We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).

<ol>
	<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+development:+insights+from+Drosophila.">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li><li>Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+disease+gene+counterparts+in+the+Drosophila+genome.">A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome.</a> J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> JoVE. (24), (2009).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> JoVE. (25), (2009).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Nishimura, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+vesicle-trafficking+protein+VAPB+causes+late-onset+spinal+muscular+atrophy+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).</li><li>Chen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+properties+of+a+novel+mutation+in+VAPB+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).</li><li>Funke, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P56S+mutation+in+the+VAPB+gene+is+not+due+to+a+single+founder:+the+first+European+case.">The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case.</a> Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).</li><li>Millecamps, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOD1,ANG,VAPB,TARDBP,+and+FUS+mutations+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis:+genotype-phenotype+correlations.">SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations.</a> J Med. Genet. 47 (8), 554-560 (2010).</li><li>Landers, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+VAPB+deletion+variant+and+exclusion+of+VAPB+mutations+in+familial+ALS.">New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS.</a> Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).</li><li>Van Blitterswijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPB+and+C9orf72+mutations+in+1+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient.">VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Budnik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synapse+structure+and+function+by+the+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg.">Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg.</a> Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).</li><li>Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+the+ALS8+causative+gene+VAPB+have+detrimental+effects+on+neurons+and+muscles.">Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles.</a> Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).</li><li>Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diseases+of+the+nuclear+envelope.">Diseases of the nuclear envelope.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760 (2010).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+human+neural+stem+cells+caused+by+pathogenic+LRRK2.">Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.</a> Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).</li><li>Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+VAP-33A+directs+bouton+formation+at+neuromuscular+junctions+in+a+dosage-dependent+manner.">Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner.</a> Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).</li><li>Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+proteinaceous+subnuclear+fraction+composed+of+nuclear+matrix,+peripheral+lamina,+and+nuclear+pore+complexes+from+embryos+of+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster.</a> J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).</li><li>Smith, D. E., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+developmental+regulation,+and+response+to+heat+shock+of+two+antigenically+related+forms+of+a+major+nuclear+envelope+protein+in+Drosophila+embryos:+application+of+an+improved+method+for+affinity+purification+of+antibodies+using+polypeptides+immobilized+on+nitrocellulose+blots.">Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots.</a> J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).</li><li>Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+interconversion+of+Drosophila+nuclear+lamin+isoforms+during+normal+growth+and+in+response+to+heat+shock.">Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock.</a> J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).</li><li>Puckelwartz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+nesprin-1+produces+an+Emery+Dreifuss+muscular+dystrophy-like+phenotype+in+mice.">Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice.</a> Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).</li><li>Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+positioning+the+cell+nucleus+in+vertebrate+photoreceptors.">Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).</li><li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death.">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في الماضي، كان نادرا ما تؤخذ الاختلافات الشكلية داخل وبين المجموعات التجريبية في الاعتبار. ومع ذلك، فإن تطبيق الأساليب الكمية أصبحت الآن تحسب القاعدة في الدراسات المقارنة من التشكل ووصف رياضي من الأشكال التشريحية. استخدام الكمية والتحليلات في تقييم آثار التلاعب الجيني في العمليات الخلوية محددة، مبشرة في تعزيز قدرتنا على اكتشاف التغيرات المورفولوجية وفي تحسين الدقة التي تم وصفها هذه التغييرات. وعلاوة على ذلك، التحليل الإحصائي للبيانات الكمي يسمح لنا لتقييم ما إذا كانت الاختلافات الملاحظة بين الظواهر كبيرة. في العضلات المخططة، نوى يحمل هيكل مدورة متميزة وتوزع بالتساوي على طول الألياف العضلية. على الرغم من أن الآليات الجزيئية إنشاء وصيانة حجم وشكل وبنية نواة ليست معروفة، هذه الميزات النووية المرجح رس تلعب دورا أساسيا في السيطرة على وظيفة العضلات. في الواقع، وسقوط عدد من الاعتلالات العضلية التي كتبها طفرات في الجينات التي تنظم التشكل وموقف نوى داخل العضلات. أهمية وظيفية من شكل وتوزيع نوى داخل الخلية لا يقتصر على العضلات. تراكم الأدلة تشير إلى أن ترتبط أيضا عيوب النووية مع الأمراض العصبية مثل مرض باركنسون 18،24. بالإضافة إلى ذلك، بدأنا ندرك أن التشكل، وحجم وتوزيع الخلايا من العضيات الأخرى بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا قد يكون لها عواقب وظيفية. على سبيل المثال، ترتبط التغييرات في مورفولوجية الميتوكوندريا الذين يعانون من اضطرابات عصبية مثل نوع 1 البصرية ضمور (OPA1) وشاركو ماري توث نوع 2A الاعتلال العصبي 25. للمساعدة في عملية توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات الهامة، فإننا نقترح الجمع بين عالية الدقة مبائرالبيانات مع برنامج التصوير والمورفولوجية ويحلل لتقييم كمي كيف التلاعب الجيني يمكن أن تؤثر على الشكل والحجم والموقع من نوى داخل الألياف العضلية. قوة وبراعة الوراثة ذبابة الفاكهة مع طبيعة نمطية للغاية من الجهاز العصبي العضلي في يرقات ذبابة الفاكهة تجعل اليرقات NMJ نموذج تجريبي مناسبة بشكل خاص لهذا النوع من التحليلات. وفي لل NMJs اليرقات، ويمكن إجراء التحليل المظهرية في قرار المشبك واحد مما يتيح تحليل المورفومترية دقيقة حيث يمكن دراسة عدد من لل NMJs داخل نفس الطاير ويمكن مقارنة حتى نفس التعرف NMJ بين الذباب من المورثات مختلفة 3،4. التوصيف المظهري للموقف النووي والشكل والحجم في ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ يبدأ عن طريق أداء المناعية لللل NMJs تشريح مع الأجسام المضادة التي تبرز العضلات ونوى داخل العضلات. في بروتوكول المبينة في ثيالصورة ورقة، كانت ملطخة myonuclei مع الأجسام المضادة ضد امين، علامة على المغلف النووي، مع علامة النووية تسليط الضوء على النووية الداخلية ومع الاجسام المضادة المحددة لDVAP وصمة عار على العضلات كلها. تفضلت الأجسام المضادة امين المستخدمة في هذه التجارب من قبل بول فيشر 19-22 لكن مصادر بديلة للأجسام المضادة للامين يمكن استخدامها. بالإضافة إلى ذلك، يتوفر تجاريا عددا من الأجسام المضادة أخرى محددة لالغلاف النووي. وأخيرا، علامات النووية، مثل دابي ويوديد propidium، وتتوفر أيضا في حين يمكن تصور العضلات عن طريق تلطيخ مع المضادة للالأكتين أو مكافحة تويولين الأجسام المضادة. وفي حالة تطبيق الأجسام المضادة غير تلك المستخدمة في هذا الإجراء التجريبي، فإن بروتوكول المناعية يتطلب-خطوات إضافية في أي ظروف تثبيت وتركيز العمل على الأجسام المضادة الجديدة سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل. خطوة حاسمة في هذا البروتوكول، وخصوصا عندما تحتاج إلى تحليل الاداءات حجم، هو الالبريد متزايدة من العينات على الشريحة. في هذه الحالة، فمن المهم أن تشمل الفواصل بين الشرائح وساترة بحيث العينات لا تحصل على سحق. ثلاث فرق من الشريط السليلوز ملفوفة حول الشريحة على كلا الجانبين من ساترة تمثل وسيلة سهلة لجعل الفواصل. في حين تم استخدام يماغيج للصور 2D، أكثر من صورة متعددة القنوات 3D التحليلات الواردة في هذه الورقة تم القيام به، وذلك باستخدام Imaris لما له من توافر في المنزل. ومع ذلك، أي مماثلة حزمة برامج تجارية أخرى يمكن استخدامها لهذه التطبيقات. هناك العديد من المصادر المفتوحة (على سبيل المثال، يماغيج، CellProfiler، Vaa3D، الجليدية، KNIME وغيرها) ومنصات البرمجيات التجارية المتاحة لتحليل الصور مبائر. يماغيج 26، البرمجيات الحرة من المعاهد الوطنية للصحة أو نسختها أكثر المحسن، والمعروفة باسم فيجي 27، لديها عدد كبير من المرشحات الاستيراد، وحدات الماكرو والإضافات المتاحة لالتصال التصوير في جميع أنحاء العالمتاي. وتتركز معظم هذه الإضافات على معالجة المعلومات على نحو شريحة شريحة حدة. وهناك أيضا الإضافات المتاحة لتصور وتحليل الصور 3D متعددة القنوات. ومع ذلك، في كثير من الأحيان أنها مصممة لمهمة محددة والمستخدمين قد تحتاج إلى توسيع أو التكيف مع هذه الإضافات لاحتياجاتها الخاصة. من ناحية أخرى، منصات تجارية تستهدف مستخدمين عديمي الخبرة نسبيا وغالبا ما تركز على سهولة الاستخدام، تغطية واسعة من المهام لمعالجة الصور مع سرعة لا تصدق. إجراء التجارب إلى جانب تحليل المظهري الكمي الواردة في هذا البروتوكول، ويمكن أن تساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في التشكل عضية وتوزيعها داخل الخلية. ومع ذلك، فإن هذا النهج لديه الحد الواضح من تحليل هذه العمليات في نهاية نقطة محددة. ومن المرجح أن تكون دينامية جدا وتختلف ليس فقط بين مختلف تاي خلية عملية السيطرة على التشكل وتوزيع العضياتعبوة ولكن أيضا داخل الخلية نفسها تبعا لحالة النمو أو الفسيولوجية. أن تكون ممثلة لمواصلة تنفيذ هذا التحليل من وقت التصوير مرور تسمح التغييرات في مورفولوجية عضية وموقف التي يتعين رصدها مع مرور الوقت.

Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations. 
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems. 
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1. 
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:187px;">Micro-Forceps 0.3x0.25 mm</td>
			<td style="width:187px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:187px;">11030-12</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;">Sylgard dissection plates&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>76103</td>
			<td style="width:187px;">Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60&#186;C for at least 24 hours</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:187px;">Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:187px;">Microdissection scissors (ultra-fine)&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:187px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:187px;">Bouin&#39;s Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)</td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:187px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Triton-X100. SIGMA-T8787</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:187px;">Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:187px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:187px;">Guinea Pig anti-DVAP antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:187px;">Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:187px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:187px;">123-065-021</td>
			<td style="width:187px;">Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:107px;width:187px;">Rabbit anti-Lamin antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:187px;">Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:187px;">TO-PRO-3</td>
			<td style="width:187px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:187px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:187px;">Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated</td>
			<td style="width:187px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>bs-295G-A555-BSS</td>
			<td style="width:187px;">Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;width:187px;">Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated</td>
			<td style="width:187px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>bs-0358G-Cy3-BSS</td>
			<td style="width:187px;">Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:187px;">Vectashield mounting medium for fluorescence</td>
			<td style="width:187px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:187px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

why quantification matters: characterization of phenotypes at the drosophila larval neuromuscular junction

معظم الدراسات على التشكل تعتمد على الوصف النوعية كيفية الصفات التشريحية تتأثر تعطيل جينات معينة ومسارات الوراثية. نادرا ما يتم تنفيذ الوصف الكمي، على الرغم من التلاعب الجيني تنتج مجموعة من الآثار المظهرية ولاحظت اختلافات حتى بين الأفراد داخل المجموعة الضابطة. شواهد يدل على التشكل وحجم وموقع من العضيات تلعب، دورا أساسيا بعد بالتقدير سابقا في وظائف الخلايا والبقاء على قيد الحياة. هنا نقدم إرشادات خطوة بخطوة لإجراء تحليلات كمية من الظواهر في ذبابة الفاكهة اليرقات الوصل العصبي العضلي (NMJ). نحن نستخدم العديد من علامات المناعية النسيجية موثوقة جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الحيوي والمورفولوجية تحليل لدراسة آثار الطفرات الوراثية في العمليات الخلوية محددة. على وجه الخصوص، ونحن نركز على التحليل الكمي من الظواهر التي تؤثر على التشكل، حجم وموضع نuclei داخل العضلات المخططة من يرقات ذبابة الفاكهة. ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ هو النموذج التجريبي قيما للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء بنية ووظيفة الجهاز العصبي العضلي، سواء في الصحة والمرض. ومع ذلك، فإن منهجيات وصفنا هنا يمكن أن تمتد إلى الأنظمة الأخرى كذلك.

ALS هو مرض التنكسية التي تؤثر على وجه التحديد الخلايا العصبية الحركية مما يؤدي إلى الشلل التدريجي وقاتلة للعضلات المخططة 7. الطفرات مغلطة في المصاحب VAMP البشري البروتين ب (hVAPB) تسبب مجموعة من الأمراض العصبية الحركية بما في ذلك نوع المرض 08-12 أغسطس. تم التعرف على الطفرات مغلطة (V234I) في الجين hVAPB مؤخرا في حالة واحدة من المرض نموذجية في البشر 13. لتقييم إمكاناتها المسببة للأمراض، ولدت لنا الذباب المعدلة وراثيا معربا عن hVAPB ذبابة الفاكهة orthologue DVAP تحمل الطفرة المسببة للمرض (DVAP-V260I). وقد استهدفت التعبير عن هذا التحوير إلى العضلات باستخدام نظام UAS / GAL4 والعضلات محددة سائق BG57-GAL4 14،15. وتمت مقارنة تأثير DVAP-V260I التعبير المعدلة وراثيا ويتناقض إلى أن اثنين من الجينات المحورة أخرى (DVAP-WT1 وDVAP-WT2)، التي تعبر عن مستويات مختلفة من البرية من نوع البروتين DVAP 16. موره على وجه التحديد، فإن الزيادة في DVAP مناعية 2.2 أضعاف عما كانت عليه في الضوابط لخط DVAP WT2 بينما مستويات DVAP-V260I وDVAP-WT1 المعرض للمقارنة وأقل من نفس إشارة 16. وقد ارتبطت التغيرات النووية مع الشيخوخة والعديد من الأمراض العصبية بما في ذلك 17،18 مرض باركنسون. لتقييم ما إذا كان نموذج الطيران لدينا ALS8 المعارض تغييرات في الهيكل النووي، وموقف والحجم، ونحن ملطخة نوى داخل العضلات المخططة من المورثات المناسبة مع علامة النووية والأجسام المضادة لمكافحة امين 19-22، والذي يتصور المغلف النووي. لتسليط الضوء على العضلات، تمت إضافة الأجسام المضادة DVAP محددة أيضا لنفس العينات (الشكل 1). وقد تم جمع الصور مبائر وأجريت التحليلات المورفومترية مفصلة باستخدام برمجيات تحليل الصور. في عضلات السيطرة، تم العثور على نواة ليتم توزيعها بالتساوي على طول العضلاتالألياف في حين DVAP-V260I وDVAP-WT معربا عن العضلات، نوى تبدي ميلا إلى إعادة توزيع في مجموعات مرتبطة ارتباطا وثيقا (الشكل 1). أجرينا أقرب تحليل جار لإجراء تقييم كمي لتوزيع نوى على طول الألياف العضلية من كل راثى. تحليل أقرب جار أولا بتحديد أقرب جار لكل نواة عن طريق قياس المسافة بين مركز نواة معينة ووسط كل نواة المحيطة الأخرى. ثم يتكرر هذا الإجراء كل النوى الأخرى على طول الألياف العضلية. وأخيرا، فإن أقصر مسافة بين النوى ضمن محددة من العضلات، ويحسب عن طريق حساب متوسط ​​أقصر المسافات من كل نواة وأقرب جيرانها. (الشكل 2A - C). مقارنة مع الضوابط، عضلات التعبير إما التحوير DVAP-V260I أو أي من الجينات المحورة overexpressing البروتين من النوع البري، تقديم انخفاض كبير في متوسط ​​المسافة أقصر بين النوى، ونتيجة لذلك، تظهر نواة لتكون مرتبطة بشكل وثيق في مجموعات. تأثير المرض تسبب أليل DVAP-V260I هو أشد من العقوبة المرتبطة overexpression من البروتين من النوع البري، حتى إذا تم استخدام أقوى التحوير-DVAP WT2 (الشكل 1 والشكل 2D). overexpression من أي DVAP-V260I أو DVAP-WT الجينات المحورة أيضا يسلك تدهور حاد في الهندسة المعمارية النووية مما أدى إلى نوى المشوهة مع بنية ممدود (الشكل 1). وكان كميا هذا الانحراف الهيكلي باستخدام برنامج ImageJ الذي يتم فيه تحديد دائرية بواسطة الصيغة C <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq3.jpg" /> والذي يقيس معدل العرض إلى نسبة طول كل نواة مع C = 1 يمثل دائرة الكمال وC = 0 مضلع ممدود بلا حدود. في مقاولاتنوى را اظهار شكل دائري واضح، C يساوي 1 بينما في المسوخ المعدلة وراثيا تغيير في الشكل مع ما يترتب فقدان دائرية، يؤدي إلى انحراف كبير من هذه القيمة (الشكل 1) والشكل (3). كما وجدنا أن في عضلات التعبير عن نفس الجينات المحورة، نوى عرض حجم النووي الموسع ملحوظ مقارنة مع الضوابط، على الرغم من أن تسبب أليل ALS يبدو لتكون أكثر كفاءة في حمل هذا النمط الظاهري مقارنة الجينات المحورة DVAP-WT (الشكل 4). تتميز ما يقرب من جميع الأمراض العصبية من تراكم الخلايا من المجاميع التي تحتوي على البروتين المسببة للأمراض. التي قطعناها على أنفسنا اعادة البناء 3D والاداءات حجم النواة وجدنا أن في عضلات التعبير عن التحوير متحولة أو overexpressing البروتين من النوع البري، DVAP المناعية التفاعل تشكيل مجموعات لالثانية أن بعضهم تم ترجمة أيضا في نوى (الشكل 5). على العكس من ذلك، في لل NMJs السيطرة، تتوزع DVAP المناعية التفاعل ضعيف في جميع أنحاء الألياف العضلية ويتم استبعاد من النواة 16. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig1.jpg" /> . الشكل 1: صور متحد البؤر myonuclei داخل العضلات المخططة التعبير إما DVAP-WT أو الجينات المحورة DVAP-260I (A) BG57-GAL4 / + السيطرة، (ب) BG57، DVAP-V260I، (C) BG57، DVAP-WT1 و (D) BG57، ملطخة العضلات DVAP-WT2 التعبير عن الجينات المحورة المشار إليها مع الاجسام المضادة المحددة لDVAP (إشارة حمراء)، امين (إشارة خضراء) مع وجود علامة معينة النووية لتصور النوى (إشارة الزرقاء). شريط مقياس = 30 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض</a>نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig2.jpg" /> الشكل 2: أقرب تحليل جار لتحديد متوسط ​​المسافة بين نواة وأقرب جيرانه واحد (ب) النتائج الممثل تظهر المواقع النووية تغير في عضلات overexpressing التحوير-DVAP WT2 بالمقارنة مع الضوابط في الفقرة (أ). وقدرت المسافة النووية متوسط ​​في عضلات المورثات المشار إليها باستخدام الصيغة في (C) ويتم الإبلاغ عن البيانات في (D). هي ملطخة لل NMJs اليرقات مع الاجسام المضادة المحددة لDVAP (إشارة حمراء)، امين (الأخضر) مع وجود علامة النووية (إشارة الزرقاء). النجمة تدل دلالة إحصائية. *** P &lt;0.001 ** P &lt;0.01. للتحليل الإحصائي لهذه التجربة وجميع التجارب المذكورة أدناه في اتجاه واحد أنوفا اختبار تم استخدام وmultip لتوكي فيتم تطبيق اختبار جنيه مقارنة كاختبار بعد خاصة عندما تم العثور على الاختلافات بين الأنماط الجينية أن تكون كبيرة بواسطة اختبار ANOVA. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 30 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig3.jpg" /> الشكل (3): صور تظهر الخطوات تمثيلية في حساب حجم النووي (أ) صورة تمثيلية تظهر نواة مجزأة باستخدام معالج إنشاء السطح. تم تجاهل نوى عند حدود الصور. وقد ملثمين (ب) صورة تظهر إشارة DVAP النووية بعد المحيطة تلطيخ DVAP باستخدام سطح إنشاؤها في قناة علامة النووية. وتقدم (C) طبقة السطحية من المعلومات من معلمات إضافيةبما في ذلك حجم النووي وكروية. (D) بيانات عن حجم النووي من مختلف الأنماط الوراثية. النجمة تدل دلالة إحصائية. كانت ملطخة لل NMJs تشريح مع أضداد DVAP (إشارة حمراء)، أضداد امين (إشارة خضراء) وعلامة النووية (إشارة الزرقاء). *** P &lt;0.001 ** P &lt;0.01. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 30 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig4.jpg" /> الشكل 4: صور تظهر الخطوات تمثيلية في تقدير شكل النووي يماغيج. &#160;&#160; وقد تم تحليل أقصى الإسقاط كثافة الصور باستخدام يماغيج لتقدير دائرية من نواة داخل العضلات. (أ) مثال ممثل الإسقاط كثافةالصورة ثلاث قنوات كما في الخطوة 7.9 من البروتوكول. تم اختيار (ب) صورة تظهر خطوة 7.10 البروتوكول الذي يتم تقسيم القنوات وقناة علامة النووية. (C) صورة تمثيلية توضح أنه بعد تطبيق عتبة كثافة لقطاع نوى ومدير العائد على الاستثمار المساعد في ImageJ، كل نواة من الفائدة يمكن أن يتم اختيار وشكلها تقاس من خلال واصفات الشكل (خطوات 7،11-7،15). (D) الكمي للدائرية من مختلف الأنماط الوراثية. على لل NMJs اليرقات، تشير إشارة حمراء DVAP تلطيخ بينما يحدد اللون الأخضر نوى ويتوافق مع تلطيخ امين. وصفت الداخلية من كل نواة في الزرقاء بسبب تلطيخ مع علامة النووية. النجمة تدل دلالة إحصائية. *** P &lt;0.001 ** P &lt;0.01. أشرطة الخطأ تمثل SEM. شريط مقياس = 30 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر لها</a>البريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig5.jpg" /> الرقم 5: صور تظهر خطوات محددة في خلق الاداءات حجم myonuclei. (أ) صورة تبين كثافة 3D المخلوطة عرض العضلات ملطخة البروتين DVAP (الحمراء)، وامين (الخضراء) وعلامة الحمض النووي (الأزرق). (ب) صورة تمثل الطبقة السطحية الناتجة عن استخدام القناة امين لقطاع نوى. (C) صورة تمثل نواة التي استخدمت الطبقة السطحية لإخفاء إشارة DVAP خارج النواة المحدد. باللون الأصفر هي طائرة لقطة التي تم إضافتها إلى الصورة. زاوية نظره وموقف يمكن تعديلها بشكل تفاعلي لتصور توزيع إشارة داخل النواة. (D) صورة الإبلاغ عن رأي مستعرضة من باليود الطبقة السطحية النووي التي تم إنشاؤهانانوغرام اندمجت قناة امين مع DVAP غير المقنعة وإشارات علامة النووية. (E و F) مقطوع إضافية الاداءات حجم من نفس النواة. شريط مقياس = 10 ميكرومتر <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction at JoVE.com

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

why-quantification-matters-characterization-phenotypes-at-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

8.1K Views.  University of Edinburgh. Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques. 

Video: Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

تصور الأعصاب القطاعي اليرقات في 3 الثالثة طور مرحلي ذبابة الفاكهة التحضيرات اليرقات

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

في التصور المجراة من الحويصلات متشابك ضمن محاور عصبية ذبابة الفاكهة القطاعي اليرقات

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

التحليل الوظيفي للتغذية اليرقات الدائرة في ذبابة الفاكهة</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

اثنين من الخوارزميات لإنتاجية عالية ومتعدد حدودي الكمي ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عصبي عضلي مفرق الصرف

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...