D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

في هذه الدراسة، تم استخدام الكبار (6-8 أسابيع) من الإناث C57BL / 6 الفئران. تم إيواء الفئران ولدت وفقا للمبادئ التوجيهية للالحظيرة جامعة غنت. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة الرعاية والأخلاقيات المؤسسية الحيوان. 1. إعداد الخلايا وحيدة النواة (الشركات المتعددة الجنسيات) من الماوس الطحال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس أسفل الظهر على متن تشريح وتحديد هند واليدين مع دبابيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم سطح الجلد مع 70٪ (المجلد / المجلد) الايثانول / H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد على طول خط الوسط في البطن إلى الصدر وفضح الطحال باستخدام الأدوات الجراحية المعقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التشذيب الأنسجة الدهنية المحيطة بها، ووضع الطحال إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الطحال باستخدام مشرط معقم ونقل القطع إلى تصفية 70 ميكرومتر النايلون وضعها داخل حوض 50 مله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 2 مل حقنة الغطاس، الهريس بلطف قطع الطحال من خلال مصفاة الخلية ويغسل مع 5 مل 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل من Ficoll-Paque إلى أنبوب 15 مل وتراكب المتوسطة الكثافة التدرج مع 5 مل تعليق الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 20 دقيقة في RT دون فرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيني لأنبوب 15 مل الطازجة، إضافة 10 مل الباردة برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 2 مل 1X PBS تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (العازلة FACS). نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب صغير، وتخلط مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ </li></ol> 2. والإثراء، كشف وتنقية خلايا الفأر حبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إثراء الماوس الطحال CD5positive (CD5 +) الخلايا الليمفاوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC، مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا)لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام، ويغسل مع 200 ميكرولتر FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS. إعداد 20 ميكرومتر حل عمل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 1 ميكرولتر منها إلى 10 5 خلايا في المخزن FACS واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على 10 4 خلايا التخصيب قبل على تدفق عداد الكريات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام FCS-H وFCS-W، بوابة إلكترونية على خلايا لو FSC-W لاستبعاد الحلل الخلايا والمجاميع (الشكل 1A). ثم إلكترونيا بوابة الخروج دابي + (القتلى) الخلايا داخل FSC-W لو السكان (الشكل 1B)، وتستخدم SSC-A وFCS-A لتحديد إلكترونيا السكان اللمفاويات حسب الحجم (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا داخل بوابة اللمفاويات، مؤامرة SSC-A مقابل CD5 وإلكترونيا بوابة CD5 + الخلايا الليمفاوية كما هو مبين في الشكل 1D. الحصول على ما تبقى من عينة ما قبل التخصيب على تدفق عداد الكريات. </lI&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط عدد الخلايا إلى 10 7 خلايا في 90 ميكرولتر في المخزن FACS وإضافة 10 ميكرولتر بلي مكافحة CD5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ويغسل مرة واحدة مع 4 مل FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS الباردة. إثراء لCD5 + الخلايا اللمفية باستخدام فصل الخلايا المغناطيسي (MACS) أعمدة وفقا لتوصيات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا) ودابي كما في 2.1.1. الحصول على 10 4 الخلايا الليمفاوية المخصب على قياس التدفق الخلوي والتحقق من أن البوابات الإلكترونية خلقت في 2.1.1. حدد CD5 + الخلايا اللمفية في جزء الخلوي المخصب. الحصول على 10 5 الخلايا على قياس التدفق الخلوي وتحليل نسبة CD5 + الخلايا الليمفاوية الموجودة في جزء المخصب كما هو مبين في الشكل 1E - H. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف وعزل الماوس حبر مLLS بواسطة FACS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend المخصب CD5 + الخلايا الليمفاوية بتركيز حوالي 10 6 خلايا في 20 ميكرولتر في FACS العازلة التي تحتوي على معاداة CD16 / CD32 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) وαGalCer PE-مترافق / CD1d tetramer (1 ميكروغرام / 10 6 خلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الماوس (MABS) المضادة للCD3ε V500 (4 ميكرولتر من 1:20 تخفيف / 10 6 خلايا)، ومكافحة CD19 E450 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) ومكافحة CD8α E450 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) في المخزن FACS، إضافة إلى CD5 + الخلايا الليمفاوية واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل FACS العازلة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend في 4 مل FACS العازلة بتركيز نهائي من 10 7 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 30 ميكرومتر ووضع الخلايا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة قياس التدفق الخلوي للخلية الفرز وفقا لتوصيات الشركة الصانعة 14،15. ملاحظة: معايرة من الكريات تدفق لفرز الخلايا تتطلب التدريب ويمكن أن يقوم بها عامل من ذوي الخبرة، أو فني مدرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من 20 ميكرومتر حل عمل دابي في 10 6 خلايا ويحضن في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على ما يقرب من 10 4 المخصب CD5 + الخلايا الليمفاوية على تدفق عداد الكريات. بوابة إلكترونيا على خلايا لو FSC-W لاستبعاد الحلل الخلايا والمجاميع (الشكل 2A). ثم إلكترونيا بوابة الخروج دابي + CD8 + CD19 + الخلايا (قناة تفريغ) في FSC-W لو السكان (الشكل 2B)، واستخدام SSC-A وFCS-A لتحديد إلكترونيا الخلايا الليمفاوية (الشكل 2C) كما هو موضح في 2.1.1.1 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مؤامرة αGalCer / CD1d tetramer التي كتبها CD3ε وإلكترونيا بوابة αGalCer / CD1dالخلايا tetramer + CD3ε + حبر كما هو مبين في الشكل 2D. الحصول على ما لا يزيد عن 2 × 10 5 CD5 + الخلايا الليمفاوية المخصب لتحديد النسبة المئوية للαGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + حبر خلايا موجودة في جزء الخلوي المخصب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البوابات الإلكترونية التي تم إنشاؤها في 2.2.7. والخلايا FACS الفرز αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + حبر على قياس التدفق الخلوي في 70 رطل باستخدام فوهة 70 ميكرون بمعدل تدفق &#39;1.5&#39;. جمع الخلايا حبر فرزها في أنبوب FACS تحتوي على 1 مل 100٪ FCS. شطف بعد ذلك خلايا حبر مرتبة من جانب أنبوب FACS باستخدام 10 مل RMPI 1640 المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend فرز الخلايا حبر في 1 مل RPMI 1640 متوسطة والحصول على 40 ميكرولتر ذلك على تدفق عداد الكريات لتقييم نقاء من الخلايا حبر فرزها. حدد FSC-W لو دابي - اللمفاوياتالصورة كما هو موضح في 2.2.7. (الشكل 2E - G) وإلكترونيا بوابة αGalCer / CD1d الخلايا tetramer + CD3ε + حبر كما هو مبين في الشكل 2H. </li></ol></li></ol> 3. الثقافة والتوسع في خلايا الفأر حبر اليوم 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع تنقيته مكافحة CD3ε (3 ميكروغرام / مل) لكل بئر لمدة 1 ساعة على RT. يغسل مرتين مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X ومرة ​​واحدة مع 200 ميكرولتر كاملة RPMI 1640 متوسطة (10٪ المجلد / المجلد FCS، 100 U / مل البنسلين، الستربتومايسين، 5.5 ميكرومتر β المركابتويثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد خلايا قابلة للحياة مرتبة حبر (الخطوة 2.2.8) باستخدام 0.4٪ عدادة الكريات كما في 1.11.، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي المؤتلف IL-2 الفئران (10 نانوغرام / مل)، المؤتلف الفئران IL-12 (1 نانوغرام / مل)، وذوبان لمكافحة فأر CD28 (5 ميكروغرام / مل). لوحاتorted خلايا حبر في 10 5 خلايا / جيد في مكافحة CD3ε لوحات المغلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة لمدة 2 أيام. </li></ol> يوم 2 <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى غير المصقول 96 لوحة جيدا مسطحة القاع الطازجة والثقافة الخلايا تحت الظروف يستريح في كامل RPMI 1640 متوسطة عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة لمدة 2 أيام. </li></ol> اليوم 4 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزاحة الخلايا من لوحة طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل الطازجة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي على المؤتلف IL-7 الفئران (5 نانوغرام / مل)، وصفيحة 10 5 خلايا / جيد في flat- القاع 96 لوحة جيدا لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة. </li></ol> اليوم 8 <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا في أنبوب جديد، الطرد المركزي في 300 ×ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي على ذوبان مكافحة CD28 (5 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع تنقيته مكافحة CD3ε (3 ميكروغرام / مل) لكل بئر وغسل كما في 3.1. لوحة 5 10 خلايا / جيد في مكافحة CD3ε لوحات المغلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 حاضنة حتى يوم 11. </li></ol> اليوم 11-18 <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،4-3،6. </li></ol> اليوم 19-20 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل الطازجة، الطرد المركزي في 300 x ج و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في 10 5 خلايا / جيد في 96 لوحة جيدا مسطحة القاع وتسمح للخلايا للراحة لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 قبل استخدامها في تجربة. </li></ol> 4. خلوى الإنتاج عن طريق خلايا حبر ماوس باستخدام CD1d بلاتالفحص محددة ه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع 100 ميكرولتر من الفئران المؤتلف CD1d (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1X) لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات مع 200 ميكرولتر 1X PBS، إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني 1X (حل حجب) لكل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عرقلة الحل، إضافة 200 ميكرولتر من αGalCer (5 نانوغرام / ميكرولتر) لكل بئر، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. [للإعداد الحل αGalCer، إضافة 1085 μ برنامج تلفزيوني 1X إلى 55 ميكروغرام من αGalCer الذائبة في السيارة تحتوي على 96 ملغ / مل السكروز، 10 ملغ / مل deoxycholate الصوديوم و 5 ملغ / مل توين 20]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وتجاهل الحل αGalCer ويغسل جيدا مرتين مع 200 ميكرولتر 1X PBS تليها 200 ميكرولتر كاملة RPMI 1640 متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا في المختبر حبر توسعت في يوم 21، الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend في R الكاملPMI 1640 المتوسطة بتركيز 0.5 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من إعادة تعليق الخلية حبر لكل بئر واحتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف وقياس السيتوكينات من الفائدة عن طريق انزيم مرتبط immunosorbant فحص (ELISA) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells:+development,+specificity,+and+function.">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li><li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells.">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families.">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells.">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li><li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1-restricted+CD4++T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice.">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li><li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides.">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li><li>Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells+in+rheumatic+disease:+a+joint+dilemma.">Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKT+cells+in+immunoregulation+of+tumor+immunity:+a+new+immunoregulatory+axis.">NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis.</a> Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).</li><li>Molling, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity.">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li><li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids.">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li><li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1.">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li><li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection,+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells.">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li><li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li><li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+'real+time'.">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li><li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages.">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي العزلة وإثراء لاحق من CD5 + الخلايا اللمفية (القسم 1 &amp; 2)، FACS الفرز (القسم 3) والطلاء الأولي من خلايا حبر (القسم 4). من الخطوات التي تؤدى في القسم 1، تذكر أن طبقة بعناية تعليق الخلوي الطحال على التدرج الكثافة المتوسطة بحيث ي?...

الفئران القاتل الطبيعي ثابتة T (حبر) الخلايا السكان متميزة من الخلايا الليمفاوية T الفطرية المحدد في الغدة الصعترية من قبل، معربا عن CD1d thymocytes القشرية 1،2. خلايا حبر تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) تتألف من سلسلة ثابتة Vα14-Jα18 TCR يقترن إما Vβ8، Vβ7 أو Vβ2 TCRs 3، التي هي قادرة على الاعتراف الذاتية فضلا عن مستضدات دهن الخارجية في سياق CD1d. على سبيل المثال، الخلايا حبر الفئران تعترف ويتم تفعيلها من قبل يسمى مستضد isoglobotrihexosylceramide الدهون الذاتية (iGb3) 4، وكذلك α-galactosylceramide (αGalCer) 5،6، وشحمي سكري معزولة من الإسفنج البحري. TCR التي تعتمد على تنشيط الخلايا حبر يعزز فتيلة من الاستجابات المناعية التكيفية، ونتيجة لذلك، وقد ثبت خلايا حبر أن تكون المشاركة وظيفيا في تحسين أو تطوير مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك أمراض الروماتيزم 7 وسرطان &lt;سوب&gt; 8. حاليا، الاصطناعية بروابط خلية حبر تشكل المواد المساعدة لقاح جديدة واعدة قد تكون قادرة على تنظيم عدد من الشروط immunopathological. وقد سبق أن ثبت أن الخلايا حبر يمكن أن تتولد في المختبر التالية بمعزل عن الماوس الأنسجة ولكن؛ العديد من هذه الدراسات توظيف واستخدام الخلايا الأولية المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) و / أو خطوط الخلايا 9، Vα14 TCR المعدلة وراثيا (تيراغرام) الفئران 10، أو thymomas لتوليد حبر المشتقة من الخلايا الهجينة 11،12. وعلاوة على ذلك، فإن أعدادا كبيرة من الفئران، كميات كبيرة من المواد الكيميائية مثل dimers CD1d αGalCer تحميلها، والأوقات ثقافة طويلة تجعل بعض البروتوكولات نشرت أقل من الناحية الأخلاقية وجذابة اقتصاديا 9،13. في هذا التقرير وصفنا طريقة تكييفها لعزل والتوسع في المختبر من خلايا حبر من الماوس الطحال. وبشكل أكثر تحديدا، ويصف بروتوكول طريقةلتخصيب خلايا حبر من الطحال الماوس مما يقلل من الفئران والكواشف والوقت اللازم لFACS فرز الخلايا، ويقترح نهجا الأمثل لتوسيع خلايا الطحال حبر فرزها في المختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-2</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-12</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>39-8122-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-7</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0032-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD8&#945; (53-6.7)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>11-0051-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-conjugated anti-mouse CD3&#949; (500A2)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>560771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12633-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-056</td>
			<td>[Ca2+/Mg2+ - free]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00 AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate F-bottom</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>188-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>227-261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

القدرة على إفراز السيتوكينات بسرعة على التحفيز هو السمة الرئيسية للثابتة القاتلة الطبيعية T (حبر) نسب الخلية. لذا تتميز الخلايا حبر باعتبارها فطرية السكان الخلايا التائية قادرة على تفعيل وتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية. تطوير تقنيات محسنة للثقافة والتوسع في خلايا الفئران حبر تسهل دراسة حبر بيولوجيا الخلية في في التجارب المختبرية ونظم نموذج الجسم الحي. نحن هنا وصف إجراء الأمثل لعزل وتوسيع الخلايا حبر الطحال الفئران. تتم إزالة الطحال من C57BL / 6 الفئران، تشريح وتوتر والطبقات تعليق الخلوية الناتجة على وسائل الإعلام التدرج الكثافة. بعد الطرد المركزي، يتم جمع الخلايا وحيدة النواة الطحال (الشركات المتعددة الجنسيات) ويتم إثراء CD5 إيجابية (CD5 +) الخلايا الليمفاوية لاستخدام حبات مغناطيسية. هي ملطخة الخلايا حبر في جزء CD5 + وقت لاحق مع ^5؛ GalCer محملة CD1d tetramer وتنقيته بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). فرز FACS خلايا حبر ثم يتم تربيتها في المختبر في البداية باستخدام مزيج من السيتوكينات الفئران المؤتلف ومتجهة إلى لوحة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) المنبهات قبل أن يتم توسيعها في وجود الفئران IL-7 المؤتلف. باستخدام هذه التقنية، ما يقرب من يمكن أن تتولد 10 8 خلايا حبر داخل 18-20 يوما للثقافة، وبعد ذلك يمكن أن تستخدم لفحوصات وظيفية في المختبر، أو في التجارب المجراة نقل في الفئران.

عزل الخلايا وحيدة النواة الطحال باستخدام التدرج الكثافة يستغرق حوالي 1 ساعة ويلغي استخدام الكواشف اللازمة لليز خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا قابلة للحياة باستخدام هذه الطريقة والحطام ولدت خلال توتير من الجهاز يتم إزالة. ع?...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen at JoVE.com

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

Video: An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

اشتقاق خلايا T<em&gt; في المختبر</em&gt; من الفأر الجنينية الخلايا الجذعية

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...