We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

<ol>
	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy.">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li><li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-fracture:+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces.">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li><li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

دراسة التوزيع المكاني ورياضيات الكيمياء من البروتينات الغشاء، مثل EGFR في الخلايا الكاملة يقدم معلومات هامة حول سياق وظيفته والتغييرات المحتملة منها 11-14. أنه يمثل تحديا لدراسة توزيع أحادية، dimers، ومجموعات مباشرة على المستوى التحت خلوية باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية شائعة الاستخدام، والتي يتم فقدان المعلومات حول توطين البروتين في الخلية أو الاختلافات بين الخلايا 15. طرق وضع العلامات والفحص المجهري الموصوفة هنا تسمح التصور المجمعات البروتين على نطاق وطول بضعة نانومتر بحيث يمكن دراسة رياضيات الكيمياء في إطار سياق الفردية، خلايا سليمة 4-7. هذا غير ممكن مع (القرار السوبر) المجهر الضوئي 23 بسبب قرارها غير كافية لتمييز جزيئات تشارك في مجمع البروتين. نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) هو أسلوب المتوسط ​​الفرقة &lt;سوب&gt; 24، ولم يكشف بالضرورة dimers ومجموعات أجل أعلى نتيجة من قصيرة المدى لنقل الطاقة 25. المقايسات ربط القرب 26 لا فعلا قياس المسافات، وبالتالي فهي غير قادرة على التمييز بين منطقة الخلوية ذات كثافة عالية من البروتين، لا محالة مما أدى إلى عدد من التقارب الكشف عن طريق الصدفة العشوائية، من منطقة الخلوية ذات كثافة البروتين مماثلة ولكن تحتوي على البروتين المجمعات معرض مسافات واضحة بين التسميات. ويتحقق المطلوب عالية الدقة لتصور مكونات مجمعات البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). ومع ذلك، TEM التقليدية الخلايا بأكملها محدودة بسبب متطلبات عينات رقيقة / من خلال تشريح غشاء البلازما 27، أو البلازما تمزيق غشاء أو فسخ 28،29 مما أدى إلى قطع صغيرة تشكلت عشوائيا من غشاء أقسام. وبالتالي لا تصوير غشاء البلازما ككل، مما يؤدي إلى نقصمن المحتمل المعلومات الحساسة السياق الخلوية. تنشأ تحديات تجريبية أخرى لدراسة البروتين رياضيات الكيمياء في الخلايا من وضع العلامات البروتين التطبيقية. عادة immunolabeling المستخدمة يحمل الصعوبة التي رياضيات الكيمياء واحد الى واحد بين مستقبلات والتسمية يمكن أن يتحقق إلا مع تحقيق التكافؤ. هذا ليس هو الحال عندما يطلب من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. للحصول على معلومات عن رياضيات الكيمياء البروتين، وكان المطلوب أن التحقيق يربط فريد لحاتمة واحد على مستقبلات وله موقع ملزم واحد لتحقيق الفلورسنت أو جسيمات متناهية الصغر العدد الذري عالية على الجانب الآخر. ثانيا، ودقة للتحقيق مع الأجسام المضادة وضع العلامات يقتصر على حساب حجمها الكبير 30-30 نانومتر، بحيث التمييز بين البروتينات المجاورة واحدة، homodimers، أو مجموعات أكبر ليس ممكنا، على الأقل ليس لمستقبلات للأسرة EGFR. ومن المعروف تسميات محددة أصغر بكثير في الأدب وكاليفورنيان يتم تطبيقها حتى لوصفها الخلايا 31 ولكن هذه ليست شائعة الاستخدام. طول التسمية الكاملة (EGF-البيوتين streptavidin-QD) هو البعد مماثلة لEGFR، وصغيرة بما فيه الكفاية لتكون قادرة على الكشف عن ديمر. وعلاوة على ذلك، وصفت من خطوتين إجراءات وضع العلامات يتجنب وضع العلامات التي يسببها مستقبلات المجموعات. لدينا وسيلة ليست صعبة جدا، وليس أكثر من ذلك بكثير من المجهري مضان من البروتينات المسمى. ومع ذلك، تحتاج تجربة لتنفذ بعناية كبيرة، لأن عدد من الخطوات يضيف صعودا وجود خطأ في واحدة من الخطوات التي قد تؤدي إلى الفشل الكامل في التجربة. التعامل مع الرقائق ليست أكثر مملة من التعامل مع شبكات TEM لكن بعض رقائق فارغة التدريب يوصى. ESEM-STEM الخلايا المائية كاملة وربما كان الجانب الأكثر صعوبة، ويتطلب على الأقل عامل المهرة وعدة أيام من الممارسة من أجل التوصل إلى قرار حول 3 نانومتر حسب الحاجة لتصور QDS. سد الإشعاععمر العينة قيد التحقيق يمثل خطرا. يجب أن يشاهد الضغط ودرجة الحرارة بعناية للحفاظ على طبقة المياه. وعلاوة على ذلك، وسمك طبقة المياه قد تختلف بين الخلايا. فإنه من المستحسن أن رصد وجود طبقة المياه باستخدام كاشف الإلكترون الغازي فوق العينة، كما هو موضح في مكان آخر 6. يجب تصوير المناطق الخلوية فقط مرة واحدة أو مرتين لتجنب الضرر. وجود قيود أساسيا في الطريقة التي عالية الدقة من المعلومات عن التركيب الدقيق غائبة. تقنيات أخرى، على سبيل المثال، البرد TEM، وهناك حاجة لدراسة بنية البروتين، والتركيب الدقيق الخلوي 15. ثانيا، دراسة التفاعل الدينامي بين مضاعف من البروتينات في الخلية الحية في المجهر مرور الزمن ليست ذات جدوى بسبب أضرار الإشعاع، ويتطلب دولة من بين الفن المجهر الضوئي 23. حاليا، لدينا وسيلة غير قادر على تحديد المستوى المطلق للdimers منذ لتركفاءة abeling غير معروفة ولكننا نتوقع أن إضافة هذه البيانات في المستقبل. فمن الممكن مع ذلك لمعرفة ما إذا كان وجود أم لا dimers. من الأدب هو من المعروف، أنه حتى كفاءة الوسم حوالي 15٪ غير كافية للكشف عن dimers ذات دلالة إحصائية كافية 32. فمن الممكن بسهولة لدراسة أخرى مستقبلات بغشاء عبر يجند لها، عبر شظايا فاب المعقدة البيروكسيديز من الاجسام المضادة المحددة، أو عن طريق linkers الصغيرة الأخرى 7 باستخدام وصفها من خطوتين بروتوكول وضع العلامات. وبما أننا أثبتنا بالفعل أن اثنين من ألوان مختلفة (أحجام) من QDS يمكن استخدامها، وكان يستخدم العلامات جسيمات متناهية الصغر من الذهب في العمل قبل 6، يبدو ممكنا لتسمية الأنواع بروتين متعددة في نفس التجربة. التحدي الرئيسي لدراسة رياضيات الكيمياء من أنواع البروتين متعددة هو ضمان كفاءة العلامات مماثلة لكل من الأنواع أو على الأقل تطبيع رياضيات الكيمياء النسبي الحصول على احترامإيف الكفاءة العلامات. ومع ذلك لا يبدو وهما QDS المختلفة المستخدمة في هذه الدراسة تختلف كثيرا في كفاءة وضع العلامات (أنظر الشكلين 2 و 4). الطريقة الموصوفة التي تنطوي على وضع العلامات على مرحلتين مع QDS، والمتلازم المجهري مضان وESEM-STEM يقدم وسيلة فعالة لدراسة التفاعل المعقد للبروتينات الغشاء في أغشية البلازما سليمة من الخلايا بأكملها.

كما تم تقديم نهج جديد في الآونة الأخيرة، إلى صورة خلايا كاملة مع البروتينات وصفت في الحالة السائلة باستخدام STEM 1-3، أو المتلازم المجهري مضان وSTEM 4-7. هذه المنهجية هي القادرة على دراسة التوزيع المكاني للبروتينات الغشاء والمجمعات البروتين بما في ذلك رياضيات الكيمياء على مستوى جزيء واحد في أغشية البلازما سليمة من الخلايا بأكملها. هنا، نحن تصف بروتوكول تنطوي على وضع العلامات المحددة من خطوتين من البروتينات المستقبلة مع نقاط الكم الفلورسنت (QDS) 8، والمتلازم المجهر الضوئي وESEM-STEM. وكمثال، درسنا EGFR، وهو بروتين الغشاء الذي ينتمي إلى الفصيلة بروتين كيناز. على يجند ملزمة، ومستقبلات ينشط ثم يشكل ديمر مع آخر EGFR المنشط؛ شلال إشارة لاحقة محركات تكاثر الخلايا 9. الطفرات غير طبيعي مما يؤدي إلى التعبير EGFR أو النشاط تلعب دورا مركزيا في أنواع عديدة من السرطان 10. ادرس فيز الترتيب المكاني لهذه المستقبلات في خلايا الغشاء كله يوفر معلومات سياق مهمة عن وظيفتها والتغييرات المحتملة منها 11-14. ولكنها لا تزال صعبة للتحقيق في توزيع أحادية EGFR، dimers، ومجموعات مباشرة على (شبه) المستوى الخلوي مع أساليب الفحص المجهري biochemical- أو التقليدية 15. أسلوبنا هو قادر على تصور EGFRs مع قرار المكاني لبضعة نانومتر هذه أن مواقع البروتينات في مجمع يمكن تحديدها. الأهم من ذلك، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها عن توزيع القياس المتكافئ تتعلق بالوضع الأصلي من البروتين في الخلية سليمة. من أجل تحقيق مسافة قصيرة بين التسمية والمستقبلة، وEGFR المسمى مباشرة عبر EGF يجند لها، وذلك باستخدام السندات البيوتين streptavidin إلى QD. ويمكن الكشف عن هذه التسمية على حد سواء مع المجهر fluorescence- والإلكترون. وقد استخدمنا هذه التسمية للتصوير المتلازم الخلايا COS7 فيالسائل المغلقة في غرفة ميكروفلويديك سابقا 1،16،17. ومع ذلك، وعلى حساب من مضاعفات streptavidin الجزيئات في QD، هذه التسمية قد تحفز مستقبلات المجموعات، مما يؤدي إلى كفاءة وضع العلامات المنخفضة أو تجارب مكلفة نوعا ما، وأنه من غير الممكن التوصل إلى نتيجة بشأن رياضيات الكيمياء من البروتين قيد التحقيق. ويمكن تجنب التسمية التي يسببها تجمع مستقبلات تماما عن طريق استخدام إجراءات وضع العلامات من خطوتين المعروضة هنا، مما أدى إلى تحقيق تضم EGF المعقدة البيروكسيديز التي يقترن واحد فقط، streptavidin الكم نقطة (STR-QD). يتم تحضين الخلايا لأول مرة مع EGF المعقدة البيروكسيديز، ثم الثابتة. الخطوة تثبيت تحدد النقطة الوقت الذي توقفت عمليات البروتين (اعتمادا على سرعة التثبيت). يتم تطبيق STR-QD بعد ذلك كخطوة الثانية من بروتوكول وضع العلامات. التكتل لا يحدث منذ ديناميكية الحركة غشاء من البروتينات ما يعوق مرة واحدة يتم إصلاح البروتينات. وعلاوة على ذلك، فإن الحل STR-QD، الذي هومعظم مكونات مكلفة من التجربة، ويمكن تطبيقها في تركيز منخفض الأمثل، وهذه الخطوة الثانية من وضع العلامات ليست-وقت حاسم، أي QD يمكن أن تقترن في عدة دقائق. لدراسة رياضيات الكيمياء من EGFR كما وزعت في الخلايا بأكملها، وكانت العينات الخلوية مستعدة على رقائق السليكون 18. بعد تطبيق العلامات QD من خطوتين، وتسجيل الصور مضان المجهر، وتشطف الخلايا مع الماء النقي، وتصويرها في دولة المائية باستخدام ESEM-STEM 19. توفر الصور المترابطة الناتجة المعلومات حول توزيع EGFR الخلوي، ورياضيات الكيمياء في السياق الطبيعي في الخلايا المائية. تم استخدام طريقة مماثلة لدراسة البروتينات HER2 في خلايا سرطان الثدي في دراسة حديثة 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

يصف هذا البروتوكول بوضع العلامات على عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR) على الخلايا الليفية COS7، واللاحق المتلازم المجهري مضان والمسح البيئي المجهر الإلكتروني (ESEM) من الخلايا الكاملة في ولاية المائية. اقترنت النقاط الكمومية الفلورسنت (QDS) لEGFR عبر بروتوكول وضع العلامات على مرحلتين، وتوفير وضع العلامات كفاءة ومحددة من البروتين، مع تجنب التجمعات التي يسببها التسمية للمستقبل. قدم مضان المجهر الصور نظرة عامة من المواقع الخلوية من EGFR. تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ المسح الضوئي (STEM) كاشف للكشف عن العلامات QD لقرار النانو. الصور المترابطة الناتجة توفر بيانات توزيع EGFR الخلوي، ورياضيات الكيمياء على المستوى الجزيئي واحد في السياق الطبيعي للخلية سليمة المائية. وكشفت الصور ESEM-STEM مستقبلات ليكون حاضرا كما مونومر، كما homodimer، وفي مجموعات صغيرة. وصفها مع اثنين من QDS مختلفة،أي واحد تنبعث منها في 655 نانومتر و 800 كشفت نتائج مميزة مماثلة.

الشكل 1 و 2 تظهر الصور ممثل QD655 المسمى، بغشاء EGFR تصور في حالها، COS-7 المائية بالكامل الخلايا. صورة مدينة دبي للإنترنت في الشكل 1 يعطي انطباعا تضاريس غشاء الخلايا، وصورة مضان المقابلة في الشكل 1B يصور توزيع EGFR بعد 3 دقائق من-EGF البيوتين الحضانة. 1A الشكل وB تحاك كل جانب من اثنين الصور المسجلة مع هدف الهواء 40X. يتم توزيع EGFR تنشيط EGF على سطح الخلايا بأكمله. في معظم الخلايا ويمكن رؤية زيادة طفيفة من مضان (الشكل 1B) على حواف الخلية، مما يشير إلى حدوث زيادة محليا من EGFR 20. تجارب السيطرة التي أجريت باستخدام بروتوكول مماثل التحقق منها وضع العلامات EGFR محددة (لا تظهر البيانات). وتشمل هذه الضوابط: 1) وضع العلامات السيطرة من دون الحضانة السابقة للمLLS مع EGF البيوتين، أي حضانة فقط مع STR-QDS، و 2) والحضانة مع غير المعقدة البيروكسيديز EGF وSTR-QDS. وقد حققت في ثلاث خلايا ملحوظ مع المستطيلات مع مزيد من ESEM-STEM. الصور ESEM-STEM مبين في الشكل 1C - E تظهر لمحات عامة التكبير منخفضة من هذه الخلايا. هذه الصور تعكس انتقال الخلايا الكاملة في ولاية المائية مع طبقة رقيقة من الماء المقيمين فوق الخلية وضعت على رقاقة السيليكون مع نيتريد السيليكون (الخطيئة) نافذة عرض. تم تعديل فراغ الغرفة في المجهر الواردة بخار الماء، والتوازن بين درجة حرارة العينة والضغط للحفاظ على طبقة رقيقة من السائل على الخلايا. الخلايا الفردية يمكن التعرف بسهولة على حساب شكلها وموقعها على النافذة غشاء الخطيئة. انخفاض التكبير الصور ESEM-STEM تكشف الهياكل الدقيقة، مثل أرجل كاذبة خيطية، وتمتد من حافة الخلية نحو الخلايا المجاورة، وبعض الهياكلداخل المناطق خلية أرق. المناطق الخلوية المركزية سميكة بما في ذلك النواة تظهر بيضاء بسبب انتقال العدوى عن طريق عينة من غير الممكن للإلكترونات من الطاقة المستخدمة (30 كيلو). وسجلت صور عالية الدقة ESEM-STEM في أرق والمناطق الطرفية. تم تحديد القرار المكانية لESEM-STEM النانوية في المناطق رقيقة من الخلايا في طبقة رقيقة سائلة في دراسة سابقة 6 لتصل إلى 3 نانومتر. أربع صور عالية الدقة هو مبين في الشكل 2A - سجلت D في مواقع مستطيلات صغيرة في الشكل 1C - E. واستخدامها والتكبير كافية لتمييز QDS الفردية، والتي تظهر، وقضبان على شكل رصاصة كما مشرق، كل ملزمة للفرد EGFR. وQD655 لها أبعاد نموذجية من 6 × 14 نانومتر 2. الشكل 2A (المقابلة لمنطقة مستطيلة أشار على الخلية في فيقوإعادة 1C) يظهر علامات QD على غشاء أضعاف قطريا عبور الصورة. هذا الهيكل الغشاء لديها كثافة EGFR أعلى من المناطق المحيطة بها غشاء. في عدة مواقع، وكانت تسميات اثنين على مقربة. يشار إلى مثالين مع المسافات بين 20 و 24 نانومتر مع السهام. يتم تفسير هذه الأزواج من تسميات على أنها تنتمي إلى dimers EGFR. الشكل 2B يعطي مثالا من حافة الخلية (1D الشكل المستطيل الأيسر)، أحادية EGFR وdimers يمكن أن ينظر إليه كذلك. الشكل 2C (الشكل 1C، المستطيل الأيمن) وسجلت في منطقة مع إشارة مضان أقل، أي أقل كثافة EGFR. ومع ذلك، وكما وجدت EGFR هنا في dimers كذلك. بالإضافة إلى ذلك، كانت مجموعتين من 10 أو 11 EGFRs الحالية (انظر الحذف). ويبين الشكل 2D مثال آخر على أضعاف غشاء (الشكل 1E) مع كتل أصغر منها 5-6 EGFRs، بالإضافة إلى العديد من مونومراتوdimers. وكمثال على هذا النوع من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من هذه البيانات، الزوج ارتباط وظيفة 21 ز (خ) كان مصمما لجميع المواقف التسمية في الشكل 2. لاحظ أن هذا التحليل ليس جزءا من هذا البروتوكول ووصف الإجراء في أماكن أخرى 6،7. ز (خ) هو مقياس فرصة من الجسيمات التي يمكن العثور عليها ضمن مسافة معينة شعاعي العاشر من الجسيمات المرجعية. ز (س) = 1 يمثل التوزيع العشوائي، وقيمة أكبر هي الدليل على المجموعات. تم الكشف عن مواقف ما مجموعه 210 التسميات تلقائيا في أربع صور من الشكل 2A-D، و (ز) (س) وتحسب باستخدام حجم بن ل5 نانومتر، ومرشح تجانس مع عرض النطاق الترددي من 10 نانومتر. ز (خ) منحنى (الشكل 3) يدل على مسافة QD من 25 نانومتر المفضلة مركز إلى مركز. وهكذا يست موجهة EGFRs عشوائيا ولكن جزءا كبيرا منهم يقيم في هذه المسافة المفضلة. من approximatالبريد النموذج الجزيئي 6 (الشكل 3 الشكل) فإننا نقدر أن المسافة مركز إلى مركز بين QD وجيب ملزمة EGF تصل إلى ~ مسافة 14 نانومتر، ومركز إلى مركز بين البلدين QDS تعلق على ديمر EGFR ل يكون ~ 27 نانومتر (من المرجح أن تختلف من بضعة نانومتر هذه القيمة نظرا لمرونة رابط). المسافة التسمية فضل وهكذا تتفق مع المسافة التسمية المتوقعة للديمر EGFR داخل دقة الأسلوب. ز (خ) منحنى أكبر من وحدة لمسافة تصل إلى 300 نانومتر، مما يشير إلى وجود مجموعات، بما يتفق مع البيانات. ويبين هذا التحليل أن الجزيئية للEGFR يمكن دراستها مع أسلوبنا. ويبين الشكل 4 نتيجة مماثلة الرقم 2، إلا أنه تم إجراء وضع العلامات مع EGF-QD800، وكان يستخدم هدفا الغمر 63X النفط للصورة مضان. تؤكد هذه البيانات التي تم العثور عليها هذه النتائج نموذجية أيضا عندمايتم وضع العلامات EGFR مع QDS، التي تنبعث منها في الطيف الأحمر القريب. الشكل 4A هي صورة مضان خلية التمثيلية، ويبين الشكل 4B نفس الخلية في وضع نظرة عامة ESEM-STEM والشكل 4C هو صورة التكبير 150،000 العاشر، وسجلت على الحدود الغشاء العلوي من الخلية (انظر المستطيل في الشكل 4B). على غرار الشكل 2A و D، والتقاط الصور EGFR QD المسمى على أضعاف الغشاء ويظهر مستقبلات أحادى، مثنوي، وتتجمع. لاحظ أن الإلكترون QD كثيفة الأساسية يبدو مستدير أصغر نوعا ما ومن النوى من QDS تنبعث منها في 655 نانومتر، بما يتفق مع هم أصغر حجم الأساسية 22 من ~ 5 نانومتر. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> الشكل 1. المتلازم مدينة دبي للإنترنت، ومضان ESEM-STEM من EGF-QD655 صفت EGFR على COS-7 المائية بالكامل الخلايا </stرونغ&gt;. (A) DIC صورة للخلايا المزروعة في المنطقة نافذة غشاء الخطيئة، وإعطاء انطباع الطبوغرافية للغشاء البلازما. (B) الإسفار صورة تظهر الخلايا على النافذة غشاء الخطيئة بموقع مركزي (والتي تمثلت في مستطيل متقطع). (C - E) ثلاثة ESEM-STEM صور منخفضة التكبير من الخلايا التي تحمل علامة المستطيلات في A و B. هذه الصور نظرة عامة خلية تعمل على تحديد الموقع الدقيق للتسجيل في وقت لاحق الصور عالية الدقة. يتم وضع علامة على مكان أربع صور عالية الدقة (كما هو موضح في الشكل 2A-D) مع المستطيلات البيضاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 2. عالية الدقة صور ESEM-STEM تصور غشاء ملزمة EGFRs. (A) صورة مجهرية في 75،000X التكبير من منطقة ملحوظ في الشكل 1B. العديد من أحادية واضحة. يشار إلى عدة dimers مع السهام. (B) و (C) وصور المكتسبة في 50،000X التكبير من اليسار، علامة، المناطق غشاء اليمنى على التوالي في الشكل 1C. وترد مجموعات من EGFRs. (D) الصورة المسجلة مع 50،000X التكبير في الموقع ملحوظ في الشكل 1D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> الشكل 3. زوج دالة الارتباط ز (خ) وظيفة من المسافة شعاعي X تحديد للأمور-حزب<html> المسافات كلي من كل التسميات 210 الكشف في الشكل 2A-D. الذروة في 25 نانومتر يشير إلى أن QD مسافة مركز إلى مركز لديها فرصة أكبر بكثير من التي تحدث من العشوائية، حيث AG (س) = 1 يشير إلى وجود فرصة عشوائية. خط متقطع هو دليل للعين يمثل ز (خ) من توزيع عشوائي. يظهر أقحم نموذج الجزيئي التقريبي للديمر EGFR مع EGF المربوطة وstreptavidin المغلفة QDS تعلق عبر البيوتين. نماذج من streptavidin، تم الحصول على EGF وEGFR من نماذج CPK من 1stp (streptavidin)، 1EGF (EGF)، 1NQL، 2JWA، 1M17، 1IVO و2GS6 (EGFR) الهياكل في البروتين RCSB بروتين بنك المعلومات، التي أنشأتها Jmol النسخة 12.2.15. نموذج البيوتين هو كما تعادل في RCSB يجند Explorer الإصدار 1.0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; الرقم 4. النموذجية COS-7 الخلية المسمى مع EGF-QD800 وتصويرها مع مضان مترابط وESEM-STEM. (A) صورة الإسفار، (B) منخفضة نظرة عامة التكبير صورة ESEM-STEM. (C) عالية الدقة الصورة المسجلة في الموقع من المستطيل في ب في 150،000X التكبير. تم الكشف عن EGFRs أحادى، مثنوي، وتتجمع مماثل لوضع العلامات مع EGF-QD655. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy at JoVE.com

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

دراسة رياضيات الكيمياء من البشرة عامل نمو مستقبلات في الخلايا السليمة باستخدام الميكروسكوب المتلازم

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

studying-stoichiometry-epidermal-growth-factor-receptor-intact-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Views.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

Video: Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

دراسة مسارات المتداول على أنماط الخلية المستقبلة المتناظر

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

تسليم الجينات والخلايا البشرية في ترنسفكأيشن سرطان البنكرياس باستخدام مستقبلات عامل نمو البشرة استهداف الجيلاتين المستندة Nanovectors المهندسة

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

عامل نمو Electrospinning الافراج الجزئي في الليفية السقالات

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

مجمع متضاعف الكتروليتي للهيبارين ربط تسليم عظمية عامل نمو المجال

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...