The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

NOTA: La procedura può essere condotto su tessuti freschi o congelati in flash. Si consiglia di perfusione tessuti altamente vascolarizzati con PBS al momento della dissezione per eliminare globuli rossi e proteine ​​plasmatiche. Si sconsiglia della procedura sui tessuti fissi fissazione (cioè reticolazione chimica) interferisce con decellularization e può anche compromettere significativamente la successiva analisi di spettrometria di massa. Per l&#39;intera procedura, si consiglia l&#39;uso di tubi a bassa ritenzione e punte per pipette per massimizzare proteine ​​e peptidi recupero. 1. Decellularization di tessuti o di tumori NOTA: Prima di iniziare, preparare i reagenti e aggiungere inibitori della proteasi (fornito con il kit di estrazione Protein Vano) per il volume desiderato di ogni buffer. Tutti i tamponi e campioni devono essere tenuti in ghiaccio per la durata dell&#39;esperimento tranne il tampone CS che deve essere mantenuto a temperatura ambiente per evitare SDS precipitazione. NOTA: Il protocollo utilizza una serie di incubazione in tampone di pH diversi e contenenti diverse quantità di sali e detergenti sequenzialmente estrarre proteine ​​intracellulari e arricchire per proteine ​​ECM insolubili (Figura 1, Tabella 1, vedi anche la discussione di alternative all&#39;uso del kit commerciale dettagliato qui). I volumi di reagenti indicati di seguito sono per 100 mg di tessuti o tumori (vedi Tabella 1) e devono essere regolati in modo appropriato. <ol><li> Omogeneizzare 100 mg di tessuto in 500 pl di tampone C contenenti inibitori della proteasi utilizzando un omogeneizzatore tessuto finché il tessuto è completamente interrotto e una sospensione omogeneo. NOTA: Aggiungere deossiribonucleasi I (concentrazione finale: 200 mg / ml, ricostituito secondo le istruzioni del produttore) e ribonucleasi A (concentrazione finale: 20 mg / ml, ricostituito secondo le istruzioni del produttore) aBuffer N. </li><li> L&#39;estrazione sequenziale di proteine ​​solubili intracellulari <ol><li> Estrazione di proteine ​​citosoliche. Incubare l&#39;omogeneizzato su un rotatore tubo per 20 min a 4 ° C. Salva una piccola aliquota (10 ml a 20 ml) del omogenato per la successiva analisi western blot (vedi attesi sezione Risultati e Figura 2). </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Raccogliere il supernatante in una provetta pulita, questo costituirà la citosolico (C) frazione del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. </li><li> Per lavare, risospendere il pellet in 400 ml di tampone W contenente inibitori delle proteasi e incubare il campione su un rotatore tubo per 20 min a 4 ° C. Centrifugare l&#39;omogeneizzato a 16.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Per estrarre, proteine ​​nucleari, risospendere il pellet in 150 ml di tampone N contenenti inibitori della proteasi, deoxyribonuclease io e ribonucleasi A e incubare il campione su un rotatore tubo per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il campione a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in una provetta pulita. Ripetere questo passaggio una volta: dopo centrifugazione del campione per la seconda volta, aggiungere il surnatante al supernatante precedente: questo costituisce il (N) frazione nucleare del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. Quindi, eseguire lavaggi secondo passo 1.2.3. </li><li> Per estrarre proteine ​​di membrana, risospendere il pellet in 100 ml di tampone M contenenti inibitori della proteasi e incubare il campione su un rotatore tubo per 30 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C </li><li> Raccogliere il supernatante in una provetta pulita: questo costituirà la membrana (M) frazione del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. </li><li> Per estrarre proteine ​​del citoscheletro, risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone CS contenenti inibitori della proteasi e incubare il campione su un rotatore provetta per 30 minuti a temperatura ambiente. Si noti che il pellet non si dissolverà completamente. Si consiglia di interrompere il pellet pipettando su e giù fino a osservare rottura del pellet. </li><li> Centrifugare il campione a 16.000 xg per 30 min a RT. Raccogliere il supernatante in una provetta pulita. Notare a questo punto una ulteriore marcata diminuzione delle dimensioni del pellet (vedi video). </li><li> Risospendere il pellet in 150 ml di tampone C contenente inibitori delle proteasi e incubare il campione su un rotatore tubo per 20 min a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere al surnatante precedente: questo costituirà il citoscheletro (CS) frazione del western blot. Flash congelare questa frazione e conservare a -80 ° C. </li><li> Eseguire lavaggi aggiuntivi. Risospendere il pellet in 500 ml di PBS contenente inibitori delle proteasi and incubare il campione su un rotatore provetta per 5 minuti a 4 ° C. Centrifugare il campione a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante. Ripetere questa operazione tre volte. NOTA: Tutte le tracce di detergenti deve essere rimosso da ampi lavaggi prima digestione delle proteine ​​in peptidi (vedi punto 3). A questo punto, il pellet ECM arricchito può essere congelati e conservati a -80 ° C. Si noti che le dimensioni del pellet dipenderà dalla quantità di (ECM) proteine ​​insolubili nel materiale di partenza e l&#39;efficienza del decellularization. </li></ol></li></ol> 2. Monitoraggio della Qualità dei Decellularization / ECM arricchimento mediante SDS-PAGE e Western Blot <ol><li> Mescolare 10-20 ml aliquota dell&#39;estratto del tessuto totale e 50 aliquote microlitri di frazioni intermedie con Laemmli tampone contenente 100 mM DTT. Risospendere il ECM arricchito, frazione insolubile in 3x Laemmli tampone contenente 100 mM DTT. Nota: ha elevato concentrazionidi DTT e SDS contribuire solubilizzazione delle proteine ​​ECM che sono relativamente insolubili. </li><li> Separare le proteine ​​mediante SDS-PAGE e trasferite su membrane di nitrocellulosa. </li><li> Eseguire immuno-macchie utilizzando anticorpi per monitorare le proteine ​​rappresentante di ciascuna delle citosolici, nucleare, membrana, citoscheletro e ECM frazioni (vedere la sezione risultati rappresentativi, Tabella 2 e Figura 2). </li></ol> 3. Nella soluzione digestione delle proteine ​​a peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa NOTA: Il pellet ottenuto dopo la procedura decellularization e la rimozione della SDS è altamente arricchito in proteine ​​ECM insolubili per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa queste proteine ​​devono essere digerito in peptidi. Si noti che, come conseguenza della ECM proteine ​​insolubilità, non è possibile in questa fase per misurare la concentrazione di proteine ​​del campione. Abbiamo così a disposizione volumi di reagenti per digerire l&#39;ECM-enricampioni Ched in peptidi in base alle dimensioni (mm) e il peso secco del pellet ECM arricchito (Tabella 3). Le soluzioni di bicarbonato di ammonio, urea, DTT, iodoacetamide e acido trifluoroacetico tutti devono essere preparati al momento. <ol><li> Risospendere il campione ECM arricchito aggiungendo il volume appropriato di 8 M urea al pellet ECM arricchito e aggiungere DTT ad una concentrazione finale di 10 mM (vedi Tabella 3). Incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per 2 ore a 37 ° C. NOTA: a questo punto le proteine ​​ECM non saranno completamente sciolte e le visibilmente grandi particelle proteiche non dovrebbero essere eliminati per centrifugazione o filtrazione. La sospensione sarà chiaro su deglicosilazione e la digestione (vedi video). </li><li> Alchilazione <ol><li> Preparare la soluzione iodoacetamide in acqua HPLC-grade. Raffreddare il campione a RT e aggiungere il iodoacetamide ad una concentrazione finale di 25 mm. Per una completa alchilazione, DTT: rapporto iodoacetamide deve essere compreso tra 1: 2.5 e 1: 3. </li><li> Incubare al buio per 30 minuti a RT. </li></ol></li><li> Deglycosylation: Nota: deglicosilazione è necessaria per rimuovere catene laterali di carboidrati che interferiscono con l&#39;identificazione di peptidi modificati da N -linked glicosilazione. <ol><li> Diluire a 2 M urea con 100 millimetri di bicarbonato di ammonio a pH 8.0 e aggiungere la giusta quantità di PNGaseF (vedi tabella 3). Incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per 2 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Digestione <ol><li> Aggiungere Lys-C e incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per 2 ore a 37 ° C. Aggiungere la tripsina e incubare con agitazione continua a 1.400 rpm O / N a 37 ° C. NOTA: la sospensione ricca di ECM che ha avuto inizio nuvoloso dopo la ricostituzione iniziale 8M urea appare chiaro dopo O / N digestione (vedi video). </li><li> Aggiungere una seconda aliquota di tripsina al campione e incubare con agitazione continua a 1.400 rpm per ulteriori 2 ore a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Acidificazione <ol><li> Al termine della digestione, inattivare la tripsina dalla acidificazione del campione con acido trifluoro-acetico 50% preparata di fresco (TFA). Il campione dovrebbe raggiungere pH &lt;2. si consiglia di aggiungere 1-1,5 ml di 50% TFA alla volta e con 1 ml di soluzione di peptide per misurare il pH della soluzione utilizzando carta pH (vedi video). </li><li> Centrifugare campione acidificato a 16.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante in un tubo a bassa ritenzione pulito. A questo punto, la soluzione peptide può essere conservato a -20 ° C. </li></ol></li><li> Desalting Nota: che questo ultimo passo si svolge generalmente in un impianto di spettrometria di massa secondo i propri metodi preferiti. <ol><li> Prima dell&#39;analisi proteomica, desalt i campioni e peptidi eluiti con appena preparato 60% acetonitrile, 0,1% di acido trifluoroacetico, seguita da concentrazione in un concentratore a vuoto. Risospendere i peptidi in preparati al momento 3% acetonitrile, 0,1% di acido trifluoroacetico 8. NOTA: che dopo la dissalazione, la concentrazione della soluzione di peptidi può essere misurata mediante spettrofotometria (vedi sezione risultati attesi). </li><li> Ora analizzare il campione mediante spettrometria di massa, sempre secondo le modalità ottimali della spettrometria di massa. NOTA: Incoraggiamo i ricercatori interessati a caratterizzare la composizione della ECM usando la spettrometria di massa per fare riferimento alle altre nostre pubblicazioni 8-10 e siti web che forniscono ulteriori spiegazioni, compresi i parametri LC-MS / MS, di massa ricerca dei dati di spettrometria per l&#39;identificazione e l&#39;analisi dei dati delle proteine utilizzando il silico matrisome strumento di annotazione in abbiamo sviluppato 8. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hynes, R. O., Naba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+matrisome--an+inventory+of+extracellular+matrix+constituents+and+functions.">Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (1), a004903 (2012).</li><li>Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+assembly:+a+multiscale+deconstruction.">Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), (2014).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+not+just+pretty+fibrils.">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li><li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease.">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li><li>Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnological+strategies+for+engineering+complex+tissues.">Nanotechnological strategies for engineering complex tissues.</a> Nat Nanotechnol. 6 (1), 13-22 (2011).</li><li>Wilson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix:+an+underexplored+but+important+proteome.">The extracellular matrix: an underexplored but important proteome.</a> Expert Rev Proteomics. 7 (6), 803-806 (2010).</li><li>Naba, A., Hoersch, S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+definition+of+an+ECM+parts+list:+an+advance+on+GO+categories.">Towards definition of an ECM parts list: an advance on GO categories.</a> Matrix Biol. 31 (7-8), 371-372 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hoersch, S., Liu, H., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+matrisome:+in+silico+definition+and+in+vivo.+characterization+by+proteomics+of+normal+and+tumor+extracellular+matrices.">The matrisome: in silico definition and in vivo. characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices.</a> Mol. Cell Proteomics. 11 (4), M111.014647 (2012).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Whittaker, C. A., Carr, S. A., Tanabe, K. K., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+primary+metastatic+colon+cancers+and+their+metastases+to+liver.">Extracellular matrix signatures of human primary metastatic colon cancers and their metastases to liver.</a> BMC Cancer. 14 (1), 518 (2014).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters.">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, e01308 (2014).</li><li>Naba, A., Ding, H., Whittaker, C. A., Hynes, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Tsuchiya, T., Balestrini, J. L., Mendez, J. J., Calle, E. A., Zhao, L., Niklason, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+pH+on+extracellular+matrix+preservation+during+lung+decellularization.">Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (12), 1028-1036 (2014).</li><li>Byron, A., Humphries, J. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+extracellular+matrix+using+proteomics.">Defining the extracellular matrix using proteomics.</a> Int J Exp Pathol. 94 (2), 75-92 (2013).</li><li>Wilson, R., Diseberg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Belluoccio, D., Wilson, R., Thornton, D. J., Wallis, T. P., Gorman, J. J., Bateman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+growth+plate+cartilage.">Proteomic analysis of mouse growth plate cartilage.</a> Proteomics. 6 (24), 6549-6553 (2006).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Dom&#233;nech, N., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+extraction+methodology+for+cardiac+extracellular+matrix+prior+to+proteomics+analysis.+In.">A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. In.</a> Heart Proteomics: Methods and Protocols. 1005, 215-223 (2013).</li><li>Hansen, K. C., Kiemele, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-solution+ultrasonication-assisted+digestion+method+for+improved+extracellular+matrix+proteome+coverage.">An in-solution ultrasonication-assisted digestion method for improved extracellular matrix proteome coverage.</a> Mol. Cell Proteomics. 8 (7), 1648-1657 (2009).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Lennon, R., Byron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+reveals+the+complexity+of+the+human+glomerular+extracellular+matrix.">Global analysis reveals the complexity of the human glomerular extracellular matrix.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 25 (5), 939-951 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Modifiche Anche se abbiamo impiegato questa procedura esatta per arricchire la ECM da dieci tessuti e tipi di tumore 8-10, modifiche del protocollo devono essere considerati nei seguenti casi: 1) Individuazione di proteine ​​ECM nelle frazioni intermedie. Matrici extracellulari da tessuti diversi o tipi di tumore possono essere diversi nella loro estraibilità / insolubilità, come discusso in precedenza per la fibronectina e laminine. Ad esempio, si ritiene che la ECM di tessuti fibrotici o tessuti rimodellamento gira molto dinamico e quindi si potrebbe osservare una proporzione maggiore di proteine ​​ECM in quei tessuti per essere più prontamente estraibili 12. A seconda della frazione in cui vengono rilevate proteine ​​ECM, si consiglia di ridurre il tempo di incubazione della fase provocando l&#39;estrazione delle proteine ​​ECM o omettendo questo passo. 2) Detection di una percentuale significativa di componenti intracellulari nel pellet ECM-arricchito. In alcuni tessuti o tipi di tumore delle cellule rapporto: ECM è (tumori ad esempio, fegato, milza, non desmoplastici) particolarmente elevati. In tal caso, una contaminazione significativa della frazione ECM arricchita dalle proteine ​​intracellulari (in particolare delle proteine ​​citoscheletriche e / o istoni) può essere osservato. Per esaurire proteine ​​intracellulari in modo efficiente, si consiglia di ripetere gli incubazione in tampone M e / o tampone CS (entrambi i detergenti contenenti, questo di solito impoverisce abbondanti proteine ​​intracellulari). Un&#39;altra alternativa sarebbe quella di utilizzare i buffer alternativi con concentrazioni più elevate di detergenti, con l&#39;avvertenza che questo può portare al depauperamento di proteine ​​ECM relativamente più solubili e (vedi paragrafo successivo). 3) In alternativa al utilizzando un kit commerciale. Non è stato possibile, per ragioni di proprietà, per ottenere la composizione precisa dei buffer from il fornitore del kit di estrazione delle proteine ​​Compartimentale. Tuttavia, abbiamo incluso nella Tabella 1 note sulla base della nostra esperienza con tamponi fatti in casa con detergente definito (NP-40, sodio desossicolato e SDS) concentrazioni di condurre estrazioni simili. Un recente studio ha inoltre evidenziato l&#39;importanza del pH di buffer decellularization di trattenere proteine ​​ECM 13. Limitazioni della tecnica Il metodo qui presentato si basa sul fatto che le proteine ​​ECM sono intrinsecamente più insolubili della maggior parte delle proteine ​​intracellulari. Tuttavia, il metodo descritto qui decellularization certamente estrae componenti solubili presenti nella ECM come alcuni fattori di crescita o enzimi-ECM rimodellamento. Sebbene proteine ​​ECM-associata strettamente legati a proteine ​​ECM sono stati rilevati dal proteomica in campioni preparati come descritto, questo metodo può essere troppo severe al profilo completamente la composizione di matrisome associataproteine. Importanza della tecnica rispetto ad altri metodi Il vantaggio del metodo presentato qui rispetto ad altri metodi è che può essere adattata alla natura del ECM di interesse: passaggi intermedi può essere omesso o ripetuta per prevenire la perdita di proteine ​​ECM o aumentare l&#39;esaurimento delle proteine ​​contaminanti intracellulari rispettivamente. Questo metodo utilizza anche solo minime quantità di detergenti che sono risciacquato per evitare la loro interferenza con successiva preparazione peptide e spettrometria di massa. Infine, il metodo descritto qui di digerire preparati proteici ricchi di ECM in peptidi ha anche il vantaggio di non richiedere di essere proteine ​​solubili e possono essere condotti su &quot;grezzi&quot; frazioni ECM-arricchito. Metodi decellularization alternativi che utilizzano chaotropes (come guanidina cloridrato) per studiare la composizione di ECM mediante spettrometria di massa hanno been riportati in letteratura (rivisto in 14), e sono stati utilizzati in combinazione con la spettrometria di massa per caratterizzare la composizione ECM della cartilagine 15,16, cuore 17, ghiandola mammaria 18 e 19 e vascolare glomerulare 20 membrane basali. Raccomandazioni Metodi decellularization impiegano tripsina per digerire le cellule non devono essere utilizzate se ECM sono arricchiti per proteomica successive analisi, come tripsinizzazione si tradurrà in parziale digestione ECM e la perdita di proteine ​​ECM e peptidi. Allo stesso modo, se digestione collagenasi dovesse essere usato per aiutare frammentazione del tessuto, avrebbe bisogno di essere monitorati attentamente provoca ECM digestione e perdita di proteine ​​ECM e peptidi. In soluzione contro digestione in gel? Proteine ​​ECM sono interconnessi e altamente insolubile e, anche quando risospese in tampone 3x Laemmli (contenente 6% SDS) e 100 mm DTT, po separataOrly su gel SDS. Così in-gel digestione non è un metodo preferito. Le future applicazioni Vale la pena notare che, pur non discusso qui, la composizione di ciascuna delle frazioni intermedie raccolti durante la decellularization potrebbe anche essere analizzato mediante spettrometria di massa. Questo può essere particolarmente prezioso quando si studiano campioni molto piccoli (cioè, biopsie umane) oppure quando si desidera informazioni su altre frazioni cellulari.

La matrice extracellulare (ECM) è un complesso reticolo di proteine ​​reticolati e glicosilata che fornisce il supporto architetturale e di ancoraggio per le cellule e definisce, in parte, le proprietà biomeccaniche dei tessuti &#39;1,2. Proteine ​​ECM segnalano anche alle cellule sia direttamente attraverso i loro recettori (ad esempio, integrine, syndecans, etc.) o modulando fattore di crescita segnalazione 3. L&#39;ECM fornisce quindi spunti biofisici e biochimici che sono importanti regolatori del processi cellulari quali la proliferazione, la sopravvivenza, la polarizzazione, la differenziazione, la migrazione, etc. L&#39;ECM svolge un ruolo chiave nella fisiologia, lo sviluppo e l&#39;invecchiamento 4. Inoltre, diverse patologie, come le malattie cardiovascolari, la fibrosi, malattie muscolo-scheletrici, i tumori, sono causati da, o provocano alterazioni ECM. Inoltre, l&#39;ECM contribuisce al mantenimento di nicchie staminali e identificare molecole ECM chiave tha sostegno staminalità avranno applicazione diretta in ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa 5. Tuttavia, nonostante la sua importanza, la ECM è rimasta, fino a tempi recenti, underexplored 6. In silico analisi ha rivelato che la matrisome, definito come l&#39;insieme di ECM e proteine ​​ECM-associata, comprende i prodotti di diverse centinaia di geni sia nel umane e murine genomi 1,7,8. Tuttavia, l&#39;insolubilità di proteine ​​ECM ha ostacolato la caratterizzazione sistematica della composizione di matrici extracellulari in vivo di campioni normali e patologici. Abbiamo dimostrato recentemente che questo insolubilità potrebbe essere girato a vantaggio e possono essere usate per arricchire proteine ​​ECM 8-10. Noi ed altri inoltre dimostrato che la spettrometria di massa era un metodo di scelta per caratterizzare la composizione della ECM 8 - 10, 13. Noidescrivere qui un procedimento decellularization che consiste di incubazione sequenziali in tamponi di pH diversi e concentrazioni saline e detergente. Questa procedura comporta l&#39;estrazione (o esaurimento) di proteine ​​citosoliche, nucleari, di membrana e del citoscheletro e l&#39;arricchimento di proteine ​​ECM. Abbiamo poi descritto come digerire preparati proteici ECM arricchiti in peptidi per la successiva analisi mediante spettrometria di massa. Utilizzando le procedure dettagliate ed illustrato, abbiamo arricchito con successo e caratterizzato da spettrometria di massa le matrici extracellulari provenienti da dieci diversi tessuti e tipi di tumore: normale polmone murino 8, umano e del colon murino 8,9, fegato umano 9, tumori colorettali umani e derivati metastasi epatiche 9, xenotrapianti melanoma 8, xenotrapianti tumorali mammarie 10, isolotti pancreatici murine e insulinomi murini (Naba et al., non pubblicati). Confronto tra le diverse matrisomes rivelato firme ECM tessutale e tumore-specifici che potrebbero ulteriormente essere usati come potenziali biomarker diagnostici o prognostici. Crediamo che questo procedimento può essere applicato ad altri campioni senza o relativamente lievi modifiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

La matrice extracellulare (ECM) è un complesso reticolo di proteine ​​cross-linked che offre spunti biofisici e biochimici che sono i principali regolatori della proliferazione cellulare, la sopravvivenza, la migrazione, ecc ECM svolge un ruolo importante nello sviluppo e nella diverse patologie tra cui cardio-vascolari e le malattie muscolo-scheletriche, la fibrosi e cancro. Così, che caratterizzano la composizione di ECM di tessuti normali e malati potrebbe portare alla identificazione di nuovi biomarcatori prognostici e diagnostici e potenziali bersagli terapeutici. Tuttavia, la natura stessa di proteine ​​ECM (grandi dimensioni, reticolati e un legame covalente, fortemente glicosilata) ha reso analisi biochimiche di ECM impegnativo. Per superare questa sfida, abbiamo sviluppato un metodo per arricchire ECMs dai tessuti e tumori freschi o congelati che sfrutta l&#39;insolubilità di proteine ​​ECM. Descriviamo qui in dettaglio la procedura di decellularization che consiste di i sequenzialencubations a tamponi di diversa pH e concentrazioni di sale e di detersivi e che si traduce in 1) l&#39;estrazione di intracellulare (citosolica, nucleare, membrana e citoscheletro) proteine ​​e 2) l&#39;arricchimento di proteine ​​ECM. Abbiamo poi descritto come deglycosylate e digerire preparati proteici ECM arricchiti in peptidi per la successiva analisi mediante spettrometria di massa.

Il controllo di qualità della procedura decellularization L&#39;efficienza del decellularization può essere monitorato analizzando il contenuto proteico di ciascuna frazione mediante western blot. Tabella 2 elenca proteine ​​di valore diagnostico per valutare la qualità della procedura decellularization. La Figura 2A mostra l&#39;estrazione efficiente nelle frazioni intermedie di citosolico (GAPDH ), nucleare (istoni), membrana (β1 integrina) e del citoscheletro (actina) proteine, mentre non proteine ​​ECM (collagene I) viene rilevata in queste frazioni (Figura 2). A sua volta, il pellet finale è arricchito di proteine ​​ECM e largamente impoverito di proteine ​​intracellulari (Figura 2A). Figura 2B presenta soddisfacente proteina intracellulare deplezione (senza istoni viene rilevato nella frazione ricca di ECM), anche se, actina può ancora essere rilevato in la frazione ricca di ECM e l&#39;esaurimento delle monomerico collagene I- Peso molecolare apparente ~ 110 kDa, presumibilmente corrispondente al collagene smontato I - si può osservare nella frazione CS. Inoltre monitoriamo proteine ​​ECM aggiuntivi quali fibronectina e laminina, anche se, in alcuni tessuti questi componenti possono essere parzialmente solubilizzati in frazioni precedenti 8-10. Ad esempio, fibronectina si verifica anche fibronectina plasma solubile che non è incorporato nella ECM. Perfusione del tessuto prima dell&#39;estrazione riduce la concentrazione plasmatica fibronectina ma non sempre eliminarlo. In alcuni tessuti, laminine sono trovato vagamente associata alla superficie cellulare o l&#39;ECM ed estratto in frazioni intermedie. In questo caso può essere affrontato da alterare le condizioni di estrazione (vedi la discussione). Si noti che l&#39;arricchimento di proteine ​​ECM e deplezione concomitante di componenti intracellulari si basa sulla relativa solubilità delle proteine ​​nei diversi buffer. Thè differisce tra diversi tessuti - in alcuni casi le istoni e actina sono più facilmente estratti che in altri. Inoltre noti che, anche se istoni dovrebbero essere estratto nella frazione N (Figura 2B), si osserva spesso una deplezione completa degli istoni nella M o frazione CS (Figura 2A e B). Concentrazione peptide indicativo previsto La concentrazione della soluzione di peptide ottenuto dopo la digestione, acidificazione e dissalazione può essere misurato mediante spettrofotometria o misurando l&#39;assorbanza della soluzione di peptide utilizzando la lunghezza d&#39;onda di 280 nm corrispondente alla triptofano, tirosina, o utilizzando la lunghezza d&#39;onda di 205 nm corrispondente alla assorbanza del peptide obbligazioni. Abbiamo misurato la concentrazione delle soluzioni peptidi ottenuti dalla decellularization di tre polmoni campioni murini (82 mg, 100 mg e 100 mg, rispettivamente) preparosso in parallelo e ottenuto da ciascuno: 424 ng / ml, 450 ng / ml, e 580 ng / ml di peptidi, rispettivamente. Identificazione di peptidi ECM mediante spettrometria di massa Analisi di spettrometria di massa della composizione di campioni di proteine ​​ECM-arricchito, preparati come qui descritto, ha mostrato che&gt; 70% dell&#39;intensità del segnale corrispondente al ECM e proteine ​​ECM-associata 8-10. Tabella 1. Volume di reagenti da kit Compartimentale Estrazione di decellularize 100 mg (peso umido) di tessuto o tumore. Questa tabella elenca la composizione e il volume di ogni buffer utilizzato per condurre la decellularization di 100 mg di tessuto o tumore. Un cocktail di inibitori delle proteasi è fornito come soluzione 50x e deve essere aggiunto ad ogni buffer 2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagenti dall&#39;abitacolo estrazione di proteine ​​Kit </td><td> Volume per 100 mg di tessuto </td><td> Composizione (sulla base di Millipore datasheet cat # 2145 1) </td></tr><tr><td> Buffer C </td><td> 500 microlitri </td><td> HEPES (pH 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate 5 </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 ml </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate </td></tr><tr><td> Buffer N </td><td> 150 ml x 2 </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, NaCl, EDTA, glicerolo, sodio orthovanadate </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 ml </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate </td></tr><tr><td> Buffer M </td><td> 100 pl </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio desossicolato (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Sodio orthovanadate </td></tr><tr><td> Buffer CS </td><td> 200 ml </td><td> TUBI (pH 6,8), MgCl 2, NaCl, EDTA, saccarosio, sodio Dodecyl solfato (SDS) 7, sodio orthovanadate </td></tr><tr><td> Buffer C </td><td> 150 ml </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, saccarosio, glicerolo, sodio orthovanadate </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 microlitri / lavaggio </td><td> - </td></tr></tbody></table> Note: 1 Per motivi di proprietà, siamo stati in grado di ottenere la composizione precisa dei buffer di fornitura del kit, ma includiamo qui alcune note sulla base della nostra esperienza con tamponi fatti in casa per condurre estrazioni simili. 2 inibitori della proteasi: si consiglia di includere una varietà di inibitori contro cisteina, serina e peptidasi treonina, serina esterasi, metalloproteinasi cationi-dipendente bivalenti etc.Esistono molti cocktail inibitori della proteasi disponibili in commercio. 3 pH superiore a 7.0 è un efficace inibitore di proteasi lisosomiali. 4 EDTA (di solito usato a 2 mm) è un efficace inibitore di proteasi cationi-dipendente bivalenti. 5 sodio orthovanadate è un inibitore della fosfatasi. Una tipica concentrazione efficace sarebbe 0,5-5 mm. 6 NP40 a 0.1% -0.5% è sufficiente a solubilizzare i lipidi di membrana più. La combinazione di NP40 e DOC - spesso utilizzato a concentrazioni uguali (ad esempio, 0,5% per ciascuno) - è spesso usato come una estrazione più rigorosa che lascia ancora molte interazioni proteina-proteina intatto. 7 SDS è un detergente ionico più spinto (CMC 0,1%). Può essere utilizzato anche in combinazione con le altre due detergenti SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% come un buffer stringenza intermedio. Tabella 2. proteine ​​diagnostici amonitorare la qualità della procedura decellularization. In questa tabella sono elencati esempi di proteine ​​che sono caratteristiche di ciascun compartimento subcellulare (citosol, nucleo, membrana plasmatica, citoscheletro e ECM) che può essere utilizzato per monitorare la qualità della procedura decellularization e l&#39;efficienza del ECM-arricchimento. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Intracellulare Vano </td><td> Proteine ​​diagnostiche </td></tr><tr><td> Proteine ​​citosoliche </td><td> Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) </td></tr><tr><td> Proteine ​​nucleari </td><td> Gli istoni, le lamine, nucleoporin </td></tr><tr><td> Le proteine ​​di membrana </td><td> Le integrine, transferrina recettore </td></tr><tr><td> Proteine ​​del citoscheletro </td><td> Actina, tubulina, Vimentin </td></tr><tr><td> Proteine ​​ECM membrana basale </td><td> Collagene IV, Nidogens, Laminine </td></tr><tr><td> Proteine ​​ECM interstiziali (interstitial) </td><td> Collagene I, collagene III, Collagene VI, fibronectina </td></tr></tbody></table> Per raccomandazione su anticorpi, vedere le nostre pubblicazioni 8-10. Tabella 3. Volume di reagenti per digerire campioni ECM arricchito in peptidi. Questa tabella elenca i reagenti utilizzati per sospendere di nuovo campioni di proteine ​​ECM-arricchito e ridurre alchilata, deglycosylate e digerire le proteine ​​dei campioni in peptidi prima di analisi di spettrometria di massa. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Preparazione </td><td> Concentrazione Finale / Importo per pellet 1 millimetro di spessore (~ 5-10 mg peso secco) </td><td> Volume per la pallina 1 millimetro di spessore (~ 5-10 mg peso secco) </td></tr><tr><td> Bicarbonato di ammonio (NH 4 HCO 3) </td><td> Soluzione 100 mM in acqua HPLC-grade </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Urea </td><td> 8 M in soluzione 100 mM di bicarbonato di ammonio </td><td> 8 M </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> Ditiotreitolo </td><td> Ricostituire in acqua HPLC-grade a 500 mm </td><td> 10 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> Ricostituire in acqua HPLC-grade a 500 mm </td><td> 25 MM </td><td> 2,5 microlitri </td></tr><tr><td> Peptide- N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> Soluzione commerciale a 500 U / mL </td><td> 1.000 U </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Endoproteinase LysC, spettrometria di massa-grade </td><td> Ricostituire in acqua HPLC-grade a 0.5 mg / mL </td><td> 1 mg </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Tripsina, Spettrometria di Massa-grade (turno 1) </td><td> Soluzione commerciale a 0.5 mg / mL </td><td> 3 mg </td><td> 6 ml </td></tr><tr><td> Tripsina, Spettrometria di Massa-grade (turno 2) </td><td> Soluzione commerciale a 0.5 mg / mL </td><td> 1.5 mcg </td><td> 3 pl </td></tr><tr><td> L&#39;acido Trifluoro-acetico (TFA) </td><td> Soluzione al 50% in acqua HPLC </td><td> - </td><td> 2-5 microlitri </td></tr><tr><td> Acetonitrile (eluizione) </td><td> Soluzione al 60% con 0,1% TFA in acqua per HPLC </td><td> - </td><td> 500 microlitri </td></tr><tr><td> Acetonitrile (ricostituzione) </td><td> Soluzione 3% con 0,1% TFA in acqua per HPLC </td><td> - </td><td> 100 pl </td></tr></tbody></table><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Schema della procedura sperimentale. Workflow schematica della protocol per decellularize tessuti (sezione 1), il controllo della qualità del decellularization e valutare l&#39;arricchimento ECM (sezione 2) e digerire campioni di proteine ​​ECM arricchiti in peptidi prima di massa spettrometria (sezione 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Controllo della qualità della procedura decellularization mediante western blot Western blot sono stati eseguiti su polmone murino (A) e di carcinoma mammario umano xenotrapianto (B) campioni utilizzando i seguenti anticorpi:. Coniglio anti-actina (clone 14-1) e anti coniglio -β1 integrina anticorpi prodotti nel nostro laboratorio; coniglio anti-collagene I, topo anti-GAPDH e anticorpi di coniglio anti-pan-istoni erano da Millipore. Dopo l&#39;incubazione anticorpo primario, le membrane sono state lavate ed incubate in presenza di HRP-coniugato capra anti-coniglio o di capra anti-mouse anticorpo secondario da Jackson ImmunoResearch Laboratory. Infine, le membrane sono state lavate ed incubate a Western lampo ™ chemiluminescenza Reagent (PerkinElmer LAS). * Indica contaminazione istone minima residua della frazione ricca di ECM. ** Indica esaurimento parziale di monomero (presumibilmente da montare) collagene I nella frazione CS. *** Indica la contaminazione actina residuo della frazione ricca di ECM. Il striscio rilevato con l&#39;anticorpo anti-collagene rappresenta diversi livelli di modificazioni post-traduzionali (es, cross-linking, glicosilazione).

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l&#39;analisi Spettrometria di Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

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Biology

26.8K Views.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave mobilità ionica-spettrometria di massa: Basic procedure sperimentali per l&#39;analisi delle proteine ​​complesse

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Pressione atmosferica Imaging molecolare di tessuti biologici e biofilm da LAESI Spettrometria di Massa

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Analisi diretta di singole cellule mediante spettrometria di massa a pressione atmosferica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio &amp; massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A Rapid, metodo scalabile per l&#39;isolamento, studio funzionale, e analisi di Cell-derivati ​​matrice extracellulare

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento delle ghiandole mammarie Mouse intatto, intero per l'analisi di espressione di matrice extracellulare e la morfologia della ghiandola

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Arricchimento della matrice extracellulare proteine ​​da tessuti e digestione in Peptidi per l'analisi Spettrometria di Massa

Arricchimento della matrice extracellulare proteine da tessuti e digestione in Peptidi per l'analisi Spettrometria di Massa