D.E. and M.B.D. are members of a multidisciplinary research platform (MRP) of Ghent University, and the Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID) consortium.

본 연구에서는 성인 (6-8 주) 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 마우스는 겐트 대학 동식물 사육장의 지침에 따라 보관 및 사육되었다. 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 마우스 비장에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 준비 <ol><li> 자궁 전위에 의해 마우스를 희생. </li><li> 다시 아래로 해부 보드에 마우스를 놓고 핀 뒷다리와 앞다리를 해결. </li><li> 70 %로 피부 표면을 소독 (부피 / 부피) 에탄올 / H 2 O. </li><li> 흉부에 복부​​ 정중선을 따라 피부를 잘라 무균 수술 도구를 사용하여 비장을 노출. </li><li> 주변의 지방 조직을 트리밍 한 후, 실온에서 1 ㎖의 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 24 웰 플레이트에 비장을 배치합니다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여 비장을 해부하고 50 ㎖ 욕조 내에 배치 70 μm의 나일론 필터로 조각을 전송전자. </li><li> 2 ML의 주사기 플런저를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 비장 조각 매쉬와 PBS 1X 5 ㎖로 세척한다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 피콜 - 페이크 3 ㎖를 첨가하고 5 ml의 세포 현탁액과 밀도 구배 매체를 오버레이. </li><li> 브레이크없이 실온에서 20 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 신선한 15 ML 튜브에 계면 이동 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 10 ml의 차가운 1X PBS와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (FACS 완충액)을 함유하는 PBS 1X 2 ml의 세포를 재현 탁. 전사 작은 튜브에 세포 현탁액 10 ㎕를 0.4 %의 10 μL와 혼합 </li></ol> 2. 농축 검색, 마우스 인 iNKT 세포의 정화 <ol><li> 마우스 비장 CD5positive (CD5 +) 림프구의 농축. <ol><li> (선택 사항) 얼룩 10 5 세포 FITC - 복합 안티 CD5 (4 μL 1시 반 희석 / 10 6 세포)어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 200 μL FACS 버퍼 (500)에 재현 탁 외과 버퍼 μL 씻어. 1X PBS로 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 20 μM 용액을 제조 작업, FACS 완충액 μL 이들에 105 세포를 1을 추가 5 분 동안 RT에서 배양한다. 흐름 cytometer에 104 미리 농축 세포를 취득. <ol><li> FCS-H와 FCS-W, 세포는 이중 집계 (그림 1A)를 제외 FSC-W 싸다 세포에 전자 게이트를 사용하여. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + (죽은) FSC-W LO 인구 (그림 1B) 내에서 세포 및 전자적 크기 (그림 1C)에 의해 림프구 인구를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용합니다. </li><li> 림프구 게이트 내의 세포를 사용하여, 대 CD5-SSC 플롯도 1D에 도시 된 바와 같이 전자적으로 게이트 CD5 + 림프구. 사이토 흐름 예비 농축 샘플의 나머지를 획득. </lI&gt; </ol></li><li> FACS 버퍼 90 μL 당 10 7 세포에 세포 수를 조정하고 10 μL 안티 CD5 마이크로 비드를 추가합니다. </li><li> 4 ML의 외과 차가운 외과 버퍼를 버퍼에 resuspend 500 μL로 한 번 씻어 15 분 동안 4 ºC에서 품어. 자기 세포 분리 (MACS)를 사용하여 CD5 + 림프구 제조업체의 권장 사항에 따라 열에 대한 풍부. </li><li> FITC - 복합 안티 CD5와 선택 사항) 얼룩은 10 5 세포 (2.1.1에서와 같이 1시 반 희석 / 10 6 세포) 및 DAPI의 4 μL. 흐름 (10) 4 농축 림프구 세포 계수기 획득하고 전자 게이트 2.1.1에서 만든 확인합니다. 풍부한 세포 부분에서 CD5 + 림프구를 선택합니다. 사이토 흐름에 105 세포를 획득하고도 1E에 도시 한 바와 같이 농축 된 분획에 본 CD5 + 림프구 백분율을 분석 - H를. </li></ol></li><li> 탐지 및 마우스 인 iNKT CE의 분리FACS로 재편. <ol><li> 항 CD16 / CD32을 함유하는 FACS 완충액 약 106 개 셀 (20) 당 μL 및 PE 공역 αGalCer (1시 50분 희석 / 106 세포의 4 μL)의 농도로 농축 CD5 + 림프구를 재현 탁 / CD1d 테트라 머 (1 μg의 / 10 6 세포). </li><li> 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 의 마우스 항체 (단클론 항체) 항 CD3ε V500 (1시 20분 희석의 4 μL / 10 6 세포), 항 CD19의 E450 (1시 50분 희석의 4 μL / 10 6 세포) 및 안티 CD8α의 E450 (4 μl를 희석 FACS 완충액 1:50 희석 / 106 개 세포), CD5 + 림프구에 추가하고 어두운 곳에서 39 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 107 세포 / ml의 최종 농도 4 ㎖의 FACS 완충액을 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 재현 탁하고 원심 분리하여 1 ML의 FACS 완충액으로 세포를 세척 하였다. </li><li> 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 및 얼음에 세포를 배치합니다. </li><li> 제조업체의 권장 사항 14, 15에 따라 정렬 셀 흐름 cytometer를 보정합니다. 주 : 셀 정렬하기위한 플로우 사이토 교정 훈련을 필요로하고 숙련 된 오퍼레이터, 또는 숙련 된 기술자에 의해 수행 될 수있다. </li><li> 10 6 세포 당 DAPI의 20 μm의 작업 용액 10 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. 흐름 cytometer에 약 10 4 농축 CD5 + 림프구를 취득. FSC-W 싸다 세포에 대한 전자적 게이트 세포는 이중 집계 (그림 2A)를 제외합니다. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI + CD8 + FSC-W LO 인구 (그림 2B) 내에서 CD19 + 세포 (덤프 채널) 및 2.1.1.1에 기술 된 바와 같이 전자 림프구 (그림 2C)를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용 . <ol><li> CD3ε 및 전자 게이트 αGalCer / CD1d에 의해 플롯 αGalCer / CD1d 테트라도 2D에 도시 된 바와 같이 테트라 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 풍부한 세포 부분에 존재하는 비율 αGalCer를 결정하기 위해 더 이상 5 10 × 2보다 CD5 + 풍부한 림프구를 취득 / CD1d 테트라 + CD3ε +하여 iNKT 세포. </li></ol></li><li> 2.2.7에서 작성한 전자 게이트를 사용. &#39;1.5&#39;의 유량으로 70 ㎛의 노즐을 이용하여 70 psi에서 사이토 흐름, FACS 분류 αGalCer / CD1d 테트라 머 + + CD3ε하여 iNKT 세포. 1 ml의 100 % FCS를 함유하는 FACS 튜브 정렬하여 iNKT 세포를 수집한다. 이어서 10 ㎖ RMPI 1640 배지 원심 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 이용한 FACS 튜브의 측면에서 분류하여 iNKT 세포를 헹군다. </li><li> 재현 탁은 RPMI 1640 배지 1 ㎖에 인 iNKT 세포를 분류하고 정렬하여 iNKT 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포에 이의 40 μL를 획득. 림프구 - FSC-W LO DAPI를 선택S 2.2.7에 기술 된 바와 같이. 전자 및 게이트 αGalCer / 그림 하반기 같이 CD1d 사량 + CD3ε +하여 iNKT 세포 - (G 그림 2E). </li></ol></li></ol> 3. 문화와 마우스 인 iNKT 세포의 확장 날 0 <ol><li> 코트 실온에서 1 시간 동안 잘 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트. 200 μL PBS 1X 한 번 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 (10 % 부피 /의 부피 FCS, 100 U / ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 5.5 μm의 β - 머 캅토 에탄올)와 함께 두 번 씻으십시오. </li><li> 1.11에서 0.4 % 혈구를 이용 가능한 정렬하여 iNKT 세포 (단계 2.2.8)의 개수를 카운트. 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고 재현 탁 재조합 쥣과 IL-2 (10 NG / ㎖), 뮤린 재조합 IL-12 (1 NG / ㎖) 및 항 - 마우스 가용성 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유. 플레이트의안티 CD3ε 코팅 된 플레이트 웰에서 105 세포 /로하여 iNKT 세포 orted 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다. </li></ol> 2 일 <ol start="3"><li> 2 일 동안 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 완전 RPMI 1640 배지에서 신선한 무지 평저 96 웰 배양 접시에 휴식 조건 하에서 세포를 세포를 옮긴다. </li></ol> 4 일 <ol start="4"><li> 부드러운 피펫 팅에 의해 판에서 셀을 제거하고 새로운 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 플랫 -에 105 세포 / 웰로 4 ℃, 재조합 쥣과 IL-7 (5 NG / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고, 플레이트에서 10 분 동안 300 XG에 원심 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 4 일 동안 96 웰 플레이트를 바닥. </li></ol> 8 일 <ol start="5"><li> 300 X에서 새로운 튜브에 세포를 수집, 원심 분리기수용성 항 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml에서 10 ℃에서 4 분, 재현 탁 대 g. </li><li> 코트는 물론 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트와는 3.1로 씻는다. (10) 5 세포 / 웰의 안티 CD3ε 코팅 플레이트와 하루 11까지 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 품어. </li></ol> 일 11-18 <ol start="7"><li> 반복 3.4-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 하루 19 ~ 20 <ol start="8"><li> 완전한 RPMI 1640 배지에서 5 × 105 세포 / ml로 재현 탁하고 300 XG에서 신선한 15ml의 튜브, 원심 분리기에 세포를 옮긴다. </li><li> 플레이트 105 세포에서 세포 / 웰 평저 96 웰 플레이트 허용 세포 실험에 사용하기 전에 CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 일 동안 휴식한다. </li></ol> 4. 사이토 카인 생산 CD1d 플랫을 사용하여 마우스 인 iNKT 세포에 의해전자 결합 분석 <ol><li> 코트 평평한 바닥 96 웰 아니라 당 재조합 쥐 CD1d 100 ㎕ (1X PBS에서 10 ㎍ / ㎖)와 플레이트는 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> , PBS 1X 200 μL로 4 회 씻어 잘 당 1X PBS (차단 솔루션)에 2 % FCS 200 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어. </li><li> 블로킹 용액을 제거 αGalCer 웰 당 200 μL의 (5 NG / μL)을 추가하고, 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양. [αGalCer 용액의 조제를 들어, 차량이 96 ㎎ / ㎖ 자당, 10 ㎎ / ㎖ 나트륨 데 옥시 콜레이트, 5 ㎎ / ㎖ 트윈 20을 포함에 용해 αGalCer 55 μg의에 1,085 μ 1X PBS를 추가]. </li><li> 배양 후, αGalCer 솔루션을 무시하고 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 다음 PBS 1X 200 μL로 잘 두 번 씻는다. </li><li> 전체 R에 원심 분리기 세포 300 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 재현 탁하고, 21 일에 체외 확장하여 iNKT 세포를 수집0.5 × 106 세포 / ml의 농도로 PMI 1640 배지. </li><li> 물론 당하여 iNKT 세포의 재 부유 200 μl를 추가하고 CO 2 배양기에서 37 ℃에서 72 시간 동안 배양한다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 효소 연결 immunosorbant 분석 (ELISA)에 의해 관심의 상층 액과 측정 사이토 카인을 수집합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+CD1-specific+NK1+T+cells:+development,+specificity,+and+function.">Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function.</a> Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).</li><li>Kronenberg, M., Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unconventional+lifestyle+of+NKT+cells.">The unconventional lifestyle of NKT cells.</a> Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+CD1d-restricted+repertoire+is+dominated+by+a+few+autoreactive+T+cell+receptor+families.">The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families.</a> J Exp Med. 193, 893-904 (2001).</li><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+glycosphingolipid+recognition+by+NKT+cells.">Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells.</a> Science. 306, 1786-1789 (2004).</li><li>Cardell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1-restricted+CD4++T+cells+in+major+histocompatibility+complex+class+II-deficient+mice.">CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice.</a> J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).</li><li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+and+TCR-mediated+activation+of+valpha14+NKT+cells+by+glycosylceramides.">CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides.</a> Science. 278, 1626-1629 (1997).</li><li>Drennan, M. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+sustained+expansion+of+mouse+spleen+invariant+NKT+cell+lines+with+preserved+cytokine+releasing+capacity.">Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity.</a> J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).</li><li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro.">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128, 324-333 (2009).</li><li>Gumperz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD1d-restricted+T+cell+recognition+of+cellular+lipids.">Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids.</a> Immunity. 12, 211-221 (2000).</li><li>Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+TCRs+recognize+murine+CD1.">Diverse TCRs recognize murine CD1.</a> J Immunol. 162, 161-167 (1999).</li><li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection,+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells.">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li><li>Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).</li><li>Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+quantifying+cell+sorting+yield+in+'real+time'.">A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).</li><li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages.">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

현재 프로토콜의 중요한 단계는 분리 및 CD5 + 림프구 (제 1 &amp; 2)의 후속 농축, FACS 정렬 (섹션 3)하여 iNKT 세포의 초기 도금 (4 절)를 포함한다. 섹션 1에서 수행 된 단계 신중 별개 셀룰러 상간 원심 다음 생성되도록 밀도 구배 매질을 통해 비장 세포 현탁액을 층에 기억한다. 자기 세포 분리 (제 2 항)에 의해 CD5 + 림프구의 후속 농축은 얼룩에 필요한 시약 및 시간을 최소화 및 증가하...

쥐 불변 자연 살해 T (인 iNKT) 세포는 CD1d 발현 대뇌 피질의 흉선 세포 1, 2에 의해 흉선에서 선택한 타고난 T 림프구의 뚜렷한 인구입니다. 하여 iNKT 세포 Vβ8, Vβ7 또는 CD1d의 컨텍스트에서 내인성뿐만 아니라 외국인 지질 항원을 인식 할 수있다 Vβ2 TCR도 3 중 하나와 짝을 불변 Vα14-Jα18 TCR 사슬로 구성된 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 예를 들어, 뮤린하여 iNKT 세포를 인식하고 내인성 지질 항원이라는 isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4뿐만 아니라, α - 갈 락토 실 (αGalCer) 5,6- 해양 해면에서 분리 된 당지질에 의해 활성화된다. TCR은 종속 &lt;하여 iNKT 세포의 활성화는 적응성 면역 반응의 프라이밍을 조장하고, 결과적으로하여 iNKT 세포는 류마티스 성 질환 (7)와 암을 포함하여 병변의 범위의 경감 또는 개발에 기능적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다SUP&gt; 8. 현재, 합성하여 iNKT 세포 리간드는 immunopathological 다수의 조건을 조절 할 수있다 유망한 새로운 백신 보조제를 구성한다. 이것은 이전하여 iNKT 세포 그러나 마우스 조직으로부터 분리 다음 시험 관내에서 생성 될 수 있음을 입증되었다; 이러한 연구의 많은 주요 항원 제시 세포 (APC를) 및 / 또는 세포주 (9)의 사용을 채택 Vα14 TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 인 iNKT 세포 유래 하이 브리 도마 (11, 12)의 생성을위한 마우스 (10), 또는 흉선종. 또한, 마우스의 큰 숫자는 같은 αGalCer로드 CD1d 이량 체, 및 긴 배양 배 시약의 높은 볼륨이 일부 공개 프로토콜 덜 윤리적, 경제적으로 9, 13을 호소합니다. 이 보고서에서 우리는 고립과 마우스의 비장에서하여 iNKT 세포의 체외 확장에 적응하는 방법을 설명합니다. 구체적으로는, 프로토콜이 방법을 기술FACS 셀 소팅에 필요한 마우스, 시약 및 시간을 감소시키고, 비장 체외로 정렬하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 방식이 제안 마우스 비장하여 iNKT 세포를 풍부하게.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-2</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-12</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>39-8122-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant murine IL-7</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-8071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3e (145-2C11)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0032-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD28 (37.51)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e450-conjugated anti-mouse CD8&#945; (53-6.7)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>48-0081-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>11-0051-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-conjugated anti-mouse CD3&#949; (500A2)</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>560771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12633-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-056</td>
			<td>[Ca2+/Mg2+ - free]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00 AF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate F-bottom</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>665-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>655-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>188-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tube</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>227-261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>Greiner-bio one</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Macs Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacketed CO2 incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized method for isolating and expanding invariant natural killer t cells from mouse spleen

급속 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력은 불변성 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 계보의 기능적 특성이다. 하여 iNKT 세포 따라서 면역 반응을 활성화시키고 스티어링 적응 가능한 타고난 T 세포군으로 특징 지어진다. 뮤린하여 iNKT 세포의 배양 및 확장을위한 개선 된 기술의 개발은 시험 관내 및 생체 내 모델 시스템 인 iNKT 세포 생물학 연구를 용이하게한다. 여기에서 우리는 고립과 쥐의 비장하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 된 절차를 설명합니다. C57BL / 6 마​​우스로부터 비장을 제거하고 해부 변형하고, 생성 된 세포 현탁액을 밀도 구배 매체를 통해 적층된다. 원심 분리 후, 비장 단핵 세포 (다국적)를 수집 및 CD5 양성 (CD5 +) 림프구는 자성 비드를 사용하는 농축된다. CD5 + 분획 내의하여 iNKT 세포는 계속해서 ^ 묻5; CD1d 테트라을 GalCer는로드 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)로 정제. FACS는 뮤린 재조합 IL-7의 존재 하에서 확장되기 전에, 재조합 쥐 사이토 플레이트 - 결합 T 세포 수용체 (TCR) 자극의 조합을 사용하여 iNKT 세포는 처음에 다음 체외 배양 정렬. 약 108 인 iNKT 세포들은 시험 관내 기능 분석을위한, 또는 마우스 생체 내 전달 실험에 사용할 수있는 배양 후 18-20 일 내에 발생 될 수있는이 기술을 사용.

밀도 구배를 사용하여 비장 단핵 세포의 분리는 약 1 시간 소요 적혈구 (적혈구)을 용해시키기 위해 요구되는 시약의 사용을 제거한다. 생존 세포의 높은 수율이 제거되고 기관의 긴장 중에 생성 방법 및이 파편을 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 비장 림프구 풀 내하여 iNKT 세포의 주파수 사용이 동물의 연령, 성별, 건강 상태에 따라 달라질 수 있으나 전체 T 림프구의 1 % 내지 5의 범위이다. 약 <sup...

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An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  Ghent University Hospital. Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...