ونود أن نشكر ترينت وو للحصول على المساعدة الفنية له. علينا أيضا أن نعترف قسم طب الأطفال في مستشفى الأطفال المرضى وعلاج الخلقي ضمور العضلات (CMD) للحصول على التمويل السخي لهذا المشروع.

1. إعداد لوحات أجار حقن (الوقت: 45 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي 2٪ إلى 3٪ الاغاروز في وسائل الإعلام E3 والسماح حل لتبرد قليلا على مقاعد البدلاء. ملاحظة: عدد من لوحات حقن يجري إعداد يملي كمية الاغاروز المطلوبة. كل لوحة حقن تحتاج حوالي 35 مل من محلول الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغليان، والسماح للالاغاروز لتبرد حتى يتم التوصل إلى درجة الحرارة المطلوبة (على سبيل المثال، 45 ° C) حسب تعليمات الشركة المصنعة للحقن القالب و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حوالي 35 مل من تبريد الاغاروز في صحن 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع واحدة من نهاية يفضل حقن القالب إلى الحل، ثم وضع ما تبقى من العفن على حل الاغاروز (وهذا سوف يساعد على التقليل من حدوث فقاعات الهواء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل الاغاروز ليصلب إما في RT أو 4 درجات مئوية لمدة حوالي 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة لفصل واحدة من نهاية العفن من الاغاروز صلبة. إزالة ببطء ما تبقى من م<html> قديم. </li></ol> 2. إعداد ايفانز الأزرق صبغ (EBD) حقن مزيج (الوقت: 30 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الأسهم 1٪ من EBD في حل 1X رينغر (155 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 2 ملي نا 2 هبو 4 و 10 ملي HEPES و 10 ملي الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.2)، والتي يمكن تخزينها في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل الأسهم من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -dextran MW 10000 كيلو دالتون في 25 ملغ / مل في حل 1X قارع الأجراس وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حقن مزيج من قبل تمييع EBD إلى 0.1٪ بشكل مباشر في حل سهم من الأسهم FITC-ديكستران (أي لحجم العمل النهائي من 100 ميكرولتر: مزيج 10 ميكرولتر من 1٪ EBD في 90 ميكرولتر من الأسهم ديكستران FITC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما مزيج حقن دوامة (يجب أن يتحول إلى اللون الأخضر) والابتعاد عن الضوء المباشر عن طريق لف حقن مزيج أنبوب في رقائق الألومنيوم. </li></ol> 3. EBD حقن إعداد (الوقت: حوالي 30 دقيقة) والأنف والحنجرة &quot;&gt; ملاحظة: بروتوكول يعمل بشكل أفضل مع يرقات 3-7 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة حقن ما قبل الحارة لRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز الحقن عن طريق ترتيب micromanipulator على لوحة معدنية والوقوف بجانب المجهر المستخدمة للحقن. بدوره على الهواء مدفوعة تحكم microinjection. ملاحظة: إن نظام حقن فضل تختلف من مختبر ويجب أن لا تتغير نتيجة التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى ملء حقن إبرة مع ما يقرب من 2-4 ميكرولتر من EBD المزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة حجم الحقن إلى ما يقرب من 5 NL من EBD المزيج. ملاحظة: سوف حقن حجم المعايرة يعتمد على طريقة المعايرة. A حقن مكبس مدفوعة يمكن تعيين مباشرة إلى وحدة تخزين حقنة تعطى عن طريق الحقن في حين ضغط الغاز ستحتاج حجم الحقن معايرة عبر حجم بلعة مع استخدام ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة حقن الرطب مع حل 1X قارع الأجراس وإزالة الزائدة من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل علاج اليرقات مع 0.04٪ إيثيل 3-أمينوبنزوات methanesulfonate ش.م.لر (تريكين) المخفف في حل 1X رينغر لشل حركة اليرقات قبل بدء الحقن. ملاحظة: ضمان اليرقات هي immotile تماما لا يقل أهمية عن حقن الصحيح هو صعب مع أي حركة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقات مخدرة في الآبار لوحات حقن أجار باستخدام ماصة الزجاج. تأكد من أن اليرقات تماما داخل البئر والكذب على جانبهم. ملاحظة: عدد يرقات لكل بئر هو ما يصل الى المجرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم وضع اليرقات في الآبار، وإزالة الزائدة حل رينغر للحد من حركة اليرقات داخل البئر. ترك المبلغ المتبقي من الحل بحيث اليرقات لا يذوى. </li></ol> 4. حقن بيريكارديال من اسماك الزرد اليرقات مع EBD (الوقت: تعتمد على عدد من اليرقات عن طريق الحقن، ويقدر 03/01 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الحقن التي تحتوي على يرقات على نطاق تشريح حيث سيتم إجراء الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع إبرة الحقن التي تحتوي على ماصةوEBD خلط أكثر من اليرقات الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة وضع لوحة حقن عن طريق تناوب عليه حتى إبرة الحقن بالقرب من القلب اليرقات وحوالي 45 درجة من الناحية البطنية من المحور الأمامي الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة حقن في الوريد الكاردينال المشتركة (لجنة تنسيق المفردات) في منطقة الوريد في الجزء الأمامي من صفار حيث الوريد وانتقل في البداية في الاتجاه الظهري (الشكل 1). ملاحظة: التكبير حتى 40X من قد يكون من المفيد أن نرى بوضوح لجنة تنسيق المفردات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 5 NL من EBD مزيج والحفاظ على حقن إبرة في المنصب لمدة 5-8 ثانية للحد من التسرب المباشر للEBD المزيج. ملاحظة: سوف حقن الجيد يجب أن يكون صبغ تلوين ينظر في حجرات القلب (الشكل 1). إن لم يكن لوحظ EBD المزيج في القلب، ثم عن طريق الحقن في 5 NL إضافية من EBD المزيج قد تكون كافية لإحداث امتصاص الصبغة. بدلا من ذلك، يمكن التخلص منها الجنين. ملاحظة: في بعض الحالات، قد قلب توقف الضرب. إذا كانت هذه سccurs، مواصلة رصد اليرقات 20-40 ثانية. عادة، والقلب يستأنف الضرب كما يتحرك الصبغة عن طريق الدورة الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى اليرقات وتكرار القادمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجنة المحقونة بنجاح من خلال مراقبة وجود FITC-ديكستران في الأوعية الدموية فورا بعد الحقن (الشكل 2). </li></ol> 5. الحضانة وEBD امتصاص (الوقت: 4-6 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن العدد المرغوب فيه من اليرقات، وضخت عودة اليرقات إلى حل 1X قارع الأجراس دون تريكين في 100 ملم الأطباق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ أطباق ملفوفة في رقائق الألومنيوم. ملاحظة: حفظ اليرقات حقن في الظلام يزيد بشكل كبير معدلات البقاء على قيد الحياة ويضمن أكبر من الاتساق في قوة الإشارة. التفاف في رقائق الألومنيوم أهمية خاصة لفترة من الزمن أن اليرقات خارج الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح اليرقات لاحتضان في 28.5 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة لضمان امتصاص EBD كافية. </li></رأ&gt; 6. تصور EBD في العضلات (الوقت: تعتمد على عدد من الحقن اليرقات ونوع المجهر، ويقدر 0.5-3 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير، تخدير اليرقات مع 0.04٪ تريكين لمنع الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة اليرقات تحت مضان أحمر لتحديد ما إذا EBD امتصاص يحدث في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+(DMD)+for+the+pediatricians+in+the+community.">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li><li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+into+prominence:+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies).">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li><li>Lancet, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , 381-845 (2013).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein.">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li><li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+muscular+dystrophies.">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li><li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma.">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li><li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue:+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle.">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish.">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li><li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus.">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li><li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li><li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy.">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral.">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li><li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .</li><li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations.">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li><li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays.">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin.">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores.">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li><li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice.">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li><li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة أو الصراعات الأخرى ذات الاهتمام.

الزرد آخذة في الظهور بوصفه أداة قوية لدراسة 2،29 الأمراض العصبية والعضلية. حتى الآن، تم استخدام نظام الزرد للتحقق من صحة العضلات جديدة المسببة للأمراض الطفرات 16،17،30، توضيح pathomechanisms رواية 18، وتحديد العقاقير العلاجية جديدة محتملة 12،24. وقد أنشأت هذه الجهود الجماعية للفائدة الزرد لنموذج الأمراض العصبية والعضلية الإنسان. ومع ذلك، على الرغم من التقدم المحرز مع نماذج الزرد والثدييات، وهناك خيارات العلاج محدودة للمرضى داخل مجموعة واسعة من الحالات العصبية والعضلية. وبالتالي، وجود ارتفاع الطلب على تطوير علاج لهذه المجموعة من الأمراض المدمرة. في موازاة هذا الطلب على العلاجات غير يقابل ذلك من ضرورة الابتكار التجريبي المستمر، فضلا عن تحليل دقيق للتحقق من نماذج حيوانية جديدة واستراتيجيات علاجية المفترضة. ويستخدم تحليل EBD عادة في نماذج الماوس لالأنسجة الدراسة وتلف الخلايا في الدماغ والقلب والعضلات والهيكل العظمي 27،31. وأبرزها، ويستخدم على نطاق واسع في EBD نماذج الماوس من مختلف الأنواع الفرعية ضمور العضلات لإظهار شدة العضلات عدم الاستقرار الغشاء وتلف 8. استخدام EBD للكشف عن الأضرار غشاء العضلات معلمة داعمة إنشاء التشابه بين النموذج الحيواني للدولة مرض الإنسان 9. قوة EBD في الماوس أدى عدة مختبرات، بما في ذلك منطقتنا، لتطوير وتطبيق EBD لنماذج الزرد من الأمراض العصبية والعضلية. نظرا لانطباق تحليل EBD، بنشاط يجري تنفيذها هذه التقنية لإثبات نماذج الزرد إلى حالة مرض الإنسان 11،15،22،24،32. واليرقات مع أغشية العضلات التالفة يكون EBD امتصاص وبالتالي مضان أحمر داخل الألياف العضلية. مضان لوحظ في الفضاء بين الألياف، ولكن ليس ضمن ألياف العضلات الفردية قد تكون أيضا مفيدة من الألياف فصل من الغشاء القاعدي في تيكان غياب الضرر الغشاء، وتوفير التفاصيل التشخيص مفيدة. تحليل EBD لديه إمكانية تطبيق ما بعد التحقق من صحة النموذج الحيواني. وقد أظهرت الجهود من مختبرنا مؤخرا أن تحليل EBD هو مفيد في التحقق من صحة الأدوية العلاجية قد تكون رواية 24. تحديد ما إذا كانت العلاجات المحتملة تقلل أو تلغي EBD امتصاص في نماذج الأمراض العصبية والعضلية يمكن أن تدل على العمل العلاجي المناسب 8. هذا النوع من التحليل يمكن أن تساعد في إنشاء آلية (ق) من العلاجات ويوسع تطبيق تحليل EBD. كما هو الحال مع العديد من التقنيات، وتحليل EBD لديه العديد من المحاذير التي يجب مراعاتها أثناء التصميم والممارسة التجريبية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون تحديا لتحديد لجنة تنسيق المفردات نظرا لسماكة الأنسجة مع التقدم في السن. بالإضافة إلى ذلك، فمن السهل أن تتلف اليرقات في إعداد قبل وأثناء الحقن التامور، والحد من التهم التجريبية وزيادة الحاجة إلى الإعدادية أعداد كبيرة من اليرقات.وعلاوة على ذلك، يمكن أن الأضرار المادية التي لحقت اليرقات أثناء المناولة والحقن يؤدي إلى ايجابيات كاذبة عن العضلات التالفة يمكن أن يستغرق فترة تصل EBD. من أجل التغلب على بعض هذه العقبات، التي وصفناها استراتيجية الحقن المشترك في هذه المقالة الفيديو التي تسمح سهولة تحديد وموثوق بها اليرقات مع نجاح ضخ صبغة مباشرة بعد الحقن وقبل تحليل لاحقة. ضوابط شارك في حقن FITC-ديكستران لنجاح الحقن عن طريق السماح للتأكيد EBD في الأوعية الدموية قبل امتصاص عن طريق الألياف العضلية. هذا يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص حيث يصبح EBD مضان منتشر بشكل كبير في اليرقات بعد عدة ساعات إذا لم تجمع في الألياف العضلية. على هذا النحو، يمكن أن يكون من الصعب الكشف عنها. وبالإضافة إلى ذلك، في عداد المفقودين لجنة تنسيق المفردات وحقن EBD في صفار البيض أو تجويف الجسم يمكن، بعد الحضانة، يؤدي في مضان أحمر منتشر مماثل للسيطرة على الأجنة، ولكن مع احتمال انخفاض امتصاص الألياف العضلية التالفة. بشكل جماعي، هذه المغارةATS تشير حقن EBD يتطلب الصبر والممارسة من أجل تحقيق نتائج متسقة وموثوق بها. في كل شيء، ونحن تصف طريقة عملية واضحة لإجراء تحليل EBD على يرقات الزرد. حتى الآن، واستخدام الزرد كنظام نموذج، خصوصا كنموذج الأمراض التي تصيب البشر، وقد يتوسع بسرعة. ومن المقرر جزئيا إلى استمرار تطوير وتعديل التقنيات التجريبية التي تعمل على تحسين بناء على المزايا الحالية للنظام الزرد هذا التوسع. توفر تقنية الحقن EBD أداة إضافية وقوية لترسانة الباحث للتحقق من صحة ودراسة نماذج أمراض العضلات الزرد. التنفيذ المستمر وتعديل هذه التقنية لديه القدرة التي تساعد في الكشف استراتيجيات علاجية جديدة وكذلك آليات المسببة للأمراض.

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">FD10S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Evan&#39;s Blue Dye</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">100 mm Petri dish</td>
			<td style="width:173px;">Fischerbrand</td>
			<td style="width:140px;">FB0875712</td>
			<td>Injection mold base</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:321px;">Thin wall glass capillaries</td>
			<td style="width:173px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:140px;">TW100F-4</td>
			<td>For Injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Agarose</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">AGA001</td>
			<td>Injection mold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Microinjection mold</td>
			<td style="width:173px;">Adaptive Science Tools</td>
			<td style="width:140px;">TU-1</td>
			<td>Injection mold</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">SOD001</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Bioshop</td>
			<td style="width:140px;">POC888</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Magnessium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M2670</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S9638</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">HEPES</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H4034</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Glucose</td>
			<td style="width:173px;">BioBasic</td>
			<td style="width:140px;">GB0219</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">C1061</td>
			<td>Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of zebrafish larvae skeletal muscle integrity with evans blue dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

تم حقن حقن مزيج EBD إلى لجنة تنسيق المفردات من المسوخ متماثل sapje والبرية من نوع الأشقاء في 3 DPF. الحقن التي تملأ حجرات القلب (الشكل 1B) ثم تم تحليل للحقن ناجحة من خلال وضع تصور-FITC ديكستران في الأوعية الدموية تحت مخضر (الشكل 2). بعد فترة حضانة 4 ساعة، تم فحص EBD امتصاص على مستوى أجسودي باستخدام المجهر مضان. أظهرت الأشقاء نوع البرية لا مضان EBD في أي ألياف العضلات مرئية (الشكل 3A)، في حين أظهرت المسوخ متماثل sapje EBD امتصاص، مشيرا إلى الأضرار التي لحقت غشاء العضلات 15 (الشكل 3B). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> الشكل 1. حقن EBD حقن المزيج في الوريد الكاردينال المشتركة (لجنة تنسيق المفردات) لامبري الزردس. (A) Uninjected الجنين. السهم يدل على المكان المثالي لحقن CCV. (B) حقن الناجح إلى لجنة تنسيق المفردات. الصبغة يدخل حجرات القلب (السهم) ويبدأ في ضخ من خلال الأوعية الدموية. (C) وحقنة CCV ناجحة تؤدي في بعض أو كل الصبغة دخول الكيس المحي من الجنين (السهم). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> الشكل 2. الأجنة يمكن فرز للحقن ناجحة من خلال مراقبة توزيع FITC ديكستران تحت مخضر في جميع أنحاء الأوعية الدموية بعد الحقن وقبل EBD امتصاص فورا.الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> الرقم 3: سوف تتخذ EBD بنسبة الألياف مع الأغشية التالفة الأشقاء (A) Wildtype تظهر أي مضان EBD في الألياف العضلية. (B) Sapje ​​متحولة متماثل مع مضان EBD داخل الألياف العضلية متعددة (السهام). تم حقن جميع اليرقات مع حقن مزيج EBD وتحليلها بعد فترة حضانة 4 ساعة على 3 DPF. تم فرز الأشقاء والمسوخ التي كتبها الألياف العضلية مفرزة قبل حقن CCV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye at JoVE.com

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

analysis-zebrafish-larvae-skeletal-muscle-integrity-with-evans-blue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.0K Views.  The Hospital for Sick Children. In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Video: Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

تطبيق التحفيز المزمن لدراسة التعديلات المظهرية الهيكل العظمى والعضلات الهوس الفئران التي يسببها النشاط

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

أداء العضلات الهيكلية البشرية Xenografts في الفئران نقص المناعة

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

العزلة والتمايز من المقاطع الاساسيه من الماوس الهيكل العظمي العضلات الشرح

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

فحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...