We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.

Etiketleme ve Fiksasyon Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> Otoklavdan geçirilmiş fosfat tamponlu salin kullanılarak etiketleme tamponu (BSA-GEL-PBS), pH 7.4 (PBS) hazırlayın. % 1 BSA (sığır albümin fraksiyonu V, biotin ücretsiz) ve% 0.2 jelatin (GEL, soğuk su balıkları deriden) ve vorteks ile Supplement / iyice sallayın. Not: 4 ° C&#39;de ~ 5 gün muhafaza edilebilir. </li><li> Otoklavlanmış fosfat tamponlu tuzlu su, pH 7.4 yıkama tamponu (BSA-PBS) hazırlayın. % 1 BSA ve vorteks ile Supplement / iyice sallayın. Not: 4 ° C&#39;de ~ 5 gün muhafaza edilebilir. </li><li> 200 mM ila 50 mM borat tamponu (BB), borik asit stok solüsyonu hazırlayın, pH&#39;ı 200 mM sodyum tetraborat ile 8.3 olacak şekilde ayarlanır. Not: 4 ° C&#39;de ~ 12 ay süreyle saklanabilir. </li><li> 0,2 M sodyum kakodilat stok çözeltisinden 0,1 M kakodilat tamponu (CB) hazırlayın, pH&#39;ı 0.1 M sukroz ile takviye edilmiş, 7.4&#39;e ayarlanmıştır. Not: Açılmış stok çözeltisi 4 ° C&#39;de ~ 5 gün muhafaza edilebilir. </li><li> (PBS içinde 0.1 M glisin G hazırlayınLY-PBS). Not: 4 ° C&#39;de ~ 2 ay boyunca saklanabilir. </li><li> Taze yapılmış veya açılmış% 16 PFA flakon, stok solüsyonu, EM notu gelen CB% 3 paraformaldehid (% 3 PFA) hazırlayın. Not: Açılmış stok çözeltisi 4 ° C&#39;de ~ 5 gün muhafaza edilebilir. </li><li> CB taze (ya da şişe açık) (% 2 GA)% 25 GA stok çözeltisi, EM sınıf içinde% 2 glutaraldehid hazırlayın. Not: Açılmış stok çözeltisi 4 ° C&#39;de ~ 5 gün muhafaza edilebilir. </li><li> 300 nM EGF-biyotin etiket çözeltisi hazırlayın <ol><li> BSA-GEL-PBS içinde 6 uM EGF-biyotin stok çözeltisi seyreltilir mikroçip 100-200 ul bir hacim kullanılır. Birkaç saat içinde kullanın. </li></ol></li><li> 10 nM STR-QD etiketleme çözüm hazırlayın <ol><li> , 8000 x g&#39;de 4 dakika streptavidin QD stok solüsyonu santrifüj süpernatant alıp BB 1:10 sulandırmak. QDS farklı tipte, örneğin, QD655 veya QD800 için kullanılabilir. BSA-GEL-PBS içinde nihai konsantrasyon sulandırmak mikroçip başına 75-100 ul kullanın. Içinde kullanınBirkaç saat. </li></ol></li></ol> Silikon Nitrür Membran mikroçipler 2. Hazırlık <ol><li> Temiz oda doku ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) seviye etanol ile, ışık mikroskopisi için kullanıldığı gibi, bir mikroskop cam slayt temizleyin. </li><li> Düşük toz seviyesine sahip bir laminar hava akımı tezgahında ise, 100 mm çaplı Petri kabı açın ve tabağa temizlenmiş mikroskop camı yatıyordu; Açık çanak bırakın. </li><li> Tercihen karbon fiber veya diğer kaplama ile kaplanmış temiz cımbız ile, kendi depolama kutudan ve cam slayt üzerine ince (50 nm) silisyum nitrür zarları ile 4-10 mikroçipler, birbiri ardına almak. Nazikçe yanlarında mikroçip tut ve ince silisyum nitrür zarında oluşan kırılgan üst tarafa dokunmaktan kaçınınız. Her zaman zar tarafı tutmak için büyük bir özen ve dokunmayın. Mikroçipler dikdörtgen olmalı ve onların silisyum nitrür için örtülü dik düz kenarları Not:kolayca kavranabilir böylece yüz. </li><li> Petri kapağını kapatın ve Davlumbaz getirmek. Yeni bir temiz oda doku alın ve petri yanına yatırın. 50-70 ml aseton ile bir ve etanol içindeki benzer bir hacmi ile diğer HPLC kalitesinde iki doldurarak iki temiz 200 ml&#39;lik bir cam beher hazırlayın. İlk temiz oda doku üzerine cam slayt mikroçipler aktarın. </li><li> Doku, koruyucu tabakasını karşı çıkarılması için aseton ile ilk behere tek mikroçip tek aktarın. Hafifçe mikroçip iyice durulandı sağlamak için bir beher birkaç kez hareket ederken, 2 dakika bekleyin. </li><li> Onları kurumasına izin vermeden, doğrudan etanol ile beher içine mikroçipler aktarın. 2 dk bekleyin. Sonra laminer hava akışı tezgah için beher aktarın. Yeni bir temiz oda doku alın. </li><li> Doku üzerine cips aktarın ve bir kaç dakika kurumaya bırakın. , Petri kabındaki cam slayt üzerine mikroçip aktarın çanak kapatınve plazma temizleyici getirmek. </li><li> Plazma süpürge içine mikroçipler ile cam slayt yatırın. Silisyum nitrür membran hidrofilik yüzeyini işlemek için 5 dk temizleme programını çalıştırın. Not: Bizim plazma temizleyici uygulanan Uygun ayarlar şunlardır: 70 mTorr, O 2 için 11.5 sccm&#39;lik ve Ar için 35.0 sccm&#39;lik, 50 W ileri radyo frekansı (RF) hedefe, 5 W RF aralığı ve maksimum gaz akışı. RF yansıtmaktadır. </li><li> Geri petri içine mikroçip ile cam slayt koymak ve onun kapağı kapatın. Şu andan itibaren steril mikroçip tutmaya özen gösterin. </li><li> Olası zar yırtığı veya kalan kir parçacıklarının bir ışık mikroskobu altında mikroçip pencere alanları inceleyin. </li><li> Laminer hava akışı tezgah için petri getirin. </li><li> Laminer hava akışı tezgahında aşağıdaki öğeleri koyun: tüpler / şişe,% 0.01 poli-L-lisin solüsyonu sterilize içeren (. PLL mol 150,000-300,000 wt, steril filtre edilmiş ve hücre kültürü test), HPLCdereceli su, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 fetal bovin serumu, serum olmadan DMEM, yeni bir temiz oda dokusu steril bir 24 oyuklu plaka (12 oyuklu plaka da kullanılabilir), 96- steril takviye iyi levha, steril pipet uçları, bir pipet ve düz, yuvarlak uçlu, cımbız. </li><li> 24-plaka alın ve PLL iyi bir dolgu ve HPLC dereceli su ile iki kuyu, yaklaşık bir kullanın. oyuk başına 1 ml hacmi. Bir yaklaşık kullanın 96-plaka alın ve serum serbest DMEM ile de her mikroçip iki DMEM desteklenmiş serum ile kuyu ve bir doldurun. oyuk başına 200 ul hacmi. </li><li> Mikroçip işlemek için steril ipuçları kullanım cımbız Şu andan itibaren. Kısaca yanan ve daha sonra cımbız ipuçları serinlemek tarafından, örneğin, bunu başarmak. </li><li> İlk temiz oda doku üzerine cam slayt mikroçipler aktarın. Doku, iyi PLL dolu içine altı mikroçip kadar transferi 5 dakika boyunca mikroçipler kuluçkaya yatmaktadır. Değile: Daha fazla mikroçip içeren bir deney için, 24-çukurlu plaka içinde ilave kuyu doldurun. </li><li> Daha sonra ilk su dolu kuyuya, tek-birer onları yerleştirerek mikroçip durulayın ve oradan ikinci kuyu su dolu içine. PLL kaldırılmasını önlemek için uzun bir dakika daha suda mikroçip bırakmayın. </li><li> Son olarak 96 oyuklu plakanın DMEM dolu oyuklara ayrı ayrı yerleştirin. Hücre süspansiyonu hazırlanmıştır kadar CO2 inkübatöründe 96 oyuklu plaka saklayın. </li></ol> Mikroçipler Hücreler 3. hazırlanması <ol><li> Yaklaşık bir konsantrasyonuna sahip bir hücre süspansiyonu hazırlamak için COS7 hücreleri bir alt kültür gerçekleştirin. 5 × 10 5 hücre / ml. Hücreler tek dağılmış olduğundan emin olun. </li><li> Mikroçip ile 96 oyuklu plaka almak ve her bir mikroçip hücre süspansiyonu, bir damlacık ekleyin. 5 dakika bekleyin. </li><li> Cho için ters bir mikroskop ile mikroçip pencere alanlarını incelemek başlayınserum serbest DMEM ile yeni bir kuyunun içine aktarmak için doğru anı ose. Not: hücrelerin iyi bir yoğunluk 150 x 400 um bir pencere boyutu 24 COS7 hücreleri karşılık gelen 2500 um 2 alan başına yaklaşık bir hücre ile elde edilir. Yüksek hücre yoğunlukları hücrelerinin maksimal düzleşme engel riski var. Bir hücre SIN membran üzerine yerleşmiş sonra, yeni kuyunun içine transferi sırasında kapalı yüzen direnecek kadar yapışma geliştirmek için 3-5 dakika gerektiğini unutmayın. </li><li> Yeterli hücreler pencere üzerine yapıştırılır zaman bir sonraki kuyuya mikroçip aktarın. Yukarı bakacak şekilde hücreler ile her zaman mikroçip tutun ve bu tarafa herhangi bir dokunma kaçının. </li><li> Transferden sonra, yine her mikroçip penceresini inceleyin. Çok hücreler kapalı yıkandı ve kalan hücrelerin sayısı yetersiz ise, yeniden çiğnemek hücre süspansiyonu (yeni oluşan hücre kümeleri break up) ve tekrar 3.1-3.5 adımları tekrarlayın. </li><li> Tüm transfer mikroçipler yeterli olduğundaonların pencere alanlarında hücreleri kalarak,. serum serbest DMEM son kuyuya cips transferi CO 2 kuvöz içine geri 96-plaka koyun ve hücreler kurtarmak izin ve birkaç saat, en iyi O / N düzleştirmek. </li></ol> 4. EGFR Etiketleme, Fiksasyon ve Floresan Mikroskopi <ol><li> Aşağıdaki adımlar için bir 96-kuyu ve bir 24-çukurlu plaka kullanılır. İlgili çözümlerle kuyu öncesi dolgu ve mikroçip başına bir satır veya sütun kullanın. 24- kuyu plaka CB, PFA ve GA ile tespit adımlar için davlumbaz altında kullanılmaktadır. Daima yukarı bakacak şekilde hücreler ile mikroçip aktarmak ve bu tarafa herhangi bir dokunma kaçının. </li><li> Bir de taze BSA-GEL-PBS ile mikroçip yerleştirerek mikroçip durulayın, sonra 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde 96 oyuklu plaka yerleştirilir. </li><li> 37 ° C &#39;de 3 dakika süre ile 300 nM EGF-biyotin çözeltisi ile inkübe edilir. Hücreler EGF-etiketli düzeyde EGFR endositozu başlayacak Çünkü, Ste mümkün olduğunca hızlı ilerlemeks 4.4. </li><li> PBS ile 3 kez ve CB ile 1 defa (şimdi 96 plaka oda sıcaklığında yine) durulayın. </li><li> 10 dakika süreyle% 3 PFA inkübe edin. </li><li> Cips CB ile 1 kez, ve PBS ile 3 kez durulayın. </li><li> , 2 dakika boyunca GLY-PBS içinde inkübe 1 kez PBS ile 2 kez çalkalayın. </li><li> 10 dakika boyunca 10 nM STR-QD inkübe edin. </li><li> BSA-PBS ile 4 defa yıkayın. </li><li> Cam alt 35 mm çanak RT&#39;de BSA-PBS ile önceden doldurulmuş bir mikroçip Batmak. </li><li> QD etiketli hücrelerin diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri ve floresan görüntüler elde. <ol><li> QD655 etiketli hücrelerin genel görüntüler için 40X hava hedefini kullanın. Neşr edilen floresan ışığın en verimli şekilde toplanmasını sağlar (örneğin, 63X için) Bir yağ batırma objektifi kullanarak; QD800 ile etiketlenmiş hücrelerin görüntüleme zaman bu özellikle gereklidir. </li><li> 420 nm sui yukarıda yayılan ışığın toplanmasını 340 ve 380 nm arasında floresan uyarma ışık QDS ortaya ve izin veren bir filtre küp kullanınEn QDS (bu durumda filtre küp A) tablo. </li><li> Numuneyi zarar verebilir çok yoğun ışık önlemek için ışık yoğunluğunu en aza indirin. Tüm QDS sinyaller yakalanır ve böylece QDS floresan yanıp sönen bir davranış olduğunu belirterek, en az 300 msn pozlama süresini ayarlayın. </li><li> Işık yoğunluğunu ayarlayın ve ışık yoğunluğunu en aza indirerek büyütme, görünür görüntü gürültüsü olmadan parlak görüntüler sunmak için. Not: Görüntü serisi aynı bölgeden alınan Alternatif olarak, daha kısa maruz kalma süresi de kullanılabilir. Bu dizi, resmin, böylece ortalama gürültü azaltılmasına yol açan, maksimum projeksiyon görüntüsünü elde etmek için işlenebilir. </li></ol></li><li> BSA-PBS ile dolu bir 96-çukurlu plaka iyi geri (hücreler yukarı bakacak şekilde) görüntülü mikroçip yerleştirin. </li><li> CB mikroçip 1 kez durulayın. </li><li> 10 dakika boyunca% 2 GA inkübe edin. </li><li> CB 1 defa ve BSA-PBS ile 3 kez durulayın. </li><li> ESEM i kadar Mağaza mikroçipmaging, BSA-PBS içinde yeni bir 96-kuyulu plakanın kuyularının önceden doldurulmuş. Her mikroçip HPLC dereceli su ile dört kuyuların bir satır doldurun. Not: numuneler bir kaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir, bununla birlikte, tam bir görüntüleme serisi iki gün içinde gerçekleştirilir, en iyi sonuçlar elde edilir. QDS yavaş yavaş bu nedenle ESEM görüntüleme yapılmadan önce fazla 10 gün beklenmesi tavsiye edilmez, numuneden ayırmak başlayacaktır. Not: Floresan görüntüleri gelecek analizi için saklanır. Görüntülerde hücrelerin pozisyonları kolayca SİN penceresinin köşeleri lokalize ve köşelere göreli konumlarını ölçmek yoluyla elektron mikroskobu görüntüleri ile ilişkili olabilir. Not: Bu yüksek kaliteli floresan görüntüleri yazdırmak ve ESEM görüntüleri kaydederken oryantasyon amaçlar için kullanılması tavsiye edilir. </li></ol> Tüm Hücreleri 5. Islak ESEM-KÖK <ol><li> Islak KÖK için Esem hazırlayın <ol><li> Gazlı ikincil elektron d monteetector (GSED) ve (numune altında bulunan) KÖK detektörü içeren Peltier sahne. </li><li> Aşamasında soğutma suyunun akışını başlatmak ve 3 ° C sıcaklık ayarlayın. </li><li> Sahne xy sıfıra koordinatları ayarlayın ve yaklaşık 6 mm çalışma mesafesi ayarlayın. </li></ol></li><li> Mikroçip plastik bir kutu içinde, dondurulmuş soğutma elemanları olarak örneğin, serin ile ESEM görüntüleme sırasında, 96 oyuklu plaka tutun. </li><li> Precooled ESEM-STEM aşamasında içine bir örnek yüklenmesi için, soğutma konteyner: 96-plaka almak ve yakın açıldı ESEM sahneye yerleştirin. Bunun yanında, yeni bir temiz oda doku koyun. </li><li> Hızla iyi HPLC dereceli su ile dolu içine yaklaşık bir saniye o dört kez, her seferinde daldırarak (yukarı bakacak şekilde hücreler) ile bir mikroçip durulayın. </li><li> Temiz oda dokusu üzerindeki mikroçip kısaca ters kurulayın ve önceden soğutulmuş aşamaya mikroçip yerleştirin. Hücreler ıslak kalmasını emin olun, bu olabilir,Bir yansıtıcı yüzey tarafından tanınan (donuk yüzeyinde sonuçları kurutma). </li><li> Soğutmalı HPLC dereceli su 3 ul (pipet ucuyla yüzeyine dokunmamaya dikkat edin) ile örnek yüzeyini ıslak ve evre örnek düzeltmek. </li><li> Numunenin yakın sahnede üç ek 3 ul su damlacıkları yerleştirin. </li><li> Numune odasına kapatın </li><li> . Basıncı Pa 800 ila 1.500 beş kez bisiklet ile numune odasına Temizle 800 Pa ile bisiklet sonlandırın. </li><li> Elektron ışını (30 kV) Anahtarı ve mikroçip penceresinin konumu aramak için, yani her iki dedektörleri, GSED ve STEM dedektörü ile en düşük büyütme altında numune inceleyin. Not: Su tabakası çok kalınsa, pencere görünmeyebilir. Bu durumda, 760 Pa basınç düşürücü başlar ve bir kaç dakika bekleyin. Pencere ilk GSED ile görünür hale gelir. </li><li> Specim hareket ettirerek görüntünün merkezinde SİN zar penceresini yerleştirinsahneye tr ve 750-720 Pa basıncı azaltmak. Not: Su tabakası kadar ince ise, pencere de STEM detektörü ile görünür hale gelir. </li><li> Bundan görüntüleri kaydetmek için KÖK dedektör karanlık alan segmentini kullanın. İlk olarak, tam pencere alanında tüm hücreleri gösteren bir ya da iki görüntü kazanır. </li><li> Işık mikroskobu görüntüleri ile bu ESEM görüntüleri karşılaştırın SıN penceresinin köşeleri bulun. </li><li> Büyütme, döndürme, yansıtma ve olası karşılaştırarak hem mikroskopi yöntemleri kareleri koordine ilişkilidir. Her iki görüntüde de aynı hücreleri bulun. </li><li> Böyle eucentric yüksekliği, ince odaklama ve objektif stigmatism düzeltilmesi gibi görüntüleme ayarlarını yapmak için küçük özellikleri ile çok küçük kir parçacıklarını veya hücre bölge seçin. En azından 50.000X büyütmede çalışmak, bir elektron prob akımı yaklaşık 0,6 nA, 30 ms&#39;den bir piksel bekleme süresi ve 1024 x 884 piksel boyutunu kullanın. Not: Diğer ayarlar da b olabilire sürece elektron dozunun bir artış önlenir olarak kullandı. Not: çok temiz çalışma bile protokol temiz oda ortamında idam değil, çünkü yonga yüzeyleri pratikte her zaman, bazı kir parçacıkları içerecektir. </li><li> QD etiketli hücreleri KÖK görüntüleri kaydetmek için, floresan görüntüleri bakın ve ilgi bir hücreyi seçin. Not: Bu güçlü QD sinyallerini gösteren bir hücre ile başlamak en iyisidir. </li><li> Bu hücrenin bir KÖK genel görüntüsünü kaydedin. </li><li> Hücre sınır görünür bir çevresel bölgeye gidin ve 50.000X büyütme ulaşmak için yakınlaştırmak. </li><li> Bireysel QDS gösteren Tutanak görüntüleri, 20-30 mikro-saniye piksel bekleme sürelerini kullanın. Sadece bir kez yüksek büyütme ile radyasyon hasarı, görüntü her bölgeyi önlemek için. Not: Genellikle, bu aşamada hem odak ve stigmatism düzeltilmesi de, bazı ince ayar gerekiyor. </li><li> Yüksek büyütme görüntüleri, zoom-out ve ac yeterli sayıda Kayıttan sonraquire başka KÖK genel görüntü, sadece karanlık dikdörtgenler gibi yüksek büyütme ile kaydedilmiş bölgeleri tasvir. Not: Bu genel görüntüler daha sonra ESEM ve floresan görüntüleri ilişkilendirmek için ve hücresel bağlamda yüksek büyütme görüntüleri kesin konumunu belirlemek için görev yapacak. </li><li> Ilgi sonraki hücreye geçin bir bakış görüntüyle başlarsanız, yüksek büyütme görüntüleri bir dizi kaydedebilir ve bir bakış imajı ile biter. </li><li> Bir ESEM görüntüleme oturumun sonunda, odasını havalandırmak başlamadan önce 850-900 Pa basınç artışı. Not: Bu basınç artışı hala ıslatılmış yüzeye sahip mikroçip kurtarma şansı geliştirir; Bununla birlikte, bu her zaman elde edilemez. İsterseniz kurutulmuş olmamıştı örnek bir zaman içinde daha sonraki bir noktada Esem yeniden araştırılmış, BSA-PBS restore edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li><li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film.">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li><li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy.">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li><li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution.">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy:+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells.">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy.">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li><li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy.">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li><li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology.">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li><li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li><li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts.">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li><li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib.">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li><li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton.">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li><li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding.">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li><li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+organization+of+ErbB+receptors:+insights+from+microscopy.">The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6, (2014).</li><li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li><li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid.">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li><li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells.">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li><li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet+STEM:+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase.">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li><li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells.">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li><li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes.">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots.">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+ERBB+receptors:+Multiple+layers+of+diversity+and+control.">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li><li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue.">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li><li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography.">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li><li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy.">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li><li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-fracture:+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces.">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li><li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments.">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li><li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase.">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324 (2015).</li><li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy.">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bütün hücrelerde EGFR gibi membran proteinleri, uzamsal dağılım ve stokiometrinin incelenmesi işlevi ve 11-14 bunların olası değişiklikler hakkında önemli içerik bilgilerini sağlar. Doğrudan bilgi hücre veya hücreler 15 arasındaki farklılıkların protein lokalizasyonu ile ilgili kayıp olduğu için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerle bir hücre içi seviyesinin üzerinde monomerlerin, dimerlerin ve kümelerin dağılımını incelemek için zordur. Bunu stokiyometri birey, sağlam hücreler 4-7 kapsamında ele böylece burada açıklanan etiketleme ve mikroskopi yöntemleri, birkaç nanometre uzunluğu ölçekte protein kompleksleri görünümlerini verir. Bu (süper çözünürlük) ışık mikroskobu 23 çözünürlüğü bir protein kompleksi yapan moleküllerin ayırt yetersiz olduğundan mümkün değildir. Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) bir topluluk ortalama tekniği &lt;olduğunu24&gt; sup ve mutlaka enerji transferi 25 kısa menzilli bir sonucu olarak dimerleri ve daha yüksek mertebeden kümelerini algılamaz. Proksimite ligasyonu deneyleri 26 aslında mesafeleri ölçmek ve bundan dolayı benzer bir protein yoğunluğuna sahip bir selüler bölgeden, rasgele şansa tespit yakınlıklarına bir dizi gelen kaçınılmaz olarak, yüksek protein yoğunluğuna sahip bir selüler bölgesi arasında ayrım, ancak protein içeren yeteneğine sahip değildirler etiketler arasında belirgin mesafeler sergileyen kompleksleri. Protein kompleksleri bileşenleri görselleştirmek için gerekli olan yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile elde edilir. Bununla birlikte, bütün hücreler, geleneksel TEM plazma membranı 27 ya da plazma zarı kopyalama yoluyla dilimleme veya membranın rastgele oluşturulmuş küçük parçalar halinde elde edilen 28,29 kopma ince örnekleri / kesitlerin şartı ile sınırlıdır. Plazma membranı böylece eksikliği gelen bir bütün olarak görüntülü değildirmuhtemelen önemli hücresel kapsam bilgisi. Hücrelerde protein stoikiometrinin çalışma için diğer deneysel zorluklar uygulamalı protein etiketleme kaynaklanmaktadır. Yaygın olarak kullanılan immün reseptörü ve etiket arasındaki bire bir stoikiometri yalnızca monovalent sonda ile elde edilebilir zorluk taşımaktadır; birincil ve ikincil antikorlar gerekmektedir, bu durum böyle değildir. Protein stokiyometri ile ilgili bilgiler elde etmek için, bir prob reseptörü üzerindeki bir epitopa bağlanır ve benzersiz bir flüoresan sonda veya diğer tarafta bir yüksek atomik sayılı, nano bir bağlanma sahasına sahiptir gerekmektedir. Komşu bir protein, homodimerler ya da daha büyük kümeler arasında bir ayrım mümkün değildir, böylece İkinci olarak, antikor etiketleme ile elde hassas en azından EGFR ailesi reseptörleri için, 30 nm büyük boyutları 30 nedeniyle sınırlıdır. Çok küçük spesifik etiketleri edebiyat ve ca bilinmektedirn, hücre içi etiketleme 31 için daha uygulanabilir, ancak bu genel olarak kullanılmamaktadır. Bütün etiket (EGF-biyotin-streptavidin QD) uzunluğu EGFR gibi benzer bir boyuta sahiptir ve yeterince küçük bir dimeri tespit edebilecektir. Ayrıca, tarif edilen iki adımlı etiketleme prosedürü markalama uyarılmış reseptör kümeleme önler. Önerilen yöntem, çok zordur, fazla etiketli proteinlerin floresan mikroskobu daha fazla değildir. Adım sayısı kadar ekler ve aşamalarından birinde bir hata deneyde bir arızaya yol açabilir Bununla birlikte, bir deney, büyük bir dikkatle yürütülen gerekmektedir. Mikroçipler İşleme tavsiye edilir TEM ızgaraları ancak bazı eğitim, boş cips işleme daha sıkıcı değil. Bütün sulu hücrelerin ESEM-STEM muhtemelen en zor olan ve QDS görselleştirmek için gerektiği gibi 3 nm civarında bir çözüme ulaşmak için, en azından bir uzman operatör ve uygulama birkaç gün gerektirir. Radyasyon barajSoruşturma kapsamında numune yaşı bir risk sunar. Basınç ve sıcaklık dikkatli bir şekilde bir su tabakasının muhafaza edilmesi dikkat edilmelidir. Ayrıca, su tabakasının kalınlığı, hücreler arasında değişebilir. Başka bir yerde tarif edildiği gibi, 6 Bu örnek yukarıdaki gaz halindeki elektron dedektörü ile su tabakasının varlığını tespit için tavsiye edilir. Hücresel bölgeler sadece zarar görmemesi için bir veya iki kez görüntülü olmalıdır. Yöntemin bir önemli sınırlaması ultrastrüktürü ile ilgili yüksek çözünürlüklü bilgi yoktur olmasıdır. Diğer teknikler, örneğin, kriyo TEM için, protein yapısı ve hücresel ultrastrüktürel 15 çalışma için ihtiyaç vardır. İkincisi, zaman atlamalı mikroskobu canlı hücrede protein katları dinamik etkileşimi okuyan radyasyon hasarı nedeniyle mümkün değildir ve state-of-the-art ışık mikroskobu 23 gerektirir. Şu anda, bizim yöntemi l yana dimerlerin mutlak seviyesinin belirlenmesi yeteneğine sahip değildirAbeling verimliliği bilinmiyor ancak gelecekte bu tür veri eklemek için bekliyoruz. Bu dimerleri mevcut veya değilse söylemek yine de mümkün. Literatürde itibaren% 15 civarında hatta bir etiketleme verimliliği yeterli istatistiksel anlamlılık 32 dimerlerini algılamak için yeterli olduğunu bilinmektedir. Bu özel antikorların biyotinile Fab fragmanları ile, bunların ligand yoluyla diğer zara bağlı reseptörleri çalışma kolaylıkla mümkündür, ya da tarif edilen iki adımlı etiketleme protokolü kullanarak diğer küçük bağlayıcılar 7 ile. Daha önce QDS iki farklı renk (boyutlar) kullanılabilir, ve altın nanoparçacık markalama önceki çalışma 6 kullanılmıştır olduğunu göstermiştir beri, aynı deneyde birden fazla protein türü etiketlemek için uygun görünmektedir. Birden fazla protein türlerinin stoykiyometrisini çalışması için temel zorluk saygı elde edilen göreli stokiyometriye bir normalleşme her iki tür için ya da en azından benzer bir etiketleme verimliliği sağlamaktıretiketleme verimliliği ive. Bununla birlikte, bu çalışmada kullanılan iki farklı QDS (Şekil 2 ve 4) işaretleme verimliliğine çok farklı görünmemektedir. QDS iki aşamalı etiketleme ve bağlaşık floresan mikroskobu ve ESEM-STEM kapsayan anlatılan yöntem bütün hücrelerin sağlam plazma zarlarında membran proteinlerinin karmaşık etkileşimi incelemek için uygulanabilir bir yöntem sunar.

Yeni bir yaklaşım STEM 1-3 veya bağlaşık floresan mikroskobu kullanarak ve 4-7 STEM sıvı halde etiketlenmiş proteinler ile görüntü tüm hücrelere, son zamanlarda tanıtıldı. Bu metodoloji, zar proteinleri ve bütün hücrelerin dokunulmamış plazma membranlarında tek bir molekül düzeyde stokiyometri de dahil olmak üzere protein kompleksleri uzamsal dağılımını incelemek yeteneğine sahiptir. Burada, bir floresan kuantum noktaları (QDS) reseptör proteinlerinin iki aşamalı bir özel etiketleme içeren protokol 8 ve bağlaşık ışık mikroskopisi ve ESEM sap tarif eder. Örnek olarak, EGFR, protein kinaz süper ailesine ait olan bir zar proteini incelenmiştir. Ligand bağlanma üzerine, alıcı aktive eder ve daha sonra başka bir aktive edilmiş EGFR ile birlikte bir dimer meydana getirir; daha sonra sinyal kaskadı hücre çoğalmasını 9 hareket ettirir. Anormal EGFR ekspresyonu veya aktivitesine yol açan mutasyonlar kanser 10 birçok çeşit merkezi bir rol oynamaktadır. Okuyorg Bütün hücrelerde bu membran reseptörü mekansal düzenleme işlevi ve 11-14 bunların olası değişikliklerle ilgili önemli bağlam bilgi sağlar. Ama doğrudan biochemical- veya geleneksel mikroskop yöntemleriyle 15 ile (alt) hücresel seviyede EGFR monomerlerin, dimerlerin ve kümelerin dağılımını araştırmak için zorlu kalır. Önerilen yöntem, bir kompleks içinde proteinlerin yer tespit edilebilir şekilde birkaç nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip EGFR görselleştirme yeteneğine sahiptir. Daha da önemlisi, stoikiometrik dağılımı hakkında bilgi elde edilen sağlam hücre proteinin nativ durum ile de ilgilidir. Etiket ve reseptörü arasında kısa bir mesafe elde etmek için, EGFR doğrudan QD bir biyotin-streptavidin bağı ile, ligandı EGF ile etiketlenmiştir. Bu etiket Floresan-ve elektron mikroskopi ile her iki tespit edilebilir. Biz COS7 hücrelerinin bağıntılı görüntülemede bu etiketi kullanmışmikroakışkan bölme daha önceden 1,16,17 içine sıvı. Ancak, QD başına molekülleri streptavidin katları nedeniyle, bu etiketin düşük etiketleme verimliliği ya da oldukça pahalı deneylere lider, reseptör kümeleme neden olabilir ve bu soruşturma kapsamında protein stokiyometri sonucuna varılması mümkün değildir. Etiket uyarılmış reseptör kümelenme olan tek streptavidin kuantum dot (STR-QD) bağlanmış olduğu, biyotinile edilmiş EGF içeren bir prob ile sonuçlanan, burada sunulan iki adımlı etiketleme prosedürü kullanılarak tamamen önlenebilir. Hücreler ilk olarak biyotinile EGF ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra sabitlenir. Sabitleme aşaması protein işlemleri (tespitin hızına bağlı olarak) durduğu zaman noktasını belirler. STR-QD etiketleme protokolünün ikinci adımında, bundan sonra uygulanır. Proteinler sabit kez proteinlerin dinamik membran hareketi engellenmiş olduğundan Kümelenme yer almaz. Ayrıca, STR-QD çözeltisi, ki buDeneyin en pahalı bileşeni, optimize edilmiş bir düşük konsantrasyonda uygulanabilir ve etiketleme bu ikinci aşama, yani, QD birkaç dakika bağlanmış olabilir, zaman önemli değildir. Bütün hücrelerde dağıtılmış olarak EGFR stokiyometri incelemek için, hücre örnekleri, silikon mikroçip 18 ile hazırlanmıştır. Iki aşamalı bir QD etiketleme ve floresan mikroskobu görüntü kayıt uygulandıktan sonra, hücreler, saf su ile durulanmış ve ESEM-STEM 19 ile hidratlanmış halde görüntüsü alınmıştır. Elde edilen bağıntılı görüntüler hidratlı hücrelerin doğal bağlamında hücresel EGFR dağılımı ve stokiyometri hakkında bilgi verir. Benzer bir yöntem Yeni bir çalışmada 7 göğüs kanseri hücrelerinin HER2 proteini incelemek için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>AF6000 + DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESEM</td>
			<td>FEI Company</td>
			<td>Quanta 400 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x) - Calcium chloride - Magnesium chlorid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstripper</td>
			<td>Mediatech, Inc.</td>
			<td>25-056 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, chromasolv Plus for HPLC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34877-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1058.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Rotisolv HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P076.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>O163.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7041-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T873.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shoul</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>E3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium teraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9640-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 655 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10121MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qdot 800 streptavidin conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Q10173MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon microchips with silicon nitride membranes</td>
			<td>DENS Solutions</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>of 50 nm thickness and dimensions of 50 &#181;m x 0.40 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the stoichiometry of epidermal growth factor receptor in intact cells using correlative microscopy

Bu protokol, COS7 fibroblast hücreleri üzerinde epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), ve daha sonra bağıntılı, flüoresans mikroskopisi ve hidre edilmiş halde, tüm hücrelerin taramalı elektron mikroskopisi (ESEM) etiketleme tarif eder. Floresan kuantum noktaları (QDS) reseptörünün bir etiket ile indüklenen kümeleme kaçınarak, etkin ve spesifik protein etiketleme sağlayan iki aşamalı bir etiketleme protokolü üzerinden EGFR birleştirilmiştir. Floresan mikroskopi EGFR hücre yerle genel görüntüsünü sağladı. Taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM) dedektörü nano çözünürlükte QD etiketleri tespit etmek için kullanılmıştır. Elde edilen bağıntılı görüntüleri hidratlı bozulmamış hücrenin doğal bağlamında tek moleküler düzeyde hücresel EGFR dağıtımı ve stokiyometri veri sağlar. ESEM-KÖK görüntüleri reseptör homodimer olarak, monomer olarak mevcut olabilir ve küçük kümelerde ortaya koymuştur. İki farklı QDS Etiketleme,yani, bir 655 nm yayan ve 800 benzer karakteristik sonuçlar ortaya koydu.

Şekil 1 ve 2 sağlam, tamamen hidratlanmış COS-7 hücrelerine görüntülenmiştir QD655 etiketli zara-bağlı EGFR temsili görüntüleri gösterir. Şekil 1 a DIC görüntü hücrelerinin zar topografya bir izlenim verir ve Şekil 1b karşılık gelen floresan görüntü EGF-Biyotin inkübasyon. Şekil 1A 3 dakika sonra EGFR dağılımını göstermektedir ve B her ikisinden birleştirilir 40X hava amacı ile kaydedilen görüntüler. EGF aktif EGFR, tüm hücre yüzeyi üzerine dağıtılır. En hücrelerinde floresan (Şekil 1B) hafif bir geliştirme EGFR 20 bir lokal artış meydana gelmesini gösteren hücre kenarlarında görülebilir. Benzer bir protokol kullanılarak gerçekleştirilir kontrol deneyleri (veriler gösterilmemiştir) belirli bir EGFR etiketleme sunmaktadır. Bu kontroller şunlardır: ce önceki inkübasyon olmadan 1) kontrol etiketlemeolmayan biyotinlenmiş EGF ve STR-QDS EGF-biyotin, yani, STR-QDS sadece inkübasyon ve 2) bir inkübasyon lls. Dikdörtgenler ile işaretlenmiş üç hücre daha ESEM-KÖK ile incelenmiştir. Şekil 1C tasvir ESEM-STEM görüntüleri - E bu hücrelerin düşük büyütme bakışlar göstermektedir. Bu iletim görüntüsü silisyum nitrür (SİN) görüntüleme penceresi ile bir silikon mikroçip yerleştirilen hücre üzerinde bulunan ince bir su tabakası ile hidratlanmış halde bütün hücreler göstermektedir. Mikroskop su buharının vakum bölmesi ve numune sıcaklığı ve basıncı arasındaki denge hücreleri üzerinde sıvının bir ince tabaka sağlayacak şekilde ayarlandı. Bireysel hücreleri kolayca SıN zar penceresinde şekil ve konum nedeniyle kabul edilebilir. Düşük büyütme ESEM-STEM görüntüleri komşu hücrelere doğru hücre kenarından uzanan, örneğin filopodia gibi ince yapılar, ortaya, ve bazı yapılarince hücre bölgelerin içinde. Numune boyunca iletim kullanılan enerji (30 keV) elektron mümkün değildir, çünkü çekirdeği içeren Kalın merkezi hücresel bölgelerde beyaz görünür. Yüksek çözünürlüklü ESEM-STEM görüntüleri ince periferal bölgelerde kaydedildi. Ince bir sıvı tabaka içinde hücreler, ince bölgelerde nanoparçacıkların ESEM-KÖK için uzamsal çözünürlük 3 nm miktar için bir önceki çalışmada 6 tespit edilmiştir. Şekil 2A gösterilen dört yüksek çözünürlüklü görüntüler - D Şekil 1C küçük dikdörtgenler yerlerde kaydedildi - E. büyütme parlak, mermi şeklindeki çubuklar görünen bireysel QDS, ayırt etmek için yeterli olduğunu kullanılmış, her bir bireye bağlı EGFR. QD655 6 x 14 nm 2 tipik boyutlara sahiptir. Dikdörtgen alana karşılık gelen Şekil 2A, (fig hücre belirtilen1C yeniden) bir zar üzerinde QD etiketleri görüntü kapısı çaprazdan kat gösterir. Bu membran yapısı çevreleyen zar bölgelerden daha yüksek EGFR yoğunluğuna sahiptir. Çeşitli yerlerde, iki etiket yakın idi. 20 ve 24 nm mesafelerde iki örnek ok uçları ile gösterilir. Etiket Bu çiftleri EGFR dimerleri ait olarak yorumlanır. Şekil 2B, bir hücre (Şekil 1D, sol dikdörtgen) kenarından bir örnek verir EGFR monomerler ve dimerler da görülebilir. Şekil 2C (Şekil 1C, sağ dikdörtgen) bir düşük değerli floresan sinyali, örneğin, düşük değerli EGFR yoğunluğu olan bir bölgenin kaydedilmiştir. Bununla birlikte, EGFR ayrıca dimerler burada bulunmuştur. Buna ek olarak, 10 ya da 11 düzeyde EGFR olarak iki öbek mevcuttu elipse (bakınız). Şekil 2B birçok monomer ilave olarak, 5-6 düzeyde EGFR içeren küçük kümelere sahip bir membran kat (Şekil 1E) bir başka örneğini göstermektedirve dimerler. Şekil 2&#39;de tüm etiket pozisyonları için tespit edilmiştir, bu veriler, bir çift bağıntı fonksiyonu 21 g (x) &#39;den elde edilebilir bilgilerin tür bir örnek olarak,. Bu analiz, bu protokol bir parçası değildir ve işlem tarif etmektedir Not Başka bir yerde 6,7. g (x), bir referans parçacıktan belli bir radyal mesafesi x içinde bulunabilir bir parçacığın şansı bir ölçüsüdür. g (x) = 1 rasgele dağılım gösteren ve büyük bir değer kümeleme için kanıtıdır. 210 etiket toplam pozisyonları otomatik Şekil 2A-D, dört görüntülerde tespit edilmiştir, g (x) 5 nm&#39;lik bir boyut ve bin 10 nm&#39;lik bir bant genişliğine sahip bir düzeltme filtre kullanılarak hesaplandı. G (x) eğrisi (Şekil 3) 25 nm&#39;lik bir tercih edilen merkez-merkez QD mesafeyi gösterir. EGFR böylece rastgele odaklı ancak bunların önemli bir kısmının bu tercih mesafede ikamet değildir. Bir approximat itibarene moleküler bir modeli, 6 (Şekil 3 ek), biz QD ve EGF bağlama cebi arasındaki merkezden merkeze mesafe anlamına geldiği tahmin etmek ~ bir EGFR dimer bağlı iki QDS arasındaki 14 nm ve merkezden-merkeze mesafe ~ 27 nm (bu değer nedeniyle bağlayıcı esnekliği birkaç nanometre göre farklılık muhtemeldir) olacak. Tercih etiket mesafesi yönteminin hassasiyeti içinde EGFR dimeri için beklenen etiket mesafe ile böylece tutarlıdır. G (x) eğrisi verileri ile tutarlı kümeleri olduğunu belirten, en fazla 300 nm mesafe için birden daha büyüktür. Bu analiz EGFR stokiyometri bizim yöntemi ile çalışıldı edilebileceğini göstermektedir. Şekil 4, markalama EGF-QD800 ile gerçekleştirildi ve 63X yağa batırılmış objektif floresan görüntü için kullanılması haricinde, Şekil 2&#39;de olduğu gibi benzer bir sonuç görülmektedir. Bu veriler, bu tipik sonuçları ne zaman bulunur teyitEGFR markalama yakınındaki tayfta yayan QDS, ile yapılır. Şekil 4A, bir temsili hücrenin floresan görüntü, Şekil 4B ESEM-KÖK genel modunda aynı hücre gösterir ve Şekil 4C kaydedilen 150,000 x büyütme görüntü, bir hücrenin üst zarı sınırında (Şekil 4B&#39;de dikdörtgen bakınız). 2A ve D Şekil benzer görüntüler bir membran kat üzerinde QD etiketli EGFR yakalamak ve monomerik, dimerik ve kümelenmiş reseptörleri gösterir. Elektron yoğun QD çekirdek ~ 5 nm onların küçük çekirdek büyüklüğü 22 ile tutarlı 655 nm&#39;de yayan QDS çekirdek biraz daha küçük ve yuvarlak, göründüğünü unutmayın. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> Şekil 1. Korelatif DIC, EGF-QD655 floresansı ve ESEM-KÖK tamamen hidratlanmış COS-7 hücreleri üzerinde EGFR etiketli </stRong&gt;., plazma zarının topografik izlenimi veren SiN membran pencere alanının üzerine yetiştirilen hücreler, bir (A) DIC görüntüsü. Merkezi bir konumda bulunan SİN zar penceresinde hücreleri gösteren (B) Floresan görüntü (kesik dikdörtgen ile işaretli). (C - E) A ve B dikdörtgen ile işaretlenmiş hücrelerin üç ESEM-STEM düşük büyütme görüntüleri. Bu hücre genel bakış görüntüleri sonradan kaydedilen yüksek çözünürlüklü görüntülerin kesin yerini belirlemek için hizmet vermektedir. (Şekil 2A-D gösterilmiştir), dört yüksek çözünürlüklü görüntüleri yeri beyaz dikdörtgen ile işaretlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <strong&gt; Şekil 2. Yüksek çözünürlüklü ESEM-STEM görüntüleri membrana bağlı EGFR tasvir. Şekil 1B işaretli alanın 75,000X büyütme (A) Mikrografik. Birçok monomerler görebilir. Birkaç dimerleri ok uçları ile gösterilir. (B) ve sol 50,000X büyütme edinilen (C) görüntüleri, sırasıyla sağ membran alanları Şekil 1C işaretli. Düzeyde EGFR kümeleri özetlenmiştir. Şekil 1D işaretlenmiş yerde 50,000X büyütme ile kaydedilmiş (D) görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> Radyal mesafenin fonksiyonu olarak Şekil 3. Pair korelasyon fonksiyonu g (x) arası partiküller için belirlenen x<html> Şekil 2A-D tespit 210 etiket cle mesafeler. merkez-merkez QD mesafesi ag (x) = 1 rastgele şans gösterir, burada, rasgele daha ortaya çıkan çok daha yüksek bir şansa sahip olduğunu gösterir nm 25 ° C sıcaklıkta yoğun. Kesikli çizgi rasgele dağılım göz temsil eden g (x) için bir rehber niteliğindedir. Içerlek bağlanmış EGF ve biotin ile bağlanmış streptavidin kaplı QDS ile EGFR dimerinin bir yaklaşık moleküler modelini göstermektedir. Streptavidinin modelleri, EGF ve EGFR 1stp (streptavidin), 1EGF (EGF) CPK modelleri elde edilmiştir, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO ve 2GS6 (EGFR) Jmol Version tarafından oluşturulan RCSB Protein Protein Databank, yapıların 12.2.15. RCSB Ligand Explorer Sürüm 1.0 çizilmiş biotin modelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Örnek teşkil COS-7 hücre EGF-QD800 ile etiketlenmiş ve karşılıklı floresan ve ESEM-KÖK ile görüntülenmiş. (A) Floresans görüntüsü, (B), düşük büyütme genel ESEM-STEM görüntüsü. (C) 150,000X büyütme b dikdörtgenin yerde kaydedilen yüksek çözünürlüklü görüntü. Monomerik, dimerik ve kümelenmiş EGFR EGF-QD655 ile etiketleme benzer algılanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy at JoVE.com

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

studying-stoichiometry-epidermal-growth-factor-receptor-intact-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Görüntüleme.  INM-Leibniz Institute for New Materials. This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level. 

Video: Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Biyomühendislik

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Lifli iskelelerinin içine Microspheres ibra Elektroeğirme Büyüme Faktörü

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Heparin Binding Domain osteojenik Büyüme Faktörü Teslim polielektrolit Kompleksi

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

Sinir Büyümesi Faktörü Kapsüllemesi için Yeni HDL&#39;yi taklit eden Nanopartiküllerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Korelatif Mikroskopisi kullanılarak sağlam hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Alıcısının stokiyometrisinden incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler