정상 및 병리학 표본 생체 내 세포 외 기질의 조성물의 특성을 체계적 방해했다. (10) - 우리는 최근이 불용성이 유리하게 설정 될 수 있고, ECM 단백질 8을 풍부하게하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다. 10, 13 - 우리 등은 상기 질량 분석기는 ECM들 (8)의 조성물의 특성을 선택하는 방법 이었다는 것을 보여 주었다. 우리여기에 다른 pH와 소금과 세제 농도의 버​​퍼에 순차적 배양으로 구성 탈세 포화 절차를 설명합니다. 추출 (또는 고갈) 세포질, 핵, 막과 세포 골격 단백질과 ECM 단백질의 농축이 프로 시저의 결과로. 우리는 그 다음 질량 분석에 의한 이후의 분석을위한 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 준비를 소화하는 방법을 설명합니다. 자세한 여기에 설명 된 절차를 사용하여, 우리는 성공적으로 농축 및 질량 분석을 특징으로 10 개의 다른 조직과 종양 유형의 세포 외 매트릭스 한 정상 쥐의 폐 (8), 인간과 쥐의 대장 8, 9, 인간의 간 (9), 인간의 대장 종양과 파생 간 전이 (9), 흑색 종 이종 이식 (8), (게시되지 않은 나바 등.) 유방 종양 이종 이식 (10), 쥐의 췌장 섬과 쥐 insulinomas. 다른 matrisom의 비교ES는 더 잠재적 인 진단이나 예후 바이오 마커로 사용될 수있는 조직 - 및 종양 특이 ECM 서명 한 것으로 밝혀졌습니다. 우리는이 절차가 없거나 상대적으로 약간의 수정과 다른 시료에 적용 할 수 있다고 믿는다.

<table><tbody><tr><td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td><td>Next Advance</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender&quot;&gt;BB24-AU&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Compartmental Extraction kit</td><td>Millipore</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145&quot;&gt;2145&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&amp;amp;region=US&quot;&gt;DN25&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Qiagen</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/&quot;&gt;19101&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-grade water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&amp;amp;region=US&quot;&gt;34877&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&amp;amp;region=US&quot;&gt;U4883&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt&quot;&gt;20291&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&amp;amp;region=US&quot;&gt;9830&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&amp;amp;region=US&quot;&gt;A3221&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Peptide-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Glycosidase F (PNGaseF)</td><td>New England Biolabs</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f&quot;&gt;P0704S&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&amp;nbsp;</td><td>Wako</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm&quot;&gt;125-05061&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, mass spectrometry-grade&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/&quot;&gt;V5111&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoro-acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&amp;amp;region=US&quot;&gt;T6508&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade&quot;&gt;51101&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Desalting columns: Oasis HLB 1&amp;nbsp;cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td><td>Waters</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383&quot;&gt;186000383&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

세포 외 기질 (ECM)는 ECM이 심장 혈관을 포함하여 개발 및 다양한 병리에서 중요한 역할을한다 세포 증식, 생존, 마이그레이션 등의 주요 규제이다 생물 물리학 및 생화학 적 신호를 제공 가교 단백질의 복잡한 메쉬 작업입니다 및 근골격계 질환, 섬유증, 암. 따라서, 정상과 병에 걸린 조직의 ECM의의 구성을 특징 짓는 것은 새로운 예후 및 진단 바이오 마커 및 잠재적 인 새로운 치료 대상의 식별로 이어질 수있다. 그러나, ECM 단백질의 본질 (크기가 큰 가교과 공유 결합, 크게 당화)가 도전하는 ECM의 생화학 적 분석을 렌더링하고있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 ECM 단백질의 용해성을 활용 신선하거나 동결 된 조직 및 종양으로부터 ECM의 농축 방법을 개발 하였다. 우리는 여기에서 상세 순차 I로 구성 탈세 포화 절차를 설명다른 pH와 소금과 세제 농도의 버​​퍼에 ncubations하고 1 결과) 세포 (세포질, 핵, 막과 세포 골격) 단백질과 ECM 단백질의 2) 농축 추출. 우리는 다음 deglycosylate 및 질량 분석에 의한 이후의 분석을위한 펩티드로 ECM 풍부한 단백질 준비를 소화하는 방법을 설명합니다.

탈세 포화 과정의 품질 관리 탈세 포화의 효율을 웨스턴 블롯에 의해 각 분획의 단백질 함량을 분석함으로써 모니터링 될 수있다. 진단 값이 나열 단백질 표 탈세 포화 과정의 품질을 평가.도 2a는 세포질의 중간 분획의 효율적인 추출 (GAPDH를 도시 ), 원자력 (히스톤), 막 (β1의 인테그린)과 세포 골격 (액틴) 단백질, 더 ECM 단백질 (콜라겐 내가)이 분수에서 검출되지 않은 반면 (그림 2). 차례로, 최종 펠릿 ECM 단백질에 대해 충실 크게 세포 내 단백질 (도 2A). 액틴 여전히 검출 할 수 있지만,도 2b는, 양호한 세포 내 단백질 고갈 (에는 히스톤이 ECM - 풍부 분획에서 검출되지 않는다) 선물 고갈 ECM - 풍부 분획 및 모노머 콜라겐 I의 고갈- 겉보기 분자량 ~ 110 kDa의, 추정하여 내가 조립되지 않은 콜라겐에 해당 - 연사 부분에서 관찰 할 수있다. 일부 조직에서 이들 성분이 부분적으로 이전 분획 8-10 가용화 할 수 있지만, 우리는 또한 통상적으로, 피브로넥틴 및 라미닌 등의 부가적인 ECM 단백질을 모니터링한다. 예를 들어, 피브로넥틴도 ECM에 포함되지 않는 수용성 플라즈마 피브로넥틴을 발생한다. 추출하기 전에 조직의 관류 플라즈마 피브로넥틴 농도를 줄일 수 있지만, 항상 그것을 제거하지 않습니다. 일부 조직에서, 라미닌이 발견 느슨하게 세포 표면 또는 중간 분수에서 전자 재료 및 추출물과 연결되어 있습니다. 이런 일이 발생하면이를 추출 조건 (논의 참조) 변경함으로써 해결할 수있다. ECM 단백질과 세포 내 구성 요소의 수반 고갈의 농축이 다른 버퍼에서 단백질의 상대적인 용해도를 기반으로합니다. 목다른 조직들 사이 다릅니다이다 - 어떤 경우에는 히스톤과 액틴은 더 쉽게 다른 사람에 비해 추출된다. 또한 히스톤은 N 분획 (도 2B)에서 추출 될 것으로 예상되지만, 우리가 흔히 M 또는 CS 분획 (도 2A와 B)에서 히스톤의 더 완전한 공핍을 관찰, 참고. 지표 펩타이드 농도 예상 소화, 산성화하고, 탈염 후의 펩티드 용액의 농도를 분광 광도법에 의해 어느 트립토판, 티로신에 상당하는 280 nm 파장을 사용하여 펩티드 용액의 흡광도를 측정, 또는 펩티드의 흡광도에 상응하는 205 nm 파장을 사용하여 측정 할 수있다 채권. 우리는 (각각, 82 ㎎, 100 ㎎, 100 ㎎)을 세 뮤린 폐 샘플 탈세 포화로부터 얻어지는 펩티드 용액의 농도를 측정 처리장424 NG / μL, 450 NG / μL, 각각 펩티드의 580 NG / μL : 레드 병렬로 각에서 얻을. 질량 분광기 ECM 펩티드 동정 여기에 기술 된 바와 같이 제조 된 ECM 풍부한 단백질 시료의 조성의 질량 분석은, 신호 강도의&gt; 70 %가 ECM과 관련된 ECM 단백질 8-10에 해당 하였다. 조직 또는 종양의 100 mg의 (습 중량)을 decellularize하는 구획되지 추출 키트 시약의 표 1. 볼륨.이 표는 구성과 조직 또는 종양의 100 mg을 탈세 포화를 수행하는 데 사용되는 각 버퍼의 양을 보여줍니다. 프로테아제 억제제의 칵테일 50X 용액으로서 제공되고, 각 버퍼 (2)에 첨가 할 필요가있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 구획 단백질 추출 키트 시약 </td><td> 조직 100 mg을위한 양 </td><td> 구성 (밀리 포아 데이터 시트 고양이 #을 기반으로 2145 1) </td></tr><tr><td> 버퍼 C </td><td> 500 μL </td><td> HEPES (pH를 7.9 3)의 MgCl 2의 KCl, EDT 4, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 (5) </td></tr><tr><td> 버퍼 W </td><td> 400 μL </td><td> HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 </td></tr><tr><td> 버퍼 N </td><td> 150 μL × 2 </td><td> HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2, 염화나트륨, EDTA, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 </td></tr><tr><td> 버퍼 W </td><td> 400 μL </td><td> HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 </td></tr><tr><td> 버퍼 M </td><td> 100 μL </td><td> HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 소듐 데 옥시 콜레이트 (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, 나트륨 오르토 바나 데이트 </td></tr><tr><td> 버퍼 (CS) </td><td> 200 μL </td><td> 파이프 (PH 6.8)의 MgCl 2, 염화나트륨, EDTA, 자당, 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 7, 나트륨 오르토 바나 데이트 </td></tr><tr><td> 버퍼 C </td><td> 150 μL </td><td> HEPES (PH 7.9)의 MgCl 2의 KCl, EDTA, 수 크로스, 글리세롤, 나트륨 오르토 바나 데이트 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> 500 μL / 세척 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 참고 : 1 독점 이유로, 우리는 키트의 공급 업체에서 버퍼의 정확한 구성을 얻을 수 없습니다, 그러나 우리는 여기에 유사한 추출을 수행하는 집에서 만든 버퍼를 사용하여 우리 자신의 경험을 바탕으로 몇 가지 메모를 포함한다. 2 프로테아제 억제제 : 그것은 등 시스테인, 세린 및 트레오닌 펩 티다 제, 세린 에스 테라 제, 가의 양이온 의존 메탈에 대한 억제제의 다양한 포함하는 것이 바람직하다많은 상업적으로 이용 가능한 단백 분해 효소 억제제 칵테일이 존재한다. 7.0 위의 3 pH는 리소좀 단백질 분해 효소의 효과적인 억제제이다. (2 mM의 일반적으로 사용되는)은 EDTA 4 가의 양이온 의존적 프로테아제의 효과적인 억제제이다. 5 나트륨 오르토 바나 데이트는 포스 파타 아제 억제제이다. 일반적인 유효 농도는 0.5 mm 이상이어야한다. 0.1 % -0.5 %로 6 NP40 대부분 막 지질을 용해하기에 충분하다. NP40 및 DOC의 조합 - 종종 그대로 여러 단백질 - 단백질 상호 작용을 잎 추출 엄격한로서 사용된다 - 자주 (예를 들어, 각각의 0.5 %)이 동일한 농도에서 사용 하였다. SDS는 7보다 엄격한 온성 세정제 (0.1 % CMC)이다. 또한 다른 두 세제 SDS / NP40 / DOC 중간 엄중 버퍼로서 0.1 / 0.5 / 0.5 %와 조합하여 사용할 수있다. 표 2. 진단 단백질에탈세 포화 과정의 품질을 감시한다.이 표는 탈세 포화 과정의 품질과 효율을 모니터링하기 위해 사용될 수있는 각각의 세포 내 구획 (세포질, 핵, 세포막, 세포 골격과 ECM)의 특성이다 단백질의 예를 보여 ECM-농축. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 세포 내 구획 </td><td> 진단 단백질 </td></tr><tr><td> 세포질 단백질 </td><td> 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) </td></tr><tr><td> 핵 단백질 </td><td> 히스톤, 라민, Nucleoporin </td></tr><tr><td> 막 단백질 </td><td> 인테그린, 트랜스페린 수용체 </td></tr><tr><td> 세포 골격 단백질 </td><td> 액틴, 튜 불린, 멘틴 </td></tr><tr><td> 기저막 ECM 단백질 </td><td> 콜라겐 IV, Nidogens, 라미닌 </td></tr><tr><td> 간질 ECM 단백질 (간질) </td><td> 콜라겐 I, III 콜라겐, 콜라겐 VI, 피브로넥틴 </td></tr></tbody></table> 항체에 추천을 위해, 우리의 출판물 8-10를 참조하십시오. 펩타이드에 ECM 풍부한 샘플을 소화 시약의 표 3. 볼륨.이 테이블은 ECM 풍부한 단백질 샘플을 재현 탁하고 감소, 킬레이트, deglycosylate 및 질량 분석 분석에 앞서 펩티드로 단백질 샘플을 소화하는 데 사용되는 시약을 보여줍니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 준비하기 </td><td> 1mm 두께의 펠릿에 대한 최종 농도 / 금액 (~ 5 ~ 10 mg의 건조 중량) </td><td> 1mm 두께의 펠릿을위한 양 (~ 5 ~ 10 mg의 건조 중량) </td></tr><tr><td> 중탄산 암모늄 (NH 4 HCO 3) </td><td> HPLC 급 물 100 mM의 솔루션 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> 100 mM의 중탄산 암모늄 용액에 8 M </td><td> 8 M </td><td> 50 μL </td></tr><tr><td> 디티 오 트레이 톨 </td><td> 500 mM의에서 HPLC 등급 물에 복원합니다 </td><td> 10 mM의 </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 요오도 아세트 아미드 </td><td> 500 mM의에서 HPLC 등급 물에 복원합니다 </td><td> 25 mM의 </td><td> 2.5 μL </td></tr><tr><td> 펩티드 - N 글리코시다 제 F (PNGaseF) </td><td> 500 U / μL에서 상용 솔루션 </td><td> 1000 U </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> 엔도 프로의 lysC, 질량 분석 급 </td><td> 0.5 μg의 / μL에서 HPLC 등급 물에 복원합니다 </td><td> 1 μg의 </td><td> 2 μL </td></tr><tr><td> 트립신, 질량 분석 급 (1 라운드) </td><td> 0.5 μg의 / μL에서 상용 솔루션 </td><td> 3 μg의 </td><td> 6 μL </td></tr><tr><td> 트립신, 질량 분석 급 (2 라운드) </td><td> 0.5 μg의 / μL에서 상용 솔루션 </td><td> 1.5 μg의 </td><td> 3 μL </td></tr><tr><td> 트라이 플루오로 아세트산 (TFA) </td><td> HPLC 등급의 물 중의 50 % 용액 </td><td> - </td><td> 2-5 μL </td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 (용출) </td><td> HPLC 등급의 물 중 0.1 % TFA 60 % 용액 </td><td> - </td><td> 500 μL </td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 (재구성) </td><td> HPLC 등급의 물 중 0.1 % TFA 3 % 용액 </td><td> - </td><td> 100 μL </td></tr></tbody></table><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> 실험 절차의 그림 1. 계획. protoco의 도식 워크 플로우L은 조직 (제 1) decellularize 탈세 포화의 품질을 제어하고 ECM 농축 (제 2) 평가 및 질량 분석 분석 (제 3 장) 이전에 펩타이드로 ECM 풍부한 단백질 샘플을 소화한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> 웨스턴 블롯에 의해 탈세 포화 과정의도 2 품질 관리 웨스턴 블롯 뮤린 폐 (A) 및 인간 유방 암종 이종 이식 (B) 다음의 항체를 사용하여 시료에 대해 수행 하였다 :. 토끼 항 - 액틴 (클론 14-1) 및 토끼 항 -β1 우리 실험실에서 생산 된 항체를 인테그린; 토끼 항 - 콜라겐 I, 마우스 항 GAPDH 및 토끼 항 팬 히스톤 항체는 밀리 포어로부터 있었다. 일차 항체 인큐베이션 후, 막을 세척하고, HRP 접합 된 염소 항 - 토끼 또는 염소 항 - 각서의 존재하에 인큐베이션잭슨이 뮤노 연구소에서 자체 이차 항체. 마지막으로, 막 세정과 서양의 번개 ™ 화학 발광 시약 (퍼킨 엘머 LAS)에서 배양 하였다. * ECM이 풍부한 부분의 최소한의 잔류 히스톤 오염을 나타냅니다. ** CS 분획에서 단량체 (추정하여 미 조립) 콜라겐 나는 부분 고갈을 나타냅니다. *** ECM이 풍부한 부분의 잔류 굴지의 오염을 나타냅니다. 항 - 콜라겐 항체에 의해 검출 스미어 번역 후 변형 (예를 들면, 가교 결합, 글리코 실화)의 다양한 수준을 나타낸다.

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

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Research

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Biology

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

연구

화학

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). Using proteomics, we have previously identified more than 150 ECM and ECM-associated proteins in cardiovascular tissues. Notably, many ECM proteins are glycosylated. This post-translational modification affects protein folding, solubility, binding, and degradation. We have developed a sequential extraction and enrichment method for ECM proteins that is compatible with the subsequent liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of intact glycopeptides. The strategy is based on sequential incubations with NaCl, SDS for tissue decellularization, and guanidine hydrochloride for the solubilization of ECM proteins. Recent advances in LC-MS/MS include fragmentation methods, such as combinations of higher-energy collision dissociation (HCD) and electron transfer dissociation (ETD), which allow for the direct compositional analysis of glycopeptides of ECM proteins. In the present paper, we describe a method to prepare the ECM from tissue samples. The method not only allows for protein profiling but also the assessment and characterization of glycosylation by MS analysis.

This paper describes a methodology to prepare cardiovascular tissue samples for MS analysis that allows for (1) the analysis of ECM protein composition, (2) the identification of glycosylation sites, and (3) the compositional characterization of glycan forms. This methodology can be applied, with minor modifications, to the study of the ECM in other tissues.

세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

생화학

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

생체공학

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological matrices is often necessary due to their low stoichiometry in comparison to non-modified analytes. Most enrichment workflows of PTMs on peptides in bottom-up proteomics workflows, where proteins are enzymatically digested before the resulting peptides are analyzed, only enrich one type of modification. It is the entire complement of PTMs, however, that leads to biological functions, and enrichment of a single type of PTM may miss such crosstalk of PTMs. PTM crosstalk has been observed between protein glycosylation and phosphorylation, the two most common PTMs in human proteins and also the two most studied PTMs using mass spectrometry workflows. Using the simultaneous enrichment strategy described herein, both PTMs are enriched from post-mortem human pancreatic tissue, a complex biological matrix. Dual-functional Ti(IV)-immobilized metal affinity chromatography is used to separate various forms of glycosylation and phosphorylation simultaneously in multiple fractions in a convenient spin tip-based method, allowing downstream analyses of potential PTM crosstalk interactions. This enrichment workflow for glyco- and phosphopeptides can be applied to various sample types to achieve deep profiling of multiple PTMs and identify potential target molecules for future studies.

Post-translational modifications (PTMs) change protein structures and functions. Methods for the simultaneous enrichment of multiple PTM types can maximize coverage in analyses. We present a protocol using dual-functional Ti(IV)-immobilized metal affinity chromatography followed by mass spectrometry for the simultaneous enrichment and analysis of protein N-glycosylation and phosphorylation in pancreatic tissues.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

Enrichment of host cell proteins in monooclonal antibody drug products(단클론 항체 의약품에서 숙주 세포 단백질의 농축)

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks associated with drug products, methods have been developed to identify low-abundance HCPs. A crucial approach for developing a sensitive HCP detection method involves enriching HCPs while simultaneously removing monoclonal antibodies (mAbs) before analysis, utilizing liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
This protocol offers detailed instructions for enriching host cell proteins using commercially available proteome enrichment beads. These beads contain a diverse library of hexapeptide ligands with specific affinities for different proteins. The protocol also incorporates limited digestion and subsequent peptide detection using nano LC-MS/MS. By employing these techniques, HCPs with low abundance can be enriched over 7000-fold, resulting in an impressive detection limit as low as 0.002 ppm. Significantly, this protocol enables the detection of 850 HCPs with a high level of confidence using a NIST mAb. Moreover, it is designed to be user-friendly and includes a video demonstration to assist with its implementation. By following these steps, researchers can effectively enrich and detect HCPs, enhancing the sensitivity and accuracy of risk assessment for drug products.

저자 스포트라이트: 농축 비드 및 제한된 분해를 사용하여 의약품에서 Low-Abundant Host Cell Proteins 검출 

A protocol is presented for enriching host cell proteins (HCPs) from drug products (DP) and detecting peptides using proteome enrichment beads. The method is demonstrated using an in-house manufactured monoclonal antibody (mAb) drug substance (DS), which is a well-characterized reference material for evaluating and comparing different methods in terms of performance.

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their significance to both cell physiology and immunology, much remains to be discovered about novel lipoprotein forms, how they are synthesized, and the effect of the various forms on host immunity. To enable thorough studies on lipoproteins, this protocol describes a method for bacterial lipoprotein enrichment and preparation of N-terminal tryptic lipopeptides for structural determination by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Expanding on an established Triton X-114 phase partitioning method for lipoprotein extraction and enrichment from the bacterial cell membrane, the protocol includes additional steps to remove non-lipoprotein contaminants, increasing lipoprotein yield and purity. Since lipoproteins are commonly used in Toll-like receptor (TLR) assays, it is critical to first characterize the N-terminal structure by MALDI-TOF MS. Herein, a method is presented to isolate concentrated hydrophobic peptides enriched in N-terminal lipopeptides suitable for direct analysis by MALDI-TOF MS/MS. Lipoproteins that have been separated by Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) are transferred to a nitrocellulose membrane, digested in situ with trypsin, sequentially washed to remove polar tryptic peptides, and finally eluted with chloroform-methanol. When coupled with MS of the more polar trypsinized peptides from wash solutions, this method provides the ability to both identify the lipoprotein and characterize its N-terminus in a single experiment. Intentional sodium adduct formation can also be employed as a tool to promote more structurally informative fragmentation spectra. Ultimately, enrichment of lipoproteins and determination of their N-terminal structures will permit more extensive studies on this ubiquitous class of bacterial proteins.

The enrichment of bacterial lipoproteins using a non-ionic surfactant phase partitioning method is described for direct use in TLR assays or other applications. Further steps are detailed to prepare N-terminal tryptic lipopeptides for structural characterization by mass spectrometry.

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

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비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축