Diese Forschung wird von der National Research Foundation und Bildungsministerium Singapur unter seinem Forschungszentrum der Excellence-Programm unterstützt, das Start-up Grants (M4330002.C70) aus Nanyang Technological University und ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) vom Ministerium für Bildung, Singapur. Die Autoren danken Joey Yam Kuok Hoong für die Teilnahme an der Demonstration dieses Protokolls.

1. Biofilm Anbau <ol><li> Zubereitung von Bakterienstämmen <ol><li> 1 Tag vor Biofilm Anbau, vorzubereiten planktonischen Bakterienkulturen durch Inokulation von 2 ml geeigneten Wachstumsmedium aus gefrorenem Bakterienkultur. Verwenden Luria-Broth-Medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 Hefeextrakt und 10 g L -1 Trypton) zum mucoid P. aeruginosa und dessen Δ pel und Δ psl Defektmutanten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 200 rpm schütteln Bedingungen. Verdünnte-Nacht-Kulturen auf eine OD600 von 0,40 unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Montieren Flusszelle Setup, die zuvor beschrieben worden, 14 hat, vorzugsweise auf einer Mobilstation oder Wagen, die in das Mikroskop Raum zur Abbildung des Flusszelle ohne Demontage gebracht werden kann. </li><li> Bereiten Sie sterile Wachstumsmedium in 2 l oder 5 l-Flaschen für jeden Durchflusszelle. Verwenden Minimalmedium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 und 0,1 mM CaCl 2) mit 0,04% Glucose (G / V) und 0,2% (G / V) Casaminosäuren) von P. ergänzt aeruginosa Flusszelle Biofilmen. </li><li> Aliquot fluoreszierende Mikrosphären in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-down in sterilem H 2 O für 5 min in Zentrifuge bei 9,391.2 g. Überstand abnehmen und resuspendieren in 1 ml Wachstumsmedium zu Natriumazid (Desinfektionsmittel) vor der Zugabe zum Kulturmedium in 2 L oder 5 L-Medium Flaschen zu entfernen. HINWEIS: Verschiedene Größen der Mikrokugeln in verschiedenen Konzentrationen und sollte entsprechend den Anweisungen verdünnt werden. Beispielsweise dispergieren 120 ul von 1,0 um Mikrokügelchen Durchmesser von 15 &amp; mgr; l von 0,5 um Mikrokügelchen Durchmesser und 0,96 &amp; mgr; l von 0,2 um Mikrokügelchen Durchmesser in 2 l Wachstumsmedium auf 2,18 × 10 6 ml -1 Mikrokügelchen für jede Partikelgröße zu ergeben. </li><li> Bringen Medium Flasche UpstRies Flusszelle und lassen Wachstumsmedium durch gesamte Setup. Gasaustritt stoppen und injizieren verdünnten Übernachtkulturen in Flusszelle Kammern. Dass Bakterien auf das Deckerde für 1 h vor dem kontinuierlichen Fluss von Wachstumsmedium bei einer Flussrate von etwa 5,5 x 10 -3 m sec -1 oder 8 min mit einer peristaltischen Pumpe zu befestigen. HINWEIS: Biofilme werden gewöhnlich bei Raumtemperatur (25 ° C) für 3-7 Tage gezüchtet. </li><li> Alternativ zur statischen Kultur Setup, verdünnte Übernachtkulturen 100-fach in Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 10 ul der Übernachtkultur auf 1 ml Wachstumsmedium mit Partikeln. Erhöhung der Partikelkonzentration im Wachstumsmedium für die statische Anzucht von etwa 500-fache im Vergleich zu derjenigen für die Strömung von Biofilmen (zB waschen und resuspendieren, 600 &amp; mgr; l von 1,0 um Kugeln mit einem Durchmesser von 10 ml Wachstumsmedium), wie Durchflußzelle Biofilme ständig nachgefüllt Partikel, aber statischen Kulturen sind es nicht. <ol><li> In 2001; l des verdünnten Übernachtkultur mit Partikeln in die Kammern 8 und Folien. Inkubieren bei 37 ° C unter statischen Bedingungen. Biofilme sind in der Regel für 1 Tag gewachsen. Ersetzen Sie verbrauchte Nährmedium täglich mit frischem Wachstumsmedium mit Partikeln, wenn Biofilm ist für mehr als 1 Tag gewachsen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mikroskopie <ol><li> An Tag 3 und 5, schalten Sie Flow aus der Schlauchpumpe und bringen Flusszelle Setup in die Mikroskopie Raum. Clamp Schlauch nahe dem Eingang und Ausgang der Durchflusszelle Kammern Drift (eine systematische Fehlerursache durch Veränderungen in der Umwelt) vom Fluss zu verhindern. Setzen Sie die Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch von einem aufrechten Mikroskop. HINWEIS: Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop zur Abbildung von Mikrovertiefungen. </li><li> Verwenden Fluoreszenzmikroskopie mit 40x Öl-Objektiv, um Videos von Mikrosphärenbewegung im Biofilm an verschiedenen Standorten (Mikrokolonien und Flach undifferenzierten Schichten) eingebettet und in unterschiedlichen Tagen (Tag 3 und 5), um zu nehmenzeitliche und räumliche Untersuchungen. Nehmen Sie kürzere Videos mit höheren Bildrate, um Ereignisse in kurzen Zeitskalen auftreten untersuchen (zB 1,5 bis 3 min Video Framerate von 25-50 Frames pro Sekunde für schnelle Dynamik) und längere Videos mit niedriger Bildrate, um Ereignisse über längere Zeit zu untersuchen Waagen (zB 15-30 min Video Bildrate von 2,5 bis 5 Bilder / s für langsamere Dynamik). HINWEIS: Ein Video enthält typischerweise 5-10 Partikel und ist in der Regel von 1,0 bis 2,5 GB in der Dateigröße. Größere Mikrokolonien können mehr Teilchen zu halten. Nehmen Sie 5-10 Videos für die einzelnen Kategorien (zB 5-10 Videos von verschiedenen Mikrokolonien und von verschiedenen Orten in flachen undifferenzierten Schichten). Der Biofilm hat eine heterogene Architektur, die von Mikrokolonien, Kanäle, Hohlräume und Flach undifferenzierten Schichten bestehen kann. </li><li> Speichern Sie Ihre Videos in geeigneten Format, das von Fiji / ImageJ gelesen werden können (zB CZI, tif). </li><li> Überprüfen Sie Videos für Drift durch Scrollen durch fertige video und der Beobachtung, dass die Partikel nicht in derselben Richtung gleichzeitig zu bewegen. Drift kann durch z-Tischbewegung, Ströme in der Strömungszelle, Ungleichgewicht der Antischwingungstisch, Luftdruck- oder Temperaturänderungen hervorgerufen werden. Correct kleinere treiben mit Post-Processing-Techniken in der Regel mit Mikroskop-Software zur Verfügung gestellt. Entsorgen Sie alle Videos, bei Drift kann nicht korrigiert werden. Nehmen Sie die folgenden Parameter, die während der Particle Tracking-Analyse erforderlich sind: Auflösung (Pixel / um), Anzahl der Frames, Dauer. </li><li> Entfernen Sie Durchflusszelle von Mikroskoptisch, und starten peristaltische Pumpe weiter Kultivieren des Biofilms. </li></ol> 3. Particle Tracking Analysis <ol><li> Erhalten Teilchenbahnen mit Hilfe des Plug-in-Trackmate in Open Source Software (ImageJ). Laden Fiji bei <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Öffnen Sie das Video mit Fidschi und unter dem Plugins-Menü Verfolgung und Trackmate. </li><li> Prüfen oder Einstellungen anzupassen in thE-Fenster darauf hindeutet anfänglichen Kalibrierungseinstellungen, um die Videoparametern entsprechen, wie in Schritt 2.4 aufgezeichnet. </li><li> Detect Partikel in Trackmate mit ImageJ. <ol><li> Wählen Sie &#39;Log-Detektor &quot;, Eingangspartikeldurchmesser und Schwellenwert (zB 1000). Blättern Sie durch das Video, während Sie auf &#39;Vorschau&#39;, um zu überprüfen, dass die lila Kreise folgen Sie den Teilchen in der gesamten Video. Passen Sie die Werte Durchmesser und Schwellen wie nötig: Erhöhung des Schwellenwerts, wenn lila Kreise in den leeren Raum angezeigt. Reduzieren Sie den Schwellenwert, wenn nicht genug Partikel festgestellt werden. Klicken Sie auf Weiter, um den Nachweis führen Sie die Partikel. </li><li> Klicken Sie auf Weiter, wenn mit der Option präsentiert, um hinzuzufügen oder Partikel in &#39;Initial Schwellen&#39; erkannt zu entfernen, &#39;Wählen Sie eine Ansicht &quot;und&quot; Wählen Sie einen Filter &quot;Fenster, um ohne Einstellung fortzusetzen, wenn anfängliche Partikeldetektion war zufriedenstellend. </li><li> Wählen Sie &quot;Einfache LAP-Tracker&quot; in der optiauf Leiste &#39;Wählen Sie ein Tracker-Methode &quot;Fenster als Partikel nur selten aus der Schwerpunkt in den Biofilm zu bewegen und sind leicht verfolgt. Verwenden Sie die vorgeschlagenen oder niedrigen Verknüpfung und Lückenschließung max Abstandswerte, und klicken Sie auf Weiter. </li><li> Überprüfen Sie, dass Partikelverfolgung ist durch Scrollen durch das Video zu sehen, dass Partikel folgen Sie den von Trackmate gezogen Tracks, und dass es keine unerwünschten oder fehlende Tracks zufriedenstellend. Überspringen Sie die verschiedenen Filterschritte. Zum letzten Fenster &quot;Wählen Sie eine Aktion&quot;. Wählen Sie &quot;Export Tracks auf XML-Datei&quot; aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. Wählen Sie einen Ordner, um die Titel zu speichern. HINWEIS: Es gibt verschiedene Programme zur Verfügung, in der Öffentlichkeit für die Analyse der Partikelbahnen und die Verwendung von Mikrorheologie. msdanalyzer und TrackArt sind Beispiele für Partikel-Tracking-Analyse-Programme, die in der Matlab-Umgebung ausgeführt werden. </li></ol></li><li> Bereiten Matlab, um die Partikelbahnen in den XML-Dateien, indem Sie im Menü des importierenMatlab Datei&gt; Pfad ... und fügen Sie die Skripts Ordner mit der Fidschi-Paket. </li><li> Um die Partikelbahnen mit msdanalyzer analysieren, laden Sie den Link auf die ZIP-Datei oder tar.gz-Datei at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Entpacken Sie diemsdanalyzer Ordner 15 und legen Sie sie in einem Ordner, auf die Matlab Pfad gehört (zB C: Dokumente und Einstellungen &lt;Benutzername&gt; Eigene Dateien Matlab). Starten Sie Matlab und initiieren den Analysator durch Eingabe von: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) wo um und s sind die physikalischen Raum und Zeiteinheiten in dem Video. <ol><li> Importieren Sie die Teilchenbahnen durch Eingabe von: [Titel, md] = importTrackMateTracks (&#39;filename.xml&#39;, &#39;clipZ&#39;; &quot;SCALET &#39;) ma = ma.addAll (Tracks); wo &#39;clipZ&#39; entfernt die z-Dimension für ein 2D-Video und &#39;SCALET&#39;. </li><li> Zeichnen Sie die Trajektorien auf Graphen mit: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Berechnen Sie die MSE der Partikel mit: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Zeichnen Sie die Muskel- und Skeletterkrankungen jedes Teilchens: Abbildung ma.plotMSD </li><li> Kombinieren Teilchenbahnen von anderen Videos der gleichen categery (zB Partikel im Wildtyp-Mikrokolonien am Tag 3 embedded) durch Wiederholen 3.5.1.1 bis 3.5.1.4). </li><li> Zeichnen Sie die Ensemblemittel oder die Mittel über alle Kurven: ma.plotMeanMSD Ändern Sie den y- und x-Achse von linear zu logarithmisch. Bei langen Verzögerungszeiten, die MSD-Kurven werden durch unzureichende Statistiken auf längeren Zeitskalen laut. Die MSD-Kurven können auch stark ansteigen aufgrund dynamischer Fehler. Diese Bereiche der Kurve kann mit dem Pinsel-Werkzeug entfernt werdenum das Ende der Kurve auswählen und Auswahl von &#39;Bürsten&#39;&gt; &#39;entfernen Unbrushed&#39; im Menü Extras. </li></ol></li><li> Laden Sie Ezyfit bei <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> und fügen Ezyfit in einen Ordner mit dem Matlab Pfad gehören (zB C: Dokumente und Einstellungen &lt;Benutzername&gt; Eigene Dateien Matlab). Installieren Sie die Ezyfit Menü, indem Sie in MATLAB-Workspace efmenu installieren. Starten Sie MATLAB mit Ezyfit Menü in der Abbildung Fenster. Montieren Sie die MSD-Kurven mit dem Potenzgesetz, indem Sie in der Ezyfit Menü &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; waren n ist der geschätzte diffusive Exponenten α. HINWEIS: msdanalyzer bedarf der Curve Fitting Toolbox in Matlab für die Montage der MSD-Kurven. Ezyfit ist eine Alternative und kostenlose Software, die Kurvenanpassung durchführen. </li><li> Klar aktuellen Partikelbahnen und Muskel- und Skeletterkrankungen, neue Partikel Muskel- und Skeletterkrankungen an anderen Standorten oder Zeit zu berechnen: klar </li&gt; <li> Nach der Berechnung der verschiedenen mittleren MSD Kurven von Partikeln im Medium (Kontrolle) und Mikrokolonien und undifferenzierte Bereichen verschiedener Stämme, kopieren und fügen Sie die Kurven in einem Diagramm zum Vergleich. Probensteifigkeit und Vernetzungs Anstieg mit niedrigeren MSD-Werte. Flache Kurven unteren α und Proben elastischer als steilere Kurven mit höheren α. </li><li> Wählen Sie die Kurve und gehen Sie auf &quot;Extras&quot;, um auf die Daten Statistiken, wie der Median und Bereich zu suchen. Die MSD des Wulstes ist proportional der Kriechnachgiebigkeit J (t) des Materials, in welchem ​​der Wulst nach der Beziehung eingebettet <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> wobei J = Kriechnachgiebigkeit, d = Teilchendurchmesser, k B = Boltzmann-Konstante, T = Temperatur und t = Zeit. </li></ol></li></ol>

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	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms.">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li><li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides.">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li><li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li><li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation.">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa.">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li><li>Bokranz, W., Wang, X., Tsch&#228;pe, H., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract.">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li><li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms.">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li><li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+complex+fluids.">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells:+Principles+and+Applications.">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells.">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383 (2011).</li><li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures.">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li><li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms:+genetic+elements+and+molecular+mechanisms.">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li><li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms.">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science &amp; Technology. 43, 113-120 (2001).</li><li>J&#228;ger-Z&#252;rn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls.">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mikrorheologie ist ein nützliches Instrument für die lokale rheologischen Messungen in heterogenen Systemen, wie mikrobielle Biofilmen. Es ist eine zerstörungsfreie Technik, so dass der Echtzeit-Überwachung der rheologischen Veränderungen innerhalb der gleichen biologischen Probe über mehrere Zeitpunkte. In diesem Protokoll wurde partikel Tracking Mikrorheologie um Pel und Psl Exopolysaccharid Mutanten in Reihenfolge angewendet, um zu untersuchen, wie sie die Elastizität und die effektive Vernetzung des Biofilmma...

Die meisten Bakterienzellen sind in der Lage, sowohl planktonischen (frei lebende) und oberflächengebundenen (sessile) Modi des Wachstum 1 einzusetzen. In der Oberfläche gebundenen Modus des Wachstums von Bakterienzellen zu sekretieren und umhüllen sich in großen Mengen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), Biofilme bilden. Die EPS besteht hauptsächlich aus Proteinen, Exopolysaccharid, extrazelluläre DNA und ist wichtig, um die Biofilmbildung 2. Sie dient als physikalische Gerüst durch die Bakterien nutzen können, um räumlich unterscheiden und schützt die Bakterien vor schädlichen Umweltbedingungen und Wirtsreaktionen. Verschiedenen Bestandteile EPS haben verschiedene Rollen in der Biofilmbildung 3 und Veränderungen in der Expression von EPS Komponenten drastisch umzuBiofilmStrukturen 4. EPS-Komponenten können auch als Signalmoleküle 5 und neuere Studien hat bestimmte EPS wirkenden Komponenten mit mikrobiellen Zellen gezeigt, ihre Migration und Biofilm diff Führungserentiation 6-8. Forschung an der EPS hat stark erweiterte auf die morphologische Analysen von Biofilmen von Mutanten in einer bestimmten Komponente der EPS 9,10 defekte produziert basiert. Darüber hinaus wird die EPS üblicherweise am Makromaßstab (bulk Charakterisierung) 11 gekennzeichnet. Morphologische Analyse kann jedoch quantitative Detail und Groß Charakterisierung, die Durchschnittswerte zurückkehrt, verliert den Details, die in der Heterogenität des Biofilms besteht fehlt. Es gibt nun eine steigende Tendenz auf Echtzeit-Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von EPS im Mikromaßstab fortschreiten. Dieses Protokoll zeigt, wie partikel Tracking Mikrorheologie Lage ist, die Raumzeit-Wirkungen von Matrixkomponenten Pel und Psl Exopolysaccharide an die Viskoelastizität und eine effektive Vernetzung von Pseudomonas aeruginosa Biofilm 4 bestimmen. Passive Mikrorheologie ist eine einfache und kostengünstige rheology Methode, die den höchsten Durchsatz räumlicher microrheological Abtastung eines Materials Datum 12,13 bildet. In passiven Mikrorheologie werden Sonden Kugeln in der Probe platziert und deren Brownsche Bewegung, die durch thermische Energie (k B T) angetrieben wird durch Videomikroskopie verfolgt. Mehrere Teilchen gleichzeitig verfolgt werden, und die zeitabhängigen Koordinaten der Partikel folgen einer herkömmlichen Zufallsbewegung. Im Mittel also, bleiben die Teilchen an der gleichen Position. Ist die Standardabweichung der Verschiebungen oder der mittlere quadratische Verschiebung jedoch (MSD) der Partikel, nicht Null ist. Seit viskosen Flüssigkeiten fließen, die Partikel MSD in einem viskosen Fluid wächst linear fortschreitender Zeit. Im Gegensatz dazu ist das polymere Vernetzung in viskoelastischen gefunden oder elastische Stoffe helfen ihnen, Strömung zu widerstehen, und Partikel werden in ihrer begrenzten Verschiebung, was zu Hochebenen in der MSD-Kurve (Abbildung 1A). Diese Beobachtung folgt die Beziehung MSDαt <sbis&gt; α, wobei α die diffusive Exponenten zusammenhängt Verhältnis der elastischen und viskosen Beitrag der Substanz. Für Teilchen, die sich in viskosen Fluiden α = 1, viskoelastischen Stoffen 0 &lt;α &lt;1 ist, und in elastischen Stoffen α = 0. Der MSD können auch verwendet werden, um die Zeitstand, welche die Neigung des Materials zum permanent über verformen berechnen Zeit und schätzt, wie leicht ein Material ausbreitet. Die Grße, Dichte und Oberflächenchemie der Partikel sind für die korrekte Anwendung der microrheological Experiment und sind mit Bezug auf das untersuchte System gewählt (in diesem Fall können die Polymere der Biofilmmatrix siehe 1B). Zunächst misst die Partikel die Rheologie der Substanz mit Strukturen, die viel kleiner als die Teilchen selbst sind. Wenn der Substanz Strukturen sind in ähnlicher Größenordnung an das Teilchen, die Bewegung des parkel wird durch die Form und Ausrichtung der einzelnen Strukturen gestört. Wenn die Strukturen das Teilchen umgebenden viel kleiner sind, jedoch ist dieser Effekt klein und ausgemittelt werden, präsentiert eine homogene Umgebung an das Teilchen (1B). Zweitens sollte die Dichte der Teilchen ähnlich wie das Medium (1,05 g ml -1 für wässrige Medien) sein, dass die Sedimentation vermieden wird, und die Trägheitskräfte vernachlässigbar sind. Die meisten Partikel mit Polystyrol-Gittern die genannten Kriterien erfüllen. Idealerweise hat das Teilchen nicht mit den Polymeren der Biofilmmatrix interagieren, wie die rheologischen Auslegung des Partikel MSD ist nur gültig, wenn eine Bewegung zufällig ist, durch thermische Energie und eine Kollision mit Substanz Strukturen angetrieben. Dies kann durch Prüfen, ob die Sonde Teilchen dazu neigt, zu binden oder abprallen die Oberfläche eines vorge gewachsenen Biofilm beobachtet werden. Trotz des Fehlens von Anziehung zu dem Biofilm, müssen die Partikel in der Lage, in die Matrix eingebaut werden kann.Darüber hinaus kann die physikochemischen Heterogenität des Biofilms in verschiedenen Teilchen mehr als Sonden in den verschiedenen Regionen des Biofilms geeignetes führen. Daher sollte von Partikeln unterschiedlicher Größe und Oberflächenchemie zum Biofilm angewendet werden. Als solches ist die Partikel MSD in der Lage, nützliche Informationen über die verschiedenen Komponenten beitragen, die Rheologie und die Ausbreitung des Biofilms ist. Weiterhin ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Sonden, um eine Information über die räumliche physikochemischen Heterogenität des Biofilms abzuleiten. Dieses Verfahren auf gemischter Arten Biofilmen verwendet werden, um die Wirkung antimikrobiellen Behandlung auf die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu testen, oder aufgebracht zu untersuchen, wie sich die mechanischen Eigenschaften des Biofilms werden aus der Einführung einer anderen Spezies verändert. Partikel MSD können auch nützlich für die Charakterisierung von Biofilm dispersal. Solche Studien wäre hilfreich, in unserem Verständnis von Biofilmen, die möglicherweise verbessern Biofilm-Behandlungen einnd Engineering von Biofilmen für nützliche Tätigkeiten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Die lokalen viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms in verschiedenen Regionen des Biofilms, der die Hohlräume (mittel über dem Biofilm), Ebenen (undifferenzierte flachen Schicht von Zellen) und Mikrokolonien (siehe Etiketten in 2A) aufgenommen wurden untersucht. Die zeitlichen Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms während der Reifung von den Tagen 3 bis 5 wurden ebenfalls bestimmt. Der MSD der Partikel in den Hohlräumen wurde als Kontrolle und vergleichbar mit dem MSD von P...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K Aufrufe.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.