The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense&#160;DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240&#160;to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.

HINWEIS: Das Verfahren kann auf frisch oder schockgefroren Gewebe durchgeführt werden. Wir empfehlen Perfusion stark vaskularisierten Gewebe mit PBS bei der Präparation zu beseitigen roten Blutzellen und Plasmaproteine. Wir empfehlen nicht, die Durchführung der Verfahren auf festen Geweben Fixierung (dh chemische Vernetzung) stört Dezellularisierung und kann auch nachfolgende Massenspektrometrie-Analyse erheblich beeinträchtigen. Für das gesamte Verfahren, empfehlen wir den Einsatz von Low-Haltegefäße und Pipettenspitzen, um Protein- und Peptid-Erholung zu maximieren. 1. Dezellularisierung von Geweben oder Tumoren Hinweis: Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die Reagenzien und fügen Sie Protease-Inhibitoren (mit dem Compartment Protein Extraction Kit enthalten) auf die gewünschte Lautstärke der einzelnen Puffer. Alle Puffer und Proben sollten für die Dauer des Experiments, außer dem Puffer CS, die bei Raumtemperatur gehalten werden, um zu verhindern, muss SDS Werte auf Eis gehalten werden,itation. ANMERKUNG: Das Protokoll verwendet eine Reihe von Inkubation in Puffern verschiedener pH-Wert und die unterschiedliche Menge an Salzen und Detergentien zu extrahieren intrazelluläre Proteine ​​sequentiell und bereichern unlösliche ECM Proteine ​​(Figur 1, Tabelle 1, siehe auch Beiträge zu Alternativen für die Verwendung des kommerziellen Kit hier beschrieben). Die Volumina der Reagenzien unten sind für 100 mg von Geweben oder Tumoren (siehe Tabelle 1) und müssen entsprechend angepasst werden. <ol><li> Homogenisieren 100 mg Gewebe in 500 ul Puffer C, der Protease-Inhibitoren unter Verwendung eines Gewebe-Homogenisators bis das Gewebe vollständig unterbrochen und eine homogene Suspension erhalten wird. HINWEIS: In Deoxyribonuclease I (Endkonzentration: 200 &amp; mgr; g / ml, entsprechend den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert) und Ribonuklease A (Endkonzentration: 20 ug / ml, entsprechend den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert) anBuffer N. </li><li> Sequentiellen Extraktion von intrazellulären löslichen Proteinen <ol><li> Die Extraktion der cytosolischen Proteine. Inkubieren des Homogenats auf einem Schwenker 20 min bei 4 ° C. Speichern Sie ein kleines Aliquot (10 ul bis 20 ul) des Homogenisats für die anschließende Western Blot-Analyse (siehe Abschnitt Erwartete Ergebnisse und Abbildung 2). </li><li> Zentrifugieren des Homogenats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen, wird dies die cytosolische (C) Bruchteil der Western Blot-Analyse darstellen. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C. </li><li> Zum Waschen, das Pellet in 400 ul Puffer B, enthaltend Proteaseinhibitoren und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 20 min bei 4 ° C. Zentrifugieren des Homogenats bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Zu extrahieren, Kernproteinen, das Pellet in 150 ul Puffer N Proteaseinhibitoren enthielt, deoxyribonuclease I und Ribonuclease A und Inkubieren der Probe auf einem Schwenker 30 min bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C und sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal: nach dem Zentrifugieren der Probe zum zweiten Mal, fügen Sie den Überstand zur vorherigen Überstand: dies wird die Kern (N) Bruchteil der Western Blot-Analyse dar. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C. Führen Sie dann die Waschlösungen gemäß Schritt 1.2.3. </li><li> Membranproteine ​​zu extrahieren, das Pellet in 100 ul Puffer M enthaltend Proteaseinhibitoren und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 30 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 30 min bei 4 ° C </li><li> Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen: dies wird die Membran (M) Bruchteil der Western Blot-Analyse dar. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C. </li><li> Zu Cytoskelettproteine ​​extrahieren das Pellet in 200 ul Puffer CS Proteaseinhibitoren enthielt und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 30 min bei RT. Man beachte, dass das Pellet nicht vollständig lösen. Wir schlagen vor, Störung der Pellet durch Auf- und Abpipettieren, bis die Beobachtung Störung des Pellets. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 30 min bei RT. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen. Beachten Sie an dieser Stelle eine weitere deutliche Verringerung der Größe des Pellets (siehe Video). </li><li> Das Pellet in 150 ul Puffer C, der Proteaseinhibitoren und inkubieren der Probe auf einem Schwenker 20 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Sammeln des Überstandes, und es zum vorherigen Überstand hinzu: dies wird die Zytoskelett (CS) Bruchteil der Western Blot-Analyse darstellen. Blitzeis diese Fraktion und bei -80 ° C. </li><li> Führen Sie zusätzliche Wäschen. Das Pellet in 500 ul PBS, enthaltend Protease-Inhibitoren einnd inkubieren der Probe auf einem Schwenker 5 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Hinweis: alle Spuren von Detergentien müssen durch extensive Waschungen vor der Spaltung der Proteine ​​in Peptide (siehe Abschnitt 3) entfernt werden. An diesem Punkt kann das ECM angereicherte Pellet schockgefroren und bei -80 ° C gehalten. Man beachte, dass die Größe des Pellets wird auf die Menge des unlöslichen (ECM) Proteinen im Ausgangsmaterial und den Wirkungsgrad der Dezellularisierung abhängen. </li></ol></li></ol> 2. die Überwachung der Qualität des Dezellularisierung / ECM Enrichment durch SDS-PAGE und Western Blot <ol><li> Mischen Sie 10-20 ul-Aliquot der gesamten Gewebeextrakt und 50 ul Aliquots von Zwischenfraktionen mit Laemmli-Puffer, der 100 mM DTT. Resuspendieren ECM-angereicherten, unlösliche Fraktion in 3x Laemmli-Puffer, der 100 mM DTT. Hinweis: er erhöhte Konzentrationenvon DTT und SDS unterstützen Solubilisierung von ECM-Proteinen, die relativ unlöslich sind. </li><li> Trennen der Proteine ​​durch SDS-PAGE und auf Nitrocellulosemembranen transferiert. </li><li> Führen immun-Blots unter Verwendung von Antikörpern gegen Proteine ​​repräsentativ für jede der cytosolischen, nuklear, Membran, Zytoskelett und ECM-Fraktionen zu überwachen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Tabelle 2 und Abbildung 2). </li></ol> 3. In-Lösung Verdauung der Proteine, um Peptide für Massenspektrometrie-Analyse HINWEIS: Die nach der Dezellularisierung Verfahren und Entfernung von SDS erhaltene Pellet wird stark angereicherte unlöslich ECM Proteine ​​für die weitere Analyse durch Massenspektrometrie Diese Proteine ​​müssen in Peptide verdaut werden. Man beachte, dass als Folge der ECM Proteinunlöslichkeit, ist es nicht möglich, bei diesem Schritt um die Proteinkonzentration der Probe zu messen. Wir bieten damit Volumina von Reagenzien, um die ECM-enri verdauenCHED Proben in Peptide basierend auf der Größe (mm) oder Trockengewicht des ECM-angereicherte Pellet (Tabelle 3). Die Lösungen aus Ammoniumbicarbonat, Harnstoff, DTT, Iodacetamid und Trifluoressigsäure alle müssen frisch hergestellt werden. <ol><li> Resuspendieren ECM-angereicherten Probe durch Hinzufügen der erforderlichen Menge von 8 M Harnstoff in dem ECM-angereicherte Pellet und fügen DTT in einer Endkonzentration von 10 mM (siehe Tabelle 3). Inkubiere unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für 2 h bei 37 ° C. HINWEIS: An diesem Punkt der ECM-Proteine ​​nicht vollständig gelöst werden, und die sichtbare große Proteinpartikel nicht durch Zentrifugation oder Filtration verworfen. Die Suspension wird nach Deglykosylierung und Verdauung (siehe Video) zu löschen. </li><li> Alkylierung <ol><li> Bereiten Sie die Lösung Iodacetamid in HPLC-Qualität Wasser. Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur und fügen Sie die Iodacetamid zu einer Endkonzentration von 25 mM. Für eine vollständige Alkylierung, die DTT: sollte iodoacetamide Verhältnis zwischen 1: 2.5 und 1: 3. </li><li> Inkubieren im Dunkeln für 30 min bei RT. </li></ol></li><li> Deglycosylation: Anmerkung: Deglykosylierung wird benötigt, um Kohlenhydrat-Seitenketten, die mit der Identifizierung von Peptiden, die von N modifiziert stören -verknüpften Glycosylierungsstellen entfernen. <ol><li> Zu verdünnen, um 2 M Harnstoff mit 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, und fügen Sie die entsprechende Menge an PNGaseF (siehe Tabelle 3). Inkubiere unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Verdauung <ol><li> Hinzuzufügen Lys-C und Inkubation unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für 2 h bei 37 ° C. Fügen Sie die Trypsin und Inkubation unter ständigem Rühren bei 1.400 rpm O / N bei 37 ° C. HINWEIS: das ECM-reiche Suspension, die trüb beim erstmaligen Rekonstitution in 8 M Harnstoff begann klar erscheint nach O / N Verdauung (siehe Video). </li><li> Hinzufügen eines zweiten Aliquots von Trypsin zur Probe und Inkubation unter ständigem Rühren bei 1.400 Upm für weitere 2 Stunden bei 37 ° C. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Versauerung <ol><li> Nach Abschluss der Verdauung, das Trypsin zu inaktivieren durch Ansäuern der Probe mit frisch hergestellten 50% Trifluoressigsäure (TFA). Die Probe sollte pH &lt;2 erreichen Wir schlagen die Zugabe von 1-1,5 ul 50% TFA zu einer Zeit und unter Verwendung von 1 &amp; mgr; l der Peptidlösung, um den pH-Wert der Lösung mit pH-Papier (siehe Video) zu messen. </li><li> Zentrifugieren Sie die angesäuerten Probe bei 16.000 xg für 5 min bei RT. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Low-Retention-Röhre. An diesem Punkt kann das Peptid-Lösung bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol></li><li> Entsalzung Beachte, daß dieser letzte Schritt wird üblicherweise bei einer Massenspektrometrie Einrichtung nach seinem eigenen bevorzugten Verfahren durchgeführt. <ol><li> Vor der Proteomanalyse, die Proben entsalzen und Peptide mit frisch zubereiteten 60% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure, gefolgt von Konzentration in einem Vakuumkonzentrator eluiert. Resuspendieren der Peptide in frisch zubereiteten 3% acetonitrIle, 0,1% Trifluoressigsäure 8. HINWEIS: dass nach dem Entsalzen wurde die Konzentration der Peptidlösung kann spektralphotometrisch gemessen werden (siehe Erwartete Ergebnisse Abschnitt). </li><li> Jetzt analysieren die Probe durch Massenspektrometrie, wieder nach den optimalen Verfahren der Massenspektrometrie Möglichkeiten. HINWEIS: Wir empfehlen die Forscher interessiert Charakterisierung der Zusammensetzung der ECM unter Verwendung von Massenspektrometrie, um unsere anderen Publikationen 8 beziehen - 10 und Website, die weitere detaillierte Erklärung, einschließlich LC-MS / MS-Parameter, Massenspektrometrie Daten Suche nach Proteinidentifikation und Datenanalyse bieten unter Verwendung der in silico matrisome Annotationstool wir entwickelt 8. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Änderungen Obwohl wir verwendet genau dieses Verfahren, um das ECM aus zehn Gewebe und Tumorarten bereichern 8 - 10, Änderungen des Protokolls sollte in den folgenden Fällen in Betracht gezogen werden: 1) Nachweis der ECM-Proteine ​​in den Zwischenfraktionen. Extrazelluläre Matrices aus unterschiedlichen Geweben oder Tumorarten können in ihrer Extrahierbarkeit / Unlöslichkeit unterscheiden, wie oben für Fibronektin und Laminin diskutiert. Beispielsweise wird angenommen, dass das ECM von fibrotischen Geweben oder Umbau Gewebe dreht sehr dynamisch und somit könnte man einen höheren Anteil an extrazellulären Matrixproteinen in diesen Geweben zu beobachten, leichter extrahierbar 12 sein. Abhängig von der Fraktion, in der ECM-Proteinen erkannt werden, schlagen wir die Verringerung der Inkubationszeit der Schritt bewirkt die Extraktion von ECM-Proteine ​​oder Weglassen diesen Schritt. 2) Detection eines erheblichen Teils der intrazellulären Komponenten der ECM angereicherte Pellet. In einigen Geweben oder Tumorarten das Verhältnis Zellen: ECM besonders hoch ist (beispielsweise Leber, Milz, nicht-desmoplastischen Tumoren). In diesem Fall kann eine signifikante Kontaminierung der ECM-angereicherten Fraktion durch intrazelluläre Proteine ​​(insbesondere Zytoskelett-Proteine ​​und / oder Histone) beobachtet werden. Um intrazelluläre Proteine ​​effizient, schlagen wir vor, sich wiederholenden doppelten Inkubation in Puffer M und / oder Puffer CS (beide haltige Reinigungsmittel, dies in der Regel verbraucht reichlich intrazelluläre Proteine) führen. Eine andere Alternative wäre, alternative Puffer mit höherer Detergenzkonzentrationen verwenden, mit dem Vorbehalt, dass dies zum Abbau von relativ löslicheren ECM Proteine ​​sowie führen (siehe nächster Absatz). 3) Alternative zur Verwendung eines kommerziellen Kits. Wir waren nicht in der Lage, für proprietäre Gründen, die genaue Zusammensetzung der Puffer fro erhaltenm die Lieferanten, der das Protein Extraction Kit Compartmental. Allerdings haben wir in Tabelle 1 Notizen auf der Grundlage unserer eigenen Erfahrungen mit hausgemachten Puffer mit definierten Reinigungsmittel (NP-40, Natriumdesoxycholat und SDS) Konzentrationen ähnliche Extraktionen durchzuführen enthalten. Eine neuere Studie auch auf die Wichtigkeit des pH Dezellularisierung Puffer ECM Proteine ​​13 beizubehalten. EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK Das hier vorgestellte Verfahren beruht auf der Tatsache, daß ECM-Proteine ​​sind intrinsisch unlöslich als die meisten intrazellulären Proteinen. Jedoch ist die hier beschriebene Methode Dezellularisierung sicher extrahiert innerhalb des ECM vorliegenden löslichen Bestandteile wie einige Wachstumsfaktoren oder ECM-Umbau Enzyme. Obwohl ECM-assoziierten Proteine ​​fest an ECM Proteine ​​gebunden wurden von Proteomik in Proben, hergestellt wie beschrieben, nachgewiesen, kann dieses Verfahren zu streng sein, um vollständig das Profil der Zusammensetzung matrisome assoziiertenProteinen. Bedeutung der Technik in Bezug auf andere Verfahren Der Vorteil der hier gegenüber anderen Methoden vorgestellten Verfahren ist, dass es auf die Art des ECM von Interesse angepasst werden: Zwischenschritte können entfallen oder wiederholt, um den Verlust von ECM-Proteinen verhindern oder steigern die Depletion von kontaminierenden intrazelluläre Proteine ​​sind. Auch dieses Verfahren verwendet nur minimale Mengen an Waschmittel, die ausgespült werden, um ihre Interferenz mit anschließender Peptidzubereitung und Massenspektrometrie zu verhindern. Schließlich hat die hier beschriebenen ECM-reiche Proteinzubereitungen in Peptide verdaut Verfahren auch den Vorteil, nicht erforderlich Proteine ​​löslich zu sein und kann auf &quot;rohes&quot; ECM-angereicherten Fraktionen durchgeführt werden. Alternative Verfahren, die Dezellularisierung Chaotropen (wie Guanidin-Hydrochlorid) um die Zusammensetzung der ECMs durch Massenspektrometrie studieren been in der Literatur beschrieben (in 14 überprüft), und wurden in Kombination mit der Massenspektrometrie verwendet, um die ECM-Zusammensetzung Knorpel 15,16, Herz 17, Brustdrüse 18 und Gefäß 19 und 20 glomerulären Basalmembranen charakterisieren. Empfehlungen Dezellularisierung Verfahren, die Trypsin zu verdauen aus Zellen sollten nicht verwendet werden, wenn ECM für nachfolgende Proteomik angereichert analysiert werden, wie Trypsinierung wird in Teil ECM Verdauung und Verlust von ECM Proteinen und Peptiden führen. Und falls Kollagenaseverdau sollten verwendet werden, um Gewebe-Zerstörung zu unterstützen, müsste sorgfältig überwacht werden, da es ECM Verdauung und Verlust von ECM-Proteinen und Peptiden verursacht. In-Lösung gegen In-Gel-Verdauung? ECM-Proteine ​​sind vernetzt und stark unlöslich, und selbst wenn in 3x Laemmli-Puffer (enthaltend 6% SDS) und 100 mM DTT, separate poorly auf SDS-Gelen. Somit im Gel Verdauung ist kein bevorzugtes Verfahren. Zukünftige Anwendungen Es ist erwähnenswert, dass, obwohl hier nicht diskutiert, die Zusammensetzung von jedem der Zwischenfraktionen bei der Dezellularisierung gesammelt könnte auch durch Massenspektrometrie analysiert werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn das Studium sehr kleine Proben (dh menschlicher Biopsien) oder, wenn Informationen auf anderen Zellfraktionen gewünscht.

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Geflecht aus vernetztem und glycosylierte Proteine, die architektonische Unterstützung und Ankerplatz für Zellen und definiert bietet, zum Teil, Gewebe &#39;biomechanischen Eigenschaften 1,2. ECM-Proteine ​​Signale auch auf den Zellen entweder direkt durch ihre Rezeptoren (zB Integrinen Syndecane usw.) oder durch Modulieren Wachstumsfaktor-Signalisierungs 3. Das ECM stellt somit biophysikalische und biochemische Signale, die wichtigsten Regulatoren der zellulären Prozessen wie Proliferation, Überleben, Polarisation, Differenzierung, Migration, etc. sind Das ECM spielt eine Schlüsselrolle in der Physiologie, Entwicklung und Alterung 4. Darüber hinaus sind mehrere Pathologien wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fibrose, Muskel-Skelett-Erkrankungen, Krebserkrankungen, hervorgerufen durch oder führen, ECM Veränderungen. Außerdem trägt die ECM für die Aufrechterhaltung der Stammzellnischen und die Identifizierung von wichtigen ECM-Moleküle thUnterstützung bei stemness haben direkten Anwendung im Tissue Engineering und der regenerativen Medizin 5. Trotz seiner Bedeutung hat die ECM blieb bis vor kurzem underexplored 6. In-silico-Analyse ergab, daß das matrisome, definiert als die Gesamtheit der ECM und ECM-assoziierten Proteinen umfasst, die Produkte von mehreren hundert Genen sowohl in der Human- und Maus-Genom 1,7,8. Allerdings hat die Unlöslichkeit ECM Proteine ​​die systematische Charakterisierung der Zusammensetzung der in vivo extrazellulären Matrizen von normalen und pathologischen Proben behindert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass diese Unlöslichkeit könnte wandte sich vorteilhaft eingesetzt werden und verwendet werden, um ECM-Proteine ​​bereichern 8 - 10. Wir und andere weiter gezeigt, daß die Massenspektrometrie ein Verfahren der Wahl, um die Zusammensetzung zu charakterisieren ECMs 8 - 10, 13. Wirbeschreiben hier eine Dezellularisierung Prozedur, die von aufeinanderfolgenden Inkubationen in Puffern unterschiedlicher pH-Wert und Salzkonzentrationen und Reinigungsmittel besteht. Dieses Verfahren resultiert in der Extraktion (oder Verarmung) cytosolischer, Kernmembran und Zytoskelettproteine ​​und die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen. Wir beschreiben nun, wie ECM-angereicherten Proteinzubereitungen in Peptide für die anschließende Analyse durch Massenspektrometrie verdauen. Unter Verwendung der Verfahren detailliert und hier dargestellt, haben wir erfolgreich angereichert und durch Massenspektrometrie die extrazelluläre Matrix aus zehn verschiedenen Geweben und Tumorarten: normal Mäuselunge 8, humanen und murinen Colon 8,9, menschliche Leber 9, menschlichen kolorektalen Tumoren und abgeleiteten Leber-Metastasen 9, Melanom Xenotransplantate 8, Mammatumor-Xenotransplantaten 10. murine Pankreasinseln und murine Insulinom (Nabas et al., unveröffentlicht). Der Vergleich der verschiedenen matrisomes ergab gewebe- und tumorspezifischen ECM Signaturen weiterhin als mögliche diagnostische oder prognostische Biomarker verwendet werden könnten. Wir glauben, daß dieses Verfahren auch für andere Proben ohne oder mit nur relativ geringfügigen Modifikationen angewandt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer: Bullet blender + beads</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BB24-AU</td>
			<td>http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compartmental Extraction kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>2145</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC-grade water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U4883</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20291</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (NH4HCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>125-05061</td>
			<td>http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoro-acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, mass spectrometry-grade&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186000383</td>
			<td>http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein komplexes Geflecht von vernetzten Proteinen, die biophysikalische und biochemische Signale, die wichtigsten Regulatoren der Zellproliferation, Überleben, Migration, etc. sind die ECM spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung und in diverse Pathologien einschließlich Herz-Kreislauf bietet und Muskel-Skelett-Erkrankungen, Fibrose und Krebs. Somit charakterisieren die Zusammensetzung ECMs von normalen und erkrankten Geweben könnte zur Identifizierung neuer prognostische und diagnostische Biomarker und potentielle neue therapeutische Targets führen. Allerdings hat die Natur des ECM-Proteine ​​(groß, vernetzt und kovalent gebunden, stark glykosyliert) biochemische Analysen der ECMs anspruchs gerendert. Um diese Herausforderung zu meistern, eine Methode, um ECMs von frischem oder gefrorenem Gewebe und Tumoren, die Vorteile der Unlöslichkeit von ECM-Proteinen führt zu bereichern entwickelten wir. Wir beschreiben hier im Detail die Dezellularisierung Prozedur, die von aufeinanderfolgenden i bestehtncubations in Puffern mit verschiedenen pH und Salz und Detergens-Konzentrationen und die Ergebnisse in 1) die Extraktion von intrazellulären (cytosolische, Kernmembran und Zytoskelett) Proteine, und 2) die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen. Wir beschreiben nun, wie deglycosylieren verdauen ECM angereicherte Proteinzubereitungen in Peptide für die anschließende Analyse durch Massenspektrometrie.

Qualitätskontrolle der Verfahren Dezellularisierung Die Effizienz der Dezellularisierung kann durch Analyse der Proteingehalt jeder Fraktion durch Western-Blot überwacht werden. In Tabelle 2 sind Proteine ​​der diagnostische Wert, um die Qualität der Dezellularisierung Verfahren zu bewerten. 2A zeigt die effiziente Gewinnung der Zwischenfraktionen von zytosolischen (GAPDH ), Kern (Histone), Membran (β1 Integrin) und Zytoskelett (Actin) -Proteine, während keine ECM-Proteine ​​(Kollagen I) wird in diesen Fraktionen nachgewiesen (Abbildung 2). Im Gegenzug wird das endgültige Pellet zur ECM Proteine ​​angereichert und weitgehend von intrazellulären Proteinen (Abbildung 2A). 2B zeigt zufriedenstellende intrazellulären Proteinabbau (kein Histon im ECM-reiche Fraktion nachgewiesen), obwohl, Actin noch erfasst werden abgereicherte das ECM-reiche Fraktion und die Erschöpfung der monomeren Kollagen I- Scheinbaren Molekulargewicht ~ 110 kDa, mutmaßlich um nicht zusammengebauten Kollagen I entspricht - kann in der CS-Fraktion zu beachten. Wir routinemßig zusätzlichen ECM-Proteine ​​wie Fibronectin und Laminin überwachen, obwohl in einigen Geweben können diese Komponenten teilweise in früheren Fraktionen 8-10 solubilisiert werden. Beispielsweise tritt Fibronectin als lösliche Plasmafibronektin, die nicht in der ECM enthalten ist. Durchblutung des Gewebes vor der Extraktion reduziert Plasma-Fibronektin-Konzentration, aber nicht immer beseitigen. In einigen Geweben, Laminine gefunden lose mit der Zelloberfläche oder der ECM und Extrakt in Zwischenfraktionen assoziiert. In diesem Fall kann es durch Änderung Extraktionsbedingungen (siehe Diskussion) angesprochen werden. Man beachte, dass die Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen und die gleichzeitige Entleerung der intrazellulären Komponenten basiert auf der relativen Löslichkeit von Proteinen in den verschiedenen Puffern basiert. Thist, unterscheidet sich bei den verschiedenen Geweben - in einigen Fällen die Histone und Aktin werden leichter extrahiert als in anderen. Beachten Sie auch, dass, obwohl Histone voraussichtlich im N-Fraktion (2B) extrahiert werden, beobachten wir oft eine vollständige Verarmung von Histonen in der M oder CS Fraktion (2A und B). Richtpeptidkonzentration erwartet Die Konzentration der nach Aufschluss, die Säuerung und Entsalzung erhaltene Peptidlösung kann entweder spektrophotometrisch durch Messung der Absorption der Peptidlösung unter Verwendung der 280 nm Wellenlänge, die Tryptophan, Tyrosin oder mit der 205 nm Wellenlänge, die Absorption des Peptids zu messen Anleihen. Wir maßen die Konzentration der von der Dezellularisierung von drei murine Lungen Proben erhaltenen Peptidlösungen (82 mg, 100 mg und 100 mg, jeweils) prepared parallel und voneinander erhalten: 424 ng / ul, 450 ng / ul, und 580 ng / &amp; mgr; l von Peptiden sind. Identifizierung von ECM Peptide durch Massenspektrometrie Massenspektrometrische Analyse der Zusammensetzung des ECM-angereicherten Proteinproben, hergestellt wie hier beschrieben, zeigte, daß&gt; 70% der Signalintensität entspricht ECM und ECM-assoziierten Proteine ​​8-10. Tabelle 1 Volumen der Reagenzien aus Compartmental Extraction Kit, um 100 mg (Nassgewicht) von Gewebe oder Tumor Dezellularisieren. In dieser Tabelle sind die Zusammensetzung und die Lautstärke der einzelnen Puffer verwendet, um die Dezellularisierung von 100 mg Gewebe oder Tumor zu führen. Ein Cocktail von Protease-Inhibitoren als 50x-Lösung zur Verfügung gestellt und müssen für jeden einzelnen Puffer 2 hinzugefügt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagenzien von Compartment Protein Extraction Kit </td><td> Volume 100 mg Gewebe </td><td> Zusammensetzung (bezogen auf Millipore Datenblatt cat # 2145 1) </td></tr><tr><td> Puffer C </td><td> 500 &amp; mgr; </td><td> HEPES (pH 7,9 3), MgCl 2, KCl, EDT 4, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat 5 </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 &amp; mgr; </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat </td></tr><tr><td> Puffer N </td><td> 150 ul x 2 </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, NaCl, EDTA, Glycerin, Natriumorthovanadat </td></tr><tr><td> Buffer W </td><td> 400 &amp; mgr; </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat </td></tr><tr><td> Buffer M </td><td> 100 &amp; mgr; </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumdesoxycholat (DOC) 6, NP-40 6 </sup&gt;, Natriumorthovanadat </td></tr><tr><td> Buffer CS </td><td> 200 &amp; mgr; </td><td> PIPES (pH 6,8), MgCl 2, NaCl, EDTA, Sucrose, Natriumdodecylsulfat (SDS) 7, Natriumorthovanadat </td></tr><tr><td> Puffer C </td><td> 150 &amp; mgr; </td><td> HEPES (pH 7,9), MgCl 2, KCl, EDTA, Sucrose, Glycerol, Natriumorthovanadat </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> 500 &amp; mgr; l / Waschgang </td><td> - </td></tr></tbody></table> Hinweise: 1 Für proprietäre Gründen konnten wir nicht die genaue Zusammensetzung der Puffer von dem Lieferanten, der das Kit zu erhalten, aber wir sind hier ein paar Notizen auf der Grundlage unserer eigenen Erfahrungen mit hausgemachten Puffer ähnliche Extraktionen durchzuführen. 2 Protease-Inhibitor: es ist ratsam, eine Vielzahl von Inhibitoren gegen Cystein, Serin und Threonin Peptidasen Serinesterasen, divalente kationenabhängige Metalloproteinasen usw. umfassenViele im Handel erhältliche Protease-Inhibitor-Cocktails existieren. 3 pH-Wert über 7,0 ist ein wirksamer Inhibitor der lysosomalen Proteasen. 4 EDTA (üblicherweise bei 2 mm verwendet wird) ist ein wirksamer Inhibitor von zweiwertigen Kationen abhängigen Proteasen. 5 Natriumorthovanadat ist eine Phosphatase-Inhibitor. Eine typische wirksame Konzentration würde 0,5-5 mm betragen. 6 NP40 bei 0,1% -0,5% ist ausreichend, um die meisten Membranlipiden solubilisieren. Die Kombination von NP40 und DOC - oft als strengere Extraktion noch lässt viele Protein-Protein-Wechselwirkungen intakt verwendet - oft bei gleichen Konzentrationen (beispielsweise 0,5% von jedem) verwendet. 7 ist ein SDS strengere ionisches Detergens (CMC 0,1%). Es kann auch in Kombination mit den anderen zwei Detergenzien SDS / NP40 / DOC 0,1 / 0,5 / 0,5% als Zwischen Stringenz-Puffer verwendet werden. Tabelle 2. Diagnostic ProteineÜberwachung der Qualität der Dezellularisierung Verfahren. Diese Tabelle Beispiele für Proteine, die Eigenschaften jedes subzellulären Kompartiment (Cytosol, Zellkern, Plasmamembran, Zellskelett und ECM), die verwendet werden können, um die Qualität der Dezellularisierung Verfahrens und die Effizienz der Überwachung auflistet ECM-Anreicherung. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Intrazellulären Kompartiment </td><td> Diagnostic Proteine </td></tr><tr><td> Cytosolproteine </td><td> Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) </td></tr><tr><td> Kernproteinen </td><td> Histone, Lamine, Nukleoporin </td></tr><tr><td> Membranproteine </td><td> Integrine, Transferrin Receptor </td></tr><tr><td> Zytoskelettproteine </td><td> Actin, Tubulin, Vimentin </td></tr><tr><td> Basalmembran ECM Proteine </td><td> Collagen IV, Nidogene, Laminine </td></tr><tr><td> Interstitial ECM-Proteine ​​(interstitielle) </td><td> Kollagen I, Kollagen III, Kollagen VI, Fibronectin </td></tr></tbody></table> Für Empfehlung auf Antikörpern siehe unsere Publikationen 8-10. Tabelle 3. Volumen von Reagenzien an ECM-angereicherten Proben in Peptide verdauen. Diese Tabelle enthält die verwendet werden, um ECM-angereicherten Proteinproben zu suspendieren und zu reduzieren, Alkylat, deglycosylieren und zu verdauen Proteine ​​in Peptide Proben vor der Massenspektrometrie-Analyse Reagenzien. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagenzien </td><td> Zubereitung </td><td> Endkonzentration / Betrag für 1 mm dicke Pellet (~ 5-10 mg Trockengewicht) </td><td> Volume 1 mm dicken Pellets (~ 5-10 mg Trockengewicht) </td></tr><tr><td> Ammoniumbicarbonat (NH 4 HCO 3) </td><td> 100 mM Lösung in HPLC-Qualität Wasser </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> 8 M-Lösung in 100 mM Ammoniumbicarbonat </td><td> 8 M </td><td> 50 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Dithiothreitol </td><td> Rekonstitution in HPLC-Qualität Wasser bei 500 mM </td><td> 10 mM </td><td> 1 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Iodacetamid </td><td> Rekonstitution in HPLC-Qualität Wasser bei 500 mM </td><td> 25 mM </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> Peptid-N -Glycosidase F (PNGaseF) </td><td> Kommerzielle Lösung bei 500 U / &amp; mgr; </td><td> 1.000 U </td><td> 2 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Endoproteinase LysC, Massenspektrometrie-grade </td><td> Rekonstitution in HPLC-Qualität Wasser bei 0,5 ug / ul </td><td> 1 &amp; mgr; </td><td> 2 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Trypsin, Massenspektrometrie-grade (Runde 1) </td><td> Kommerzielle Lösung von 0,5 ug / ul </td><td> 3 &amp; mgr; </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Trypsin, Massenspektrometrie-grade (Runde 2) </td><td> Kommerzielle Lösung von 0,5 ug / ul </td><td> 1,5 ug </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure (TFA) </td><td> 50% ige Lösung in HPLC-Qualität Wasser </td><td> - </td><td> 2-5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Acetonitril (Elution) </td><td> 60% ige Lösung mit 0,1% TFA in HPLC-reinem Wasser </td><td> - </td><td> 500 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> Acetonitril (Rekonstitution) </td><td> 3% ige Lösung mit 0,1% TFA in HPLC-reinem Wasser </td><td> - </td><td> 100 &amp; mgr; </td></tr></tbody></table><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Versuchsdurchführung. Schematic Workflow des Protocol, um Gewebe (Abschnitt 1) ​​Dezellularisieren, kontrollieren die Qualität des Dezellularisierung und bewerten die ECM-Anreicherung (Abschnitt 2) und zu verdauen ECM angereicherte Proteinproben in Peptide vor der Massenspektrometrie-Analyse (Abschnitt 3). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53057/53057fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Die Qualitätskontrolle der Dezellularisierung Verfahren durch Western Blot Western Blots wurden an Mäuselunge (A) und menschlichem Brustkarzinom Xenograft (B) Proben mit den folgenden Antikörpern durchgeführt:. Kaninchen-Anti-Aktin (Klon 14-1) und Kaninchen-Anti -β1 Integrin-Antikörper, in unserem Labor hergestellt werden; Kaninchen-Anti-Kollagen I, Maus anti-GAPDH und Kaninchen-Anti-pan-Histon-Antikörper waren von Millipore. Folgenden primären Antikörper-Inkubation wurden die Membranen gewaschen und in Gegenwart von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen- oder Ziegen-anti-mou inkubiertse Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch Laboratory. Schließlich wurden die Membranen gewaschen und im Western-Blitz ™ Chemilumineszenzreagenz (PerkinElmer LAS) inkubiert. * Zeigt minimale Rest Histon Verunreinigung des ECM reichen Fraktion. ** Zeigt teilweisen Erschöpfung der monomeren (mutmaßlich nicht zusammengebaut) Kollagen I in der CS-Fraktion. *** Zeigt an Rest Aktin Verunreinigung des ECM reichen Fraktion. Die mit dem Anti-Kollagen-Antikörper nachgewiesen Abstrich stellt verschiedene Ebenen der post-translationale Modifikationen (zB Vernetzung Glykosylierung).

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.8K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology. This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry. 

Serie: Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-Wellen-Ionen-Mobilitäts-Massenspektrometrie: Basic Experimentelle Verfahren zur Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolierung von intakt, ganze Maus Milchdrüsen zur Analyse der extrazellulären Matrix Ausdruck und Drüse Morphologie

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.