D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

본 연구에서는 성인 (6-8 주) 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 마우스는 겐트 대학 동식물 사육장의 지침에 따라 보관 및 사육되었다. 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 마우스 비장에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 준비 <ol><li> 자궁 전위에 의해 마우스를 희생. </li><li> 다시 아래로 해부 보드에 마우스를 놓고 핀 뒷다리와 앞다리를 해결. </li><li> 70 %로 피부 표면을 소독 (부피 / 부피) 에탄올 / H 2 O. </li><li> 흉부에 복부​​ 정중선을 따라 피부를 잘라 무균 수술 도구를 사용하여 비장을 노출. </li><li> 주변의 지방 조직을 트리밍 한 후, 실온에서 1 ㎖의 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 24 웰 플레이트에 비장을 배치합니다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여 비장을 해부하고 50 ㎖ 욕조 내에 배치 70 μm의 나일론 필터로 조각을 전송전자. </li><li> 2 ML의 주사기 플런저를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 비장 조각 매쉬와 PBS 1X 5 ㎖로 세척한다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 피콜 - 페이크 3 ㎖를 첨가하고 5 ml의 세포 현탁액과 밀도 구배 매체를 오버레이. </li><li> 브레이크없이 실온에서 20 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 신선한 15 ML 튜브에 계면 이동 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 10 ml의 차가운 1X PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (FACS 완충액)을 함유하는 PBS 1X 2 ml의 세포를 재현 탁. 전사 작은 튜브에 세포 현탁액 10 ㎕를 0.4 %의 10 μL와 혼합 </li></ol> 2. 농축 검색, 마우스 인 iNKT 세포의 정화 <ol><li> 마우스 비장 CD5positive (CD5 +) 림프구의 농축. <ol><li> (선택 사항) 얼룩 10 5 세포 FITC - 복합 안티 CD5 (4 μL 1시 반 희석 / 10 6 세포)어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 200 μL FACS 버퍼 (500)에 재현 탁 외과 버퍼 μL 씻어. 1X PBS로 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 20 μM 용액을 제조 작업, FACS 완충액 μL 이들에 105 세포를 1을 추가 5 분 동안 RT에서 배양한다. 흐름 cytometer에 104 미리 농축 세포를 취득. <ol><li> FCS-H와 FCS-W, 세포는 이중 집계 (그림 1A)를 제외 FSC-W 싸다 세포에 전자 게이트를 사용하여. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + (죽은) FSC-W LO 인구 (그림 1B) 내에서 세포 및 전자적 크기 (그림 1C)에 의해 림프구 인구를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용합니다. </li><li> 림프구 게이트 내의 세포를 사용하여, 대 CD5-SSC 플롯도 1D에 도시 된 바와 같이 전자적으로 게이트 CD5 + 림프구. 사이토 흐름 예비 농축 샘플의 나머지를 획득. </lI&gt; </ol></li><li> FACS 버퍼 90 μL 당 10 7 세포에 세포 수를 조정하고 10 μL 안티 CD5 마이크로 비드를 추가합니다. </li><li> 4 ML의 외과 차가운 외과 버퍼를 버퍼에 resuspend 500 μL로 한 번 씻어 15 분 동안 4 ºC에서 품어. 자기 세포 분리 (MACS)를 사용하여 CD5 + 림프구 제조업체의 권장 사항에 따라 열에 대한 풍부. </li><li> FITC - 복합 안티 CD5와 선택 사항) 얼룩은 10 5 세포 (2.1.1에서와 같이 1시 반 희석 / 10 6 세포) 및 DAPI의 4 μL. 흐름 (10) 4 농축 림프구 세포 계수기 획득하고 전자 게이트 2.1.1에서 만든 확인합니다. 풍부한 세포 부분에서 CD5 + 림프구를 선택합니다. 사이토 흐름에 105 세포를 획득하고도 1E에 도시 한 바와 같이 농축 된 분획에 본 CD5 + 림프구 백분율을 분석 - H를. </li></ol></li><li> 탐지 및 마우스 인 iNKT CE의 분리FACS로 재편. <ol><li> 항 CD16 / CD32을 함유하는 FACS 완충액 약 106 개 셀 (20) 당 μL 및 PE 공역 αGalCer (1시 50분 희석 / 106 세포의 4 μL)의 농도로 농축 CD5 + 림프구를 재현 탁 / CD1d 테트라 머 (1 μg의 / 10 6 세포). </li><li> 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 의 마우스 항체 (단클론 항체) 항 CD3ε V500 (1시 20분 희석의 4 μL / 10 6 세포), 항 CD19의 E450 (1시 50분 희석의 4 μL / 10 6 세포) 및 안티 CD8α의 E450 (4 μl를 희석 FACS 완충액 1:50 희석 / 106 개 세포), CD5 + 림프구에 추가하고 어두운 곳에서 39 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 107 세포 / ml의 최종 농도 4 ㎖의 FACS 완충액을 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 재현 탁하고 원심 분리하여 1 ML의 FACS 완충액으로 세포를 세척 하였다. </li><li> 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 및 얼음에 세포를 배치합니다. </li><li> 제조업체의 권장 사항 14, 15에 따라 정렬 셀 흐름 cytometer를 보정합니다. 주 : 셀 정렬하기위한 플로우 사이토 교정 훈련을 필요로하고 숙련 된 오퍼레이터, 또는 숙련 된 기술자에 의해 수행 될 수있다. </li><li> 10 6 세포 당 DAPI의 20 μm의 작업 용액 10 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. 흐름 cytometer에 약 10 4 농축 CD5 + 림프구를 취득. FSC-W 싸다 세포에 대한 전자적 게이트 세포는 이중 집계 (그림 2A)를 제외합니다. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + CD8 + FSC-W LO 인구 (그림 2B) 내에서 CD19 + 세포 (덤프 채널) 및 2.1.1.1에 기술 된 바와 같이 전자 림프구 (그림 2C)를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용 . <ol><li> CD3ε 및 전자 게이트 αGalCer / CD1d에 의해 플롯 αGalCer / CD1d 테트라도 2D에 도시 된 바와 같이 테트라 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 풍부한 세포 부분에 존재하는 비율 αGalCer를 결정하기 위해 더 이상 5 10 × 2보다 CD5 + 풍부한 림프구를 취득 / CD1d 테트라 + CD3ε +하여 iNKT 세포. </li></ol></li><li> 2.2.7에서 작성한 전자 게이트를 사용. &#39;1.5&#39;의 유량으로 70 ㎛의 노즐을 이용하여 70 psi에서 사이토 흐름, FACS 분류 αGalCer / CD1d 테트라 머 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 1 ml의 100 % FCS를 함유하는 FACS 튜브 정렬하여 iNKT 세포를 수집한다. 이어서 10 ㎖ RMPI 1640 배지 원심 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 이용한 FACS 튜브의 측면에서 분류하여 iNKT 세포를 헹군다. </li><li> 재현 탁은 RPMI 1640 배지 1 ㎖에 인 iNKT 세포를 분류하고 정렬하여 iNKT 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포에 이의 40 μL를 획득. 림프구 - FSC-W LO DAPI를 선택S 2.2.7에 기술 된 바와 같이. 전자 및 게이트 αGalCer / 그림 하반기 같이 CD1d 사량 + CD3ε +하여 iNKT 세포 - (G 그림 2E). </li></ol></li></ol> 3. 문화와 마우스 인 iNKT 세포의 확장 날 0 <ol><li> 코트 실온에서 1 시간 동안 잘 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트. 200 μL PBS 1X 한 번 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 (10 % 부피 /의 부피 FCS, 100 U / ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 5.5 μm의 β - 머 캅토 에탄올)와 함께 두 번 씻으십시오. </li><li> 1.11에서 0.4 % 혈구를 이용 가능한 정렬하여 iNKT 세포 (단계 2.2.8)의 개수를 카운트. 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고 재현 탁 재조합 쥣과 IL-2 (10 NG / ㎖), 뮤린 재조합 IL-12 (1 NG / ㎖) 및 항 - 마우스 가용성 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유. 플레이트의안티 CD3ε 코팅 된 플레이트 웰에서 105 세포 /로하여 iNKT 세포 orted 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li></ol> 2 일 <ol start="3"><li> 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 완전 RPMI 1640 배지에서 신선한 무지 평저 96 웰 배양 접시에 휴식 조건 하에서 세포를 세포를 옮긴다. </li></ol> 4 일 <ol start="4"><li> 부드러운 피펫 팅에 의해 판에서 셀을 제거하고 새로운 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 플랫 -에 105 세포 / 웰로 4 ℃, 재조합 쥣과 IL-7 (5 NG / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고, 플레이트에서 10 분 동안 300 XG에 원심 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 4 일 동안 96 웰 플레이트를 바닥. </li></ol> 8 일 <ol start="5"><li> 300 X에서 새로운 튜브에 세포를 수집, 원심 분리기수용성 항 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml에서 10 ℃에서 4 분, 재현 탁 대 g. </li><li> 코트는 물론 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트와는 3.1로 씻는다. (10) 5 세포 / 웰의 안티 CD3ε 코팅 플레이트와 하루 11까지 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 품어. </li></ol> 일 11-18 <ol start="7"><li> 반복 3.4-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 하루 19 ~ 20 <ol start="8"><li> 완전한 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고 300 XG에서 신선한 15ml의 튜브, 원심 분리기에 세포를 옮긴다. </li><li> 플레이트 105 세포에서 세포 / 웰 평저 96 웰 플레이트 허용 세포 실험에 사용하기 전에 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 일 동안 휴식한다. </li></ol> 4. 사이토 카인 생산 CD1d 플랫을 사용하여 마우스 인 iNKT 세포에 의해전자 결합 분석 <ol><li> 코트 평평한 바닥 96 웰 아니라 당 재조합 쥐 CD1d 100 ㎕ (1X PBS에서 10 ㎍ / ㎖)와 플레이트는 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> , PBS 1X 200 μL로 4 회 씻어 잘 당 1X PBS (차단 솔루션)에 2 % FCS 200 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어. </li><li> 블로킹 용액을 제거 αGalCer 웰 당 200 μL의 (5 NG / μL)을 추가하고, 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양. [αGalCer 용액의 조제를 들어, 차량이 96 ㎎ / ㎖ 자당, 10 ㎎ / ㎖ 나트륨 데 옥시 콜레이트, 5 ㎎ / ㎖ 트윈 20을 포함에 용해 αGalCer 55 μg의에 1,085 μ 1X PBS를 추가]. </li><li> 배양 후, αGalCer 솔루션을 무시하고 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 다음 PBS 1X 200 μL로 잘 두 번 씻는다. </li><li> 전체 R에 원심 분리기 세포 300 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 재현 탁하고, 21 일에 체외 확장하여 iNKT 세포를 수집0.5 × 106 세포 / ml의 농도로 PMI 1640 배지. </li><li> 물론 당하여 iNKT 세포의 재 부유 200 μl를 추가하고 CO 2 배양기에서 37 ℃에서 72 시간 동안 배양한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 효소 연결 immunosorbant 분석 (ELISA)에 의해 관심의 상층 액과 측정 사이토 카인을 수집합니다. </li></ol>

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</ol>

The authors have no competing interests to disclose.

현재 프로토콜의 중요한 단계는 분리 및 CD5 + 림프구 (제 1 &amp; 2)의 후속 농축, FACS 정렬 (섹션 3)하여 iNKT 세포의 초기 도금 (4 절)를 포함한다. 섹션 1에서 수행 된 단계 신중 별개 셀룰러 상간 원심 다음 생성되도록 밀도 구배 매질을 통해 비장 세포 현탁액을 층에 기억한다. 자기 세포 분리 (제 2 항)에 의해 CD5 + 림프구의 후속 농축은 얼룩에 필요한 시약 및 시간을 최소화 및 증가하...

쥐 불변 자연 살해 T (인 iNKT) 세포는 CD1d 발현 대뇌 피질의 흉선 세포 1, 2에 의해 흉선에서 선택한 타고난 T 림프구의 뚜렷한 인구입니다. 하여 iNKT 세포 Vβ8, Vβ7 또는 CD1d의 컨텍스트에서 내인성뿐만 아니라 외국인 지질 항원을 인식 할 수있다 Vβ2 TCR도 3 중 하나와 짝을 불변 Vα14-Jα18 TCR 사슬로 구성된 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 예를 들어, 뮤린하여 iNKT 세포를 인식하고 내인성 지질 항원이라는 isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4뿐만 아니라, α - 갈 락토 실 (αGalCer) 5,6- 해양 해면에서 분리 된 당지질에 의해 활성화된다. TCR은 종속 &lt;하여 iNKT 세포의 활성화는 적응성 면역 반응의 프라이밍을 조장하고, 결과적으로하여 iNKT 세포는 류마티스 성 질환 (7)와 암을 포함하여 병변의 범위의 경감 또는 개발에 기능적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다SUP&gt; 8. 현재, 합성하여 iNKT 세포 리간드는 immunopathological 다수의 조건을 조절 할 수있다 유망한 새로운 백신 보조제를 구성한다. 이것은 이전하여 iNKT 세포 그러나 마우스 조직으로부터 분리 다음 시험 관내에서 생성 될 수 있음을 입증되었다; 이러한 연구의 많은 주요 항원 제시 세포 (APC를) 및 / 또는 세포주 (9)의 사용을 채택 Vα14 TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 인 iNKT 세포 유래 하이 브리 도마 (11, 12)의 생성을위한 마우스 (10), 또는 흉선종. 또한, 마우스의 큰 숫자는 같은 αGalCer로드 CD1d 이량 체, 및 긴 배양 배 시약의 높은 볼륨이 일부 공개 프로토콜 덜 윤리적, 경제적으로 9, 13을 호소합니다. 이 보고서에서 우리는 고립과 마우스의 비장에서하여 iNKT 세포의 체외 확장에 적응하는 방법을 설명합니다. 구체적으로는, 프로토콜이 방법을 기술FACS 셀 소팅에 필요한 마우스, 시약 및 시간을 감소시키고, 비장 체외로 정렬하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 방식이 제안 마우스 비장하여 iNKT 세포를 풍부하게.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murine IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-conjugated anti-mouse CD8&amp;alpha; (53-6.7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-conjugated anti-mouse CD3&amp;epsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; - free]</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate F-bottom</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m filter</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Water-jacketed CO2 incubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection Kit</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

급속 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력은 불변성 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 계보의 기능적 특성이다. 하여 iNKT 세포 따라서 면역 반응을 활성화시키고 스티어링 적응 가능한 타고난 T 세포군으로 특징 지어진다. 뮤린하여 iNKT 세포의 배양 및 확장을위한 개선 된 기술의 개발은 시험 관내 및 생체 내 모델 시스템 인 iNKT 세포 생물학 연구를 용이하게한다. 여기에서 우리는 고립과 쥐의 비장하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 된 절차를 설명합니다. C57BL / 6 마​​우스로부터 비장을 제거하고 해부 변형하고, 생성 된 세포 현탁액을 밀도 구배 매체를 통해 적층된다. 원심 분리 후, 비장 단핵 세포 (다국적)를 수집 및 CD5 양성 (CD5 +) 림프구는 자성 비드를 사용하는 농축된다. CD5 + 분획 내의하여 iNKT 세포는 계속해서 ^ 묻5; CD1d 테트라을 GalCer는로드 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)로 정제. FACS는 뮤린 재조합 IL-7의 존재 하에서 확장되기 전에, 재조합 쥐 사이토 플레이트 - 결합 T 세포 수용체 (TCR) 자극의 조합을 사용하여 iNKT 세포는 처음에 다음 체외 배양 정렬. 약 108 인 iNKT 세포들은 시험 관내 기능 분석을위한, 또는 마우스 생체 내 전달 실험에 사용할 수있는 배양 후 18-20 일 내에 발생 될 수있는이 기술을 사용.

밀도 구배를 사용하여 비장 단핵 세포의 분리는 약 1 시간 소요 적혈구 (적혈구)을 용해시키기 위해 요구되는 시약의 사용을 제거한다. 생존 세포의 높은 수율이 제거되고 기관의 긴장 중에 생성 방법 및이 파편을 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 비장 림프구 풀 내하여 iNKT 세포의 주파수 사용이 동물의 연령, 성별, 건강 상태에 따라 달라질 수 있으나 전체 T 림프구의 1 % 내지 5의 범위이다. 약 <sup...

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An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

an-optimized-method-for-isolating-expanding-invariant-natural-killer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K 조회수.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

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Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

연구

면역학 및 감염병학

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) face and is frequently associated with a poor clinical outcome. While, for instance, GvHD manifestations of the skin are usually responsive to established immune-suppressive therapies and are, hence, not taking a fatal course, the presence and the intensity of intestinal GvHD, especially of the mid-to-lower parts of the gut, strongly influence the outcome and overall survival of patients with acute GvHD. Therapeutic options are essentially limited to the classic immune-suppressive agents yielding only moderate disease-mitigating effects. Hence, detailed knowledge about the tissue-resident immune cascade, changes in the intestinal microbiota, and the stromal response prior, upon, and after intestinal GvHD onset are urgently needed to understand the events and mechanisms underlying its pathogenesis and to develop innovative therapeutic options. Murine models of GvHD are frequently employed to identify and functionally assess molecules and pathways putatively driving intestinal GvHD. However, means to specifically monitor and evaluate intestinal inflammation over time are essentially lacking since established scores to assess and grade acute GvHD are routinely comprised of various parameters which rather reflect&#160;systemic GvHD manifestations. The detailed evaluation of intestinal GvHD has been restricted to studies using euthanized mice, thereby essentially excluding longitudinal (i.e., kinetic) analyses of the colonic compartment under a given experimental condition (e.g., antibody-mediated blockade of a proinflammatory cytokine) in live mice (i.e., in vivo). The mini-endoscopic in situ assessment of the distal colon of allo-HCT-treated mice described here allows a) a detailed macroscopic evaluation of different aspects of intestinal inflammation and b) the option to collect tissue samples for downstream analyses at various time points over the course of the observation period. Overall, the mini-endoscopic approach provides a major advance in preclinical noninvasive monitoring and assessment of intestinal GvHD.

Here, we present a protocol that describes allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and allows repetitive mini-endoscopic evaluations of the distal colon in situ for the presence, characteristics, and severity of colonic inflammation within live mice suffering from intestinal graft-versus-host disease.

장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or microbial lipid antigens presented by the non-polymorphic MHC class I-related molecule CD1d. Preclinical and clinical studies support a role for iNKT cells in cancer, autoimmunity and infectious diseases. iNKT cells are very conserved throughout species and their investigation has been facilitated by mouse models, including CD1d-deficient or iNKT-deficient mice, and the possibility to unequivocally detect them in mice and men with CD1d tetramers or mAbs specific for the semi-invariant TCR. However, iNKT cells are rare and they need to be expanded to reach manageable numbers for any study. Because the generation of primary mouse iNKT cell line in vitro has proven difficult, we have set up a robust protocol to purify and expand splenic iNKT cells from the iV&#945;14-J&#945;18 transgenic mice (iV&#945;14Tg), in which iNKT cells are 30 times more frequent. We show here that primary splenic iV&#945;14Tg iNKT cells can be enriched through an immunomagnetic separation process, yielding about 95-98% pure iNKT cells. The purified iNKT cells are stimulated by anti-CD3/CD28 beads plus IL-2 and IL-7, resulting in 30-fold expansion by day +14 of the culture with 85-99% purity. The expanded iNKT cells can be easily genetically manipulated, providing an invaluable tool to dissect mechanisms of activation and function in vitro and, more importantly, also upon adoptive transfer in vivo.

We describe a rapid and robust protocol to enrich invariant natural killer T (iNKT) cells from mouse spleen and expand them in vitro to suitable numbers for in vitro and in vivo studies.

체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

T-Cell Enrichment: A Technique to Isolate T-Cells from Mixed Cell Population by Magnetic Separation

Source: Nguyen, H. D., et al. <a href="https://www.jove.com/t/60083">Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes T-cells enrichment from the spleen of a mouse by negative selection using a magnetic separator. The technique involves targeting the other cells in the sample for depletion using antibodies or ligands directed against specific cell surface antigens.

T-세포 농축: 자기 분리를 통해 혼합 세포 집단에서 T-세포를 분리하는 기술

Source: Nguyen, H. D., et al. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Leukemia

Cell isolation & characterization

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

Source: Buchele, V., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58871">Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

동종 골수 및 비장 세포 이식을 통한 마우스 모델에서 이식편 대 숙주 질환 유도

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. GvHD ...

Immunology

Immunopathology

Host-Pathogen Interaction Models

Isolating Invariant Natural Killer T Cells from a Mouse Model

Inject normal DBA/1 mouse intraperitoneally with alpha-GalCer, at the dosage of 0.1 milligrams per kilogram of body weight. Three days after modeling, after anesthetization, isolate the spleen of the mouse. Prepare a single-cell suspension by cutting and grinding the spleen in a 200-mesh sieve. Wash the cell suspension with PBS. Centrifuge at 200 times g for 5 minutes, and discard the supernatant.
Resuspend the cells with 1 milliliter of whole blood and tissue dilution solution. Add 3 milliliters of mouse lymphocyte separation medium, and then centrifuge the cells for 20 minutes, at 300 times g, at room temperature.
To purify the iNKT cells, resuspend 10 to the 7 cells with 100 microliters of 4 degrees Celsius PBS. Add 10 microliters of alpha-GalCer-loaded CD1d Tetramer-PE and incubate them at 4 degrees Celsius for 15 minutes in the dark. Wash the cells twice with PBS, and resuspend them in 80 microliters of PBS. Add 20 microliters of anti-PE microbeads and incubate them at 4 degrees Celsius for 20 minutes in the dark. Wash them twice with PBS and resuspend the cells with 500 microliters of PBS.
Place the sorting column in the magnetic field of the MACS sorter, and rinse with 500 microliters of PBS. Add the prepared cell suspension to the sorting column, collect the flow-through, and rinse three times with PBS buffer. Remove the magnetic field and add 1 milliliter of PBS buffer to the sorting column. Quickly push the plunger at a constant pressure to drive the labeled cells into the collection tube, and obtain the purified iNKT cells. Count with an automated cell counter.

마우스 모델에서 불변 자연 살해 T 세포 분리

Immunotherapy

Cellular Immunotherapy

EoE Sub Articles

Nanoparticle-Based Enrichment and Expansion of Antigen-Specific CD8+ T Cells

To isolate antigen-specific CD8-positive T cells, macerate the spleens and lymph nodes from wild-type C57Black/6j mice through a sterile 70-micrometer cell strainer with frequent PBS rinses, and use a no-touch CD8-positive T cell isolation kit, according to the manufacturer&#39;s instructions, to eliminate the non-CD8-positive T cells.
After counting, collect the isolated CD8-positive T cells by centrifugation, and resuspend the pellet in 100 microliters of PBS, supplemented with 0.5% bovine serum albumin and 2-millimolar EDTA.
Then, incubate the cells with the nanoparticle artificial antigen-presenting cells such that there are 1 x 1011 peptide-loaded MHC-Ig, per 1 x 106 isolated CD8-positive T cells in a sterile 5-milliliter polystyrene round-bottom tube for 1 hour at 4 degrees Celsius with continual mixing.
At the end of the incubation, wash the nanoparticle cell suspension three times on the magnetic stand as demonstrated, re-suspending the artificial antigen-presenting cells and the enriched CD8-positive T cells in 500 microliters of fresh supplemented medium with 1% T cell growth factor, after the last wash.
For maximum cell recovery, it is critical to leave the particles in cells on the magnetic column for at least 2 minutes, and to aspirate the buffer carefully without disrupting the particles and cells subject to the magnetic field.
After counting, seed 2.5 x 105 enriched CD8-positive T cells and magnetic particle mixture per 160 microliters of supplemented medium plus 1% TCGF in a 96-well U-bottomed plate. On day three, feed the cells with 80 microliters of supplemented medium with 2% T cell growth factor per well, and return the plate to the cell culture incubator for four more days.
On day seven, harvest the stimulated cells into a 5-milliliter round-bottom tube for counting, and collect the cells by centrifugation. Resuspend the pellet in 0.5 milliliters of PBS supplemented with 0.05% sodium azide and 2% fetal bovine serum for counting, and aliquot 5 x 104 to 5 x 105 cells into new 5-milliliter round bottom tubes for antigen-specific staining.
Label the appropriate tubes with biotinylated MHC-Ig and anti-mouse CD8a for 1 hour at 4 degrees Celsius, followed by a centrifuge wash in fresh PBS, to remove any excess biotinylated immunoglobulin. Then, stain the samples with an appropriate streptavidin-conjugated secondary antibody, and an appropriate live/dead fixable dead cell stain for 15 minutes at 4 degrees Celsius, and read the cells on a flow cytometer to determine the specificity and number of the antigen-specific CD8-positive T cells, according to standard protocols.