ويدعم هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية ووزارة التربية والتعليم سنغافورة تحت مركز البحوث في برنامج التميز، والبدء المنح (M4330002.C70) من جامعة نانيانغ التكنولوجية، وAcRF المستوى (2 MOE2014-T2-2-172) من وزارة التربية والتعليم، سنغافورة. الكتاب أشكر جوي يام كيوك Hoong للمشاركة في مظاهرة من هذا البروتوكول.

1. بيوفيلم زراعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد السلالات البكتيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 يوم قبل زراعة بيوفيلم، وإعداد الثقافات البكتيرية العوالق، فحقن 2 مل من متوسط ​​النمو المناسب من ثقافة البكتيرية المجمدة. استخدام لوريا، مرق المتوسطة (10 ز L -1 كلوريد الصوديوم، و 10 غرام L -1 خلاصة الخميرة، و 10 ز L -1 تريبتون) لمخاطي P. الزنجارية وااا Δ Δ والبولندي المسوخ التي المعيبة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة يهز ظروف. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 0.40 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الإعداد خلية تدفق، التي وصفت في وقت سابق 14، ويفضل على محطة المحمول أو العربة التي يمكن جلبها إلى غرفة المجهر لتصوير الخلية تدفق دون التفكيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معقم متوسط ​​النمو في 2 L أو 5 زجاجات L لكل خلية التدفق. استخدام الحد الأدنى من المتوسط ​​M9 (48 ملي نا 2 هبو 4 و 22 مليKH 2 PO 4، 19 ملي NH 4 الكلورين، 9 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي MgSO 4، و 0.1 ملي CaCl 2) تستكمل مع 0.04٪ الجلوكوز (وزن / المجلد) و 0.2٪ (وزن / المجلد) casamino الأحماض) لP. الزنجارية تدفق الأغشية الحيوية الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهرية قسامة الفلورسنت في أنابيب microcentrifuge وتدور باستمرار في H 2 O معقمة لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد المركزي في 9،391.2 ز. إزالة وطاف resuspend في 1 مل نمو متوسط ​​إلى إزالة أزيد الصوديوم (مطهر) قبل إضافة إلى نمو متوسط ​​2 L أو 5 زجاجات L المتوسطة. ملاحظة: أحجام مختلفة من المجهرية تأتي في تركيزات مختلفة ويجب تخفيفه وفقا للتعليمات. على سبيل المثال، تفريق 120 ميكرولتر من 1.0 ميكرون المجهرية قطر، 15 ميكرولتر من 0.5 ميكرون المجهرية قطر و0.96 ميكرولتر من 0.2 ميكرون المجهرية قطر إلى 2 L من متوسط ​​النمو لإعطاء 2.18 × 10 6 المجهرية مل -1 لكل حجم الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق زجاجة متوسطة إلى upstماعون من خلية تدفق والسماح النمو المتوسطة في التدفق من خلال الإعداد بأكمله. وقف تدفق وضخ الثقافات بين عشية وضحاها المخفف إلى غرف الخلية التدفق. تسمح للبكتيريا ان نعلق على قوام ساترة لمدة 1 ساعة قبل مواصلة تدفق وسط النمو بمعدل تدفق ما يقرب من 5.5 × 10 -3 م ثانية -1، أو 8 دورة في الدقيقة مع مضخة تحوي. وعادة ما نمت الأغشية الحيوية في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 3-7 أيام: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، على سبيل ثابت الإعداد الثقافة، وتمييع الثقافات بين عشية وضحاها 100 أضعاف في أنابيب microcentrifuge بإضافة 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 1 مل النمو المتوسطة مع جزيئات. زيادة تركيز الجسيمات في وسط النمو للثقافة ثابتة قبل ما يقرب من 500 أضعاف مقارنة مع تلك المستخدمة في الأغشية الحيوية تدفق (مثل غسل و resuspend 600 ميكرولتر من 1.0 ميكرون المجالات قطر في 10 مل من متوسط ​​النمو) كما الأغشية الحيوية خلية تدفق تتجدد باستمرار مع الجسيمات ولكن الثقافات ثابتة ليست كذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2001؛ لتر من الثقافة بين عشية وضحاها المخفف مع جزيئات لغرف 8 الشرائح جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة. وعادة ما نمت الأغشية الحيوية لمدة 1 يوم. استبدال قضى المتوسطة النمو يوميا مع متوسط ​​نمو جديدة مع الجسيمات إذا نمت بيوفيلم لأكثر من 1 في اليوم. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 و 5، وإيقاف تدفق من مضخة تحوي وجلب تدفق إعداد الخلية إلى غرفة الفحص المجهري. المشبك أنابيب بالقرب من مدخل ومخرج للغرف خلية تدفق لمنع الانجراف (سبب الخطأ المنهجي بالتغيرات التي تطرأ على البيئة) من التدفق. وضع خلية تدفق على خشبة المسرح مجهر المجهر تستقيم. ملاحظة: استخدام مجهر مقلوب لتصوير microwells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر الفلورسنت مع 40X الهدف النفط لاتخاذ أشرطة الفيديو من microsphere الحركة جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم في مواقع مختلفة (microcolonies وطبقات متمايزة مسطحة) وفي أيام مختلفة (يوم 3 و 5) لالتحقيقات الزمانية والمكانية. اتخاذ أشرطة الفيديو أقصر مع ارتفاع معدل الإطار للتحقيق في الأحداث التي وقعت ضمن جداول زمنية قصيرة (على سبيل المثال 1.5-3 أشرطة الفيديو دقيقة في معدل الإطار من 25-50 لقطة في الثانية لديناميكية سريعة)، وأشرطة الفيديو أطول مع انخفاض معدل الإطار للتحقيق في الأحداث على مر الزمن الطويل جداول (مثل أشرطة الفيديو 15-30 دقيقة في معدل الإطار من 2.5-5 لقطة / ثانية لديناميات أبطأ). ملاحظة: يحتوي الفيديو عادة 5-10 الجسيمات، وعادة ما يكون من 1،0-2،5 GB في حجم الملف. microcolonies أكبر قد عقد المزيد من الجسيمات. تأخذ 5-10 أشرطة الفيديو لكل فئة (على سبيل المثال 5-10 أشرطة الفيديو من microcolonies مختلفة ومواقع مختلفة في طبقات متمايزة مسطحة). بيوفيلم لديه بنية متجانسة التي قد تتكون من microcolonies، قنوات، الفراغات وطبقات متمايزة مسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ ملفات الفيديو في الشكل المناسب الذي يمكن قراءتها من قبل فيجي / يماغيج (على سبيل المثال czi، TIF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أشرطة الفيديو لالانجراف عن طريق التمرير من خلال فيد النهائيEO وأشار إلى أن الجزيئات لا تتحرك في نفس الاتجاه في وقت واحد. يمكن أن يكون سبب الانحراف تلو مرحلة Z الحركة، والتيارات في الخلية التدفق، والخلل في جدول مضادة للاهتزاز، وضغط الهواء أو التغيرات في درجات الحرارة. قاصر الصحيح الانجراف باستخدام تقنيات ما بعد المعالجة التي تقدم عادة مع برنامج المجهر. تجاهل أي أشرطة الفيديو حيث لا يمكن تصحيح الانحراف. تسجيل المعلمات التالية، وهي مطلوبة من خلال تحليل الجسيمات تتبع: القرار (بكسل / أم)، عدد من إطارات، المدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خلية تدفق من مرحلة المجهر وإعادة تشغيل مضخة تحوي على مواصلة زراعة بيوفيلم. </li></ol> 3. الجسيمات تحليل تتبع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مسارات الجسيمات باستخدام المكونات في TrackMate في مجال البرمجيات مفتوحة المصدر (يماغيج). تحميل فيجي في <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> فتح الفيديو مع فيجي وضمن القائمة الإضافات، حدد تتبع وTrackMate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق أو ضبط الإعدادات في الالبريد يوحي إعدادات المعايرة الأولية لتتناسب مع المعلمات الفيديو كما هو مسجل في الخطوة 2.4 النافذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف الجسيمات في TrackMate باستخدام يماغيج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر &#39;للكشف عن سجل &quot;، ومدخلات قطر الجسيمات وقيمة العتبة (على سبيل المثال 1000). التمرير عبر الفيديو في حين النقر على الزر &quot;معاينة&quot; للتأكد من أن الدوائر الأرجواني تتبع الجسيمات في جميع أنحاء الفيديو. ضبط القطر والعتبة القيم عند الضرورة: زيادة قيمة العتبة في حالة ظهور الدوائر الأرجواني في المساحة الفارغة. تخفيض قيمة عتبة إذا تم الكشف عن الجسيمات ليست كافية. انقر على زر المقبل لاستكمال الكشف عن الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر التالي عندما قدم مع خيار لإضافة أو إزالة الجزيئات المكتشفة في &quot;العتبة الأولية &#39;،&#39; حدد طريقة عرض&quot; و &quot;اختر مرشح &#39;ويندوز لمواصلة دون تعديل إذا كان الكشف عن الجسيمات الأولية مرضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر &#39;LAP تعقب بسيط &quot;في غروبعلى شريط &quot;حدد طريقة تعقب &#39;نافذة كما الجسيمات نادرا ما ينتقل من التركيز في بيوفيلم ويتم تعقبها بسهولة. استخدام المقترح أو منخفضة الربط والفجوة بين اقفال قيم أقصى مسافة، وانقر فوق التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن تتبع الجسيمات غير مرضية عن طريق التمرير من خلال الفيديو لمعرفة أن الجسيمات يتتبعون التي رسمها TrackMate، وأنه لا توجد مسارات غير المرغوب فيها أو في عداد المفقودين. تخطي مختلف خطوات الترشيح. انتقل إلى نافذة النهائي &quot;حدد الإجراء&quot;. اختر &#39;مسارات تصدير إلى ملف xml&#39; من القائمة المنسدلة وانقر فوق &quot;تنفيذ&quot;. اختيار مجلد لحفظ المسارات. ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة في المجال العام لتحليل مسارات الجسيمات واستخدام microrheology. msdanalyzer وTrackArt أمثلة من الجسيمات تتبع برامج التحليل التي تعمل في بيئة ماتلاب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مطلب لاستيراد مسارات الجسيمات في ملفات XML عن طريق اختيار في قائمةملف ماتلاب&gt; تعيين مسار ... وإضافة مجلد البرامج النصية المتاحة مع حزمة فيجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل مسارات الجسيمات مع msdanalyzer، تحميل رابط لملف مضغوط أو tar.gz الملف at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج المجلدmsdanalyzer 15 وأسقطه في المجلد الذي ينتمي إلى مسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات &lt;اسم المستخدم&gt; المستندات ماتلاب). بدء مطلب وبدء محلل بكتابة: أماه = msdanalyzer (2، &#39;أم&#39;، &#39;ثانية&#39;) حيث أم والثانية هي وحدة المكان والزمان المادية في الفيديو. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد مسارات الجسيمات عن طريق الكتابة: [المسارات، MD] = importTrackMateTracks (&#39;FileName.xml&#39;، &#39;clipZ &quot;.، &#39;scaleT&#39;) أماه = ma.addAll (مسارات)؛ حيث &#39;clipZ &quot;يزيل البعد Z للحصول على فيديو 2D، و&quot; scaleT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المسارات على الرسم البياني باستخدام: ma.plotTracks. ma.labelPlotTracks. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العضلية الهيكلية من الجسيمات باستخدام: أماه = ma.computeMSD. ma.msd </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم العضلية الهيكلية كل الجسيمات: الشكل ma.plotMSD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين مسارات الجسيمات من أشرطة الفيديو وغيرها من نفس categery (على سبيل المثال الجزيئات جزءا لا يتجزأ من النوع البري microcolonies في يوم 3) بتكرار 3.5.1.1 ل3.5.1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم يعني الفرقة أو متوسط ​​على كل المنحنيات: ma.plotMeanMSD تغيير Y- ومحور س من الخطية إلى مقياس لوغاريتمي. في بعض الأحيان فارق زمني طويل، منحنيات MSD تصبح صاخبة بسبب إحصاءات كافية في فترات زمنية أطول. قد ترتفع منحنيات MSD أيضا بشكل حاد بسبب خطأ الديناميكي. ويمكن إزالة هذه المناطق من منحنى باستخدام أداة الفرشاةلتحديد نهاية منحنى واختيار &#39;تنظيف&#39;&gt; &#39;إزالة Unbrushed &quot;في القائمة أدوات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل Ezyfit في <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> وإضافة Ezyfit إلى مجلد تنتمي إلى المسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات &lt;اسم المستخدم&gt; المستندات ماتلاب). تثبيت القائمة Ezyfit عن طريق كتابة في Matlab مساحة العمل efmenu تثبيت. إعادة تشغيل MATLAB مع القائمة Ezyfit في إطار الشكل. تناسب منحنيات MSD للقانون الطاقة عن طريق اختيار في القائمة Ezyfit &#39;عرض صالح&#39;&gt; &#39;الطاقة&#39;&gt; &#39;ل* س ^ ن&#39; كانت n هو الأس α ناشر المقدرة. ملاحظة: msdanalyzer يتطلب المنحنى تركيب أدوات في Matlab لتركيب منحنيات MSD. Ezyfit هو بديل والبرمجيات الحرة التي يمكن أن تؤدي منحنى المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضحة مسارات الجسيمات الحالية والمشاكل العضلية الهيكلية لحساب العضلية الهيكلية جسيمات جديدة في مواقع أو زمنية أخرى: صافي </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد احتساب مختلف منحنيات متوسط ​​MSD الجسيمات في المتوسطة (السيطرة)، وmicrocolonies والمناطق غير متمايزة من مختلف السلالات، ونسخ ولصق المنحنيات في رسم بياني واحد للمقارنة. صلابة عينة ويشابك الزيادة مع القيم MSD أقل. المنحنيات المستوية لها α الدنيا والعينة هي أكثر مرونة من منحنيات حاد مع ارتفاع α. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد منحنى وانتقل إلى &quot;أدوات&quot; لإلقاء نظرة على البيانات الإحصائية، مثل الوسيط والمدى. وMSD للحبة يتناسب مع الامتثال زحف، J (ر) من المادة التي تم تضمين حبة وفقا للعلاقة، <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> حيث J = الامتثال الزحف، د = الجسيمات قطر، ك B = بولتزمان ثابتة، T = درجة الحرارة ور = الوقت. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms.">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li><li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides.">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li><li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li><li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation.">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa.">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li><li>Bokranz, W., Wang, X., Tsch&#228;pe, H., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract.">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li><li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms.">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li><li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+complex+fluids.">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells:+Principles+and+Applications.">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells.">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383 (2011).</li><li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures.">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li><li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms:+genetic+elements+and+molecular+mechanisms.">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li><li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms.">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science &amp; Technology. 43, 113-120 (2001).</li><li>J&#228;ger-Z&#252;rn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls.">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Microrheology هو أداة مفيدة لقياس الريولوجية المحلية في الأنظمة غير المتجانسة، مثل الأغشية الحيوية الميكروبية. وهو أسلوب غير مدمرة، مما يتيح رصد في الوقت الحقيقي من التغييرات الانسيابية داخل نفس العينة البيولوجية على نقاط زمنية متعددة. في هذا البروتوكول، تم تطبيق تتبع ال...

معظم الخلايا البكتيرية هي قادرة على توظيف كل من العوالق (حرة المعيشة) و (لاطئة) وسائط المرفقة سطح النمو 1. في وضع المرفقة سطح نمو الخلايا البكتيرية تفرز ويغلف أنفسهم في كميات كبيرة من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) لتشكيل الأغشية الحيوية. وEPS يتكون أساسا من البروتينات، exopolysaccharide، DNA خارج الخلية وضروري لتشكيل بيوفيلم 2. وهو بمثابة سقالة المادية التي البكتيريا يمكن استخدامها للتمييز مكانيا، ويحمي البكتيريا من الظروف البيئية الضارة والاستجابات المضيفة. مكونات مختلفة من EPS لها أدوار متميزة في تشكيل بيوفيلم 3 والتغيرات في التعبير عن مكونات EPS يمكن إعادة تشكيلها بشكل كبير هياكل بيوفيلم 4. يمكن مكونات EPS تعمل أيضا يشير إلى جزيئات 5، وأظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا بعض المكونات EPS التفاعل مع الخلايا الميكروبية لتوجيه الهجرة وبيوفيلم فرق بهمerentiation 6-8. البحث عن EPS وكثيرا المتقدمة بناء على التحليلات المورفولوجية الأغشية الحيوية التي تنتجها المسوخ المعيبة في مكون محدد من EPS 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، وعادة ما تميزت به EPS على المستوى الكلي (توصيف بالجملة) 11. الصرفية يحلل ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى التفاصيل الكمي وتوصيف بالجملة، والتي ترجع متوسط ​​القيم، يفقد التفاصيل الموجودة داخل تجانس بيوفيلم. الآن هناك اتجاه متزايد للتقدم إلى توصيف الوقت الحقيقي من الخصائص الميكانيكية للEPS على النطاق الصغير. يوضح هذا البروتوكول كيف microrheology الجسيمات تتبع غير قادرة على تحديد الآثار الزمانية المكانية من مكونات المصفوفة عرض بيل وexopolysaccharides البولندي على زوجة مطاطية وفعال يشابك الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية 4. microrheology السلبي هو الم بسيط وغير مكلفطريقة eology التي توفر أعلى سرعة نقل العينات microrheological المكانية للمادة حتى الآن 12،13. في microrheology السلبي، وتوضع دوائر التحقيق في العينة ويتبع حركتها البراونية، مدفوعا الطاقات الحرارية (ك B T) بواسطة المجهر الفيديو. يمكن تتبع عدة جزيئات في وقت واحد، والإحداثيات التي تعتمد على الوقت من الجسيمات يتبع المشي العشوائي التقليدية. لذلك، في المتوسط، تبقى جسيمات في نفس الموقف. ومع ذلك، فإن الانحراف المعياري للنزوح أو متوسط ​​تربيع النزوح (MSD) من الجسيمات، ليس صفرا. منذ تدفق سوائل لزجة، والجسيمات MSD في السائل اللزج ينمو خطيا مع مرور الوقت. في المقابل، يشابك البوليمر وجدت في اللزجة أو المواد المرنة تساعدهم على مقاومة التدفق، وتصبح جزيئات محدود في نزوحهم، مما أدى إلى الهضاب في منحنى MSD (الشكل 1A). هذه الملاحظة تتبع العلاقة MSDαt <sتصل&gt; α، حيث α هو الأس ناشر الذي نسبة المساهمات المرنة وزجة من مادة ذات الصلة. للجسيمات تتحرك في السوائل اللزجة α = 1، في المواد اللزجة 0 &lt;α &lt;1، والمواد المرنة α = 0. ويمكن أيضا أن MSD استخدامها لحساب الامتثال زحف، وهو الميل للمواد التي تشوه دائم على الوقت ويقدر مدى سهولة وينتشر المادية. حجم وكثافة وسطح الكيمياء من الجسيمات حاسمة لتطبيق الصحيح للتجربة microrheological ويتم اختيار فيما يتعلق بنظام درس (في هذه الحالة البوليمرات المصفوفة بيوفيلم، انظر الشكل 1B). أولا، الجسيمات يقيس الريولوجيا للمادة مع الهياكل التي هي أصغر بكثير من الجسيمات نفسها. إذا هياكل مادة هي على نطاق مماثل لالجسيمات، وحركة المساواةومن دواعي جسيما من جانب الشكل والتوجه للهياكل الفردية. ومع ذلك، إذا الهياكل المحيطة الجسيمات هي أصغر من ذلك بكثير، وهذا التأثير هو صغير ومتوسط ​​من، تقديم بيئة متجانسة إلى الجسيمات (الشكل 1B). ثانيا، يجب أن تكون كثافة الجسيمات مماثلة إلى متوسطة (1.05 ز مل -1 لوسائل الإعلام تعتمد على الماء) بحيث يتم تجنب الترسيب وقوات بالقصور الذاتي تكاد لا تذكر. معظم الجسيمات مع الشبكات البوليسترين تفي بالمعايير أعلاه. من الناحية المثالية، والجسيمات لا تتفاعل مع البوليمرات المصفوفة بيوفيلم كما تفسير الانسيابية من الجسيمات MSD صالحا إلا إذا كان الاقتراح هو عشوائي، مدفوعا الطاقة الحرارية والتصادم مع الهياكل الجوهر. هذا يمكن ملاحظتها عن طريق فحص ما إذا كانت الجسيمات التحقيق يميل إلى ربط أو ترتد على سطح بيوفيلم قبل نمت. ومع ذلك، على الرغم من عدم وجود جاذبية للبيوفيلم، يجب أن تكون قادرا على أن تدرج في مصفوفة الجسيمات.بالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس الفيزيائية للبيوفيلم قد يؤدي إلى جزيئات مختلفة كونها أكثر ملاءمة كما تحقيقات في مناطق مختلفة من بيوفيلم. وهكذا، والجسيمات ذات الأحجام المختلفة والكيمياء السطحية يجب أن تطبق على بيوفيلم. على هذا النحو، والجسيمات MSD غير قادرة على تقديم معلومات مفيدة عن كيفية مختلفة تساهم المكونات إلى الريولوجيا وانتشار بيوفيلم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مجسات مختلفة يسمح احد لاستخلاص المعلومات عن التجانس الفيزيائية المكاني للبيوفيلم. هذه الطريقة يمكن استخدامها لاختبار تأثير العلاج المضادة للميكروبات على الخواص الميكانيكية للبيوفيلم، أو تطبيقها على الأغشية الحيوية الأنواع المختلطة لمعرفة كيف يتم تغيير الخواص الميكانيكية للبيوفيلم من إدخال أنواع أخرى. قد تكون الجسيمات العضلية الهيكلية مفيدة أيضا لوصف بيوفيلم تشتت. ومن شأن هذه الدراسات أن تكون مفيدة في فهمنا للالأغشية الحيوية، ويحتمل أن تحسين العلاجات بيوفيلم لالهندسة الثانية من الأغشية الحيوية للأنشطة مفيدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

وقد تم التحقيق خصائص اللزجة المحلية للبيوفيلم في مناطق مختلفة من بيوفيلم، والتي تضمنت الفراغات (متوسطة فوق بيوفيلم) والسهول (طبقة مسطحة غير متمايزة من الخلايا) وmicrocolonies (انظر التسميات في الشكل 2A). 3-5 حددت أيضا التغيرات الزمانية في الخصائص اللزجة من بيوفيلم خل...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology at JoVE.com

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

في الموقع خارطة الخواص الميكانيكية لالأغشية الحيوية التي تتبع الجسيمات Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

in-situ-mapping-mechanical-properties-biofilms-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K Views.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Video: In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametric رسم الخرائط البصرية للقلب الأرنب Langendorff - perfused

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

يشتغل المغناطيسي النائية متري تحقيقات ل<em&gt; في الموقع</em&gt; رسم الخرائط 3D من البكتيريا بيوفيلم الخصائص الفيزيائية

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

التحقيق في فصل التدفق ثلاثي الأبعاد الناجم عن نموذج بوليب أضعاف الصوتية

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

نظام ملليمتر اختبار العاطفة مقياس لقياس الخواص الميكانيكية للاسفنج البحري سبيكوليس

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...