Name: why quantification matters: characterization of phenotypes at the drosophila larval neuromuscular junction
Uploaded: 2016-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction at JoVE.com

We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).

1. Deneysel hazırlanması Not: inceleme ve bölümler 2 imüno-histokimya prosedürleri ve 3, ancak modifikasyonlar ile, referanslar 3-6 göre gerçekleştirilir. <ol><li> 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve% 0.1 Triton-X-100 ihtiva eden PBS (PBT) hazırlayın. buz üzerinde saklayın. </li><li> Bouin fiksatif hazırlayın (15 Pikrik Asit: 10 Formaldehit: 1 Asetik Asit). Bu reaktif taze olun. </li><li> temiz paslanmaz çelik minutien işaretçilerine ve ince forseps seçin. </li><li> 5 cm Petri kabındaki bir Sylgard diski içeren diseksiyon tabak hazırlayın. </li></ol> Üçüncü evre Larva NMJs 2. Diseksiyon <ol><li> Bir şişe veya ince bir fırça ile bir şişe üçüncü evre larvaları dolaşıp almak ve uzak kalan yiyecek yıkamak için 4 ° C PBS içeren 2 cm Petri kabı içine yerleştirin. </li><li> diseksiyon plaka Sylgard yüzeyinin üstünde bir larva yerleştirin ve positi olduğundan emin oluniki uzunlamasına trakea tüpleri üstünde görünecek şekilde dorsal yüzü oned. </li><li> forseps kullanarak, pimi tutun sağ ağız kanca altında, onun ön sonunda larva pin. mümkün olduğunca larva germek ve arka aşağı son pin. </li><li> plaka duvarları ulaşmak için yeterli PBS tuzlu ekleyin ve tamamen larva batırmayın. </li><li> Aynı genotip diğer larvalar için 2.3 adımları 2.1 prosedürü tekrarlayın. Tek bir 5 cm Petri kabı diseksiyon plaka kolayca 8 larva konaklayabilir. </li><li> Mikro-diseksiyon makas kullanarak, hafifçe dorsal manikür kaldırın ve pin yakın arka ucundaki küçük bir yatay bir kesi yapmak. </li><li> trakea iki boyuna yolları arasındaki orta hat boyunca ön sonuna kadar larvanın tüm yol kesip, kesi içine makas yerleştirin. orta hat kesintileri sadece manikür geçmesine ve kasların ile kesme önlemek için yeterince yüzeysel olduğundan emin olunventral yüzü. </li><li> her bir ucunda, sol ve sağ taraflarında iki çentik kesti. </li><li> ön kesi her iki tarafında iki işaretçilerine koyarak fileto açın. arka ucu ile aynı tekrarlayın. işaretçilerine yerleştirirken, ayrı beden duvarı yaymak için emin olun. </li><li> forseps ve PBS tuz kullanarak iç organları dışarı temizleyin. bozulmamış merkezi sinir sistemini bırakın. Yavaşça tamamen gerilir kadar köşe pimleri ile larva germek ama kaslar bu süreçte yırtık olmadığından emin olun. </li><li> Aynı diseksiyon plaka üzerinde diğer larvalar için aynı diseksiyon işlemi tekrarlayın. </li><li> tüm iç organları kaldırmak için PBS tuzlu su ile üç kez yıkayın. </li><li> Bouin fiksatifi PBS ile değiştirin ve 10 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> PBT ile birkaç kez yıkayın. </li><li> dikkatlice işaretçilerine çıkarın ve immün boyanması için 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne şimdi oldukça sert olan tüm hazırlıklarını, aktarın.</li></ol> Kas ve Myonuclei için spesifik antikorlar ile Drosophila NMJs 3. immünohistolojik boyama <ol><li> Hızla PBT larva filetosu durulayın. </li><li> sabit bir ajitasyon altında 2 saat PBT içinde% 10 normal keçi serumu (NGS) ile inkübe edilerek preparatlar bloke eder. </li><li> PBT 5 NGS ve% (1 konsantrasyonda: 500) bir tavşan anti-lamin antikoru ihtiva eden parçalara NMJs bir dizi inkübe: 2 saat ve (1: 500 arasında bir konsantrasyonda) kobay anti-DVAP antikoruyla Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de. Anti-lamin boyama myonuclei konturunu algılayan ise anti-DVAP antikoru çizgili kasları boyar. </li><li> aşan antikorlar kaldırmak için PBT kez hızlı bir şekilde yıkayın. PBT her 15 dakikada bir tampon değiştirerek 2 saat PBT yıkayın. </li><li> PBT 1 ile% 5 NGS ve fluoresan etiketli sekonder antikorları içeren örnekleri inkübe: Oda sıcaklığında 500 seyreltme 2 saat süredir. Aynı örnekler cBir başka kromofor ile konjuge sekonder antikor kullanıldığında, aynı anda birden fazla antikor ile boyanarak tabi. </li><li> ikincil antikorlar çıkarın ve PBT her 15 dakikada tampon değiştirerek 2 saat boyunca PBT yıkayın. </li><li> myonuclei PBS ile numuneleri üç defa yıkamak ve aşağıdaki işlemleri iç leke: <ol><li> PBS içinde 1000 ve sürekli ajitasyon altında 20 dakika boyunca inkübe edilir: 1 bir seyreltme TO-PRO-3 nükleer işaretleyici ekleyin. Bu işaretleyici, bu çalışmada kullanılan, ancak herhangi bir başka ticari olarak temin edilebilir, nükleer bir belirteç olarak da kullanılabilir. </li><li> takmadan önce PBS içinde hızla üç kez yıkayın. </li></ol></li></ol> Slaytlar 4. Montaj Örnekleri <ol><li> 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne gelen forseps ile örnekleri Pick up ve bir işlem slayt onları uzandı. </li><li> Mikro-diseksiyon makas kullanarak, baş ve filetolar kuyruk kesilmiş ve iç yüzey yukarı tutmak. </li><li> th hazırlayıne birbirinden yaklaşık 1 cm mesafede temiz bir sürgünün her iki tarafında, selüloz bant üç şerit etrafına sarılarak slayt monte edilebilir. Lamel iki şeridin üzerine yerleştirildikten sonra, bir boşluk örnekleri düzleştirme önlemek olacaktır oluşturulur. yapıların üç boyutlu hacimli kaplamalar yapılacak ise, bu çok önemlidir. </li><li> Üç selüloz bandı şeritler arasındaki bağlantı sürgünün ortasında montaj orta, yaklaşık 20 ul arasında küçük bir damla koyun. </li><li> temiz forseps ile montaj orta yayıldıktan sonra, iç yüzey uydurarak, montaj ortama montaj slayt disseke larva sürükleyin. Dört ya da beş satır onları bağlamaya çalışın. </li><li> Yavaşça montaj slayt üstüne bir kapak kayma bırakın ve herhangi bir hava kabarcığı oluşturulan emin olun. şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür. Numuneler görüntüleme önce en az 10 dakika süreyle kurumasını bekleyin. </li></ol> Görüntüleme için 5. Konfokal Ayarları Not: E inverted mikroskop: Bu çalışmada sunulan Görüntüler Ti üzerine entegre edilmiş bir Nikon A1R konfokal ünitesi kullanılarak alınır. Bununla birlikte, 488 nm, 561 nm ve 642 nm ve 3 kanal tespit sisteminin dalga boyu bölgeleri mevcuttur 3 lazer birimlerinin en az bir konfokal mikroskop bu amaç için uygundur. <ol><li> lazerler, dedektör ünitesi, cıva ampul, sahne denetleyici, mikroskop ve PC AÇIN. kontrol yazılımı başlatın ve sahne tutucu slayt sabitleyin. </li><li> görüntüleme hızlı seçin yapmak ve 20X objektif kullanarak örnek üzerinde ilgi alanları (ROI) tüm bölgelerinde işaretlemek için. </li><li> Dikkatle 60X yüksek büyütme objektif lens (60X Planı Apo VC / NA 1.4 YAĞ) için burun salıncak. </li><li> objektif lens üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve bilgisayarda XYZ genel bakış penceresinden işaretli ROI birini seçin. </li><li> Aşağıdaki optik ayarlarını kullanarak görüntüleme başlayın: İlk Dikroyik Ayna seçin: 405/488/561/640. Emisyon filtresi kanal 1, kanal 3 uzun geçiş filtresi 650 nm ile kanal 2 ve 642 nm lazer 595/50 emisyon filtresi ile 561 nm lazer nm 525/50 ile 488 nm lazer seçin. </li><li> görüntü toplama başlamadan önce aşağıdaki tarama ayarlarını kullanın: Galvano tarayıcıyı seçin; Tarama yönü: tek yön; Tarama hızı: saniyede 0.5 kare. </li><li> Kanal boşaltma-through önlemek için Kanal seriyi seçin. </li><li> 1 havadar ünitesine pin-hole boyutunu ayarlayın. Tarama ve lazer gücü, algılama kazancını ayarlamak ve piksel doygunluk ve arka plan düzeyi önlemek için her kanal için uygun ofset. </li><li> ROI ve slayt hazırlıkları için tüm voksel boyutu 0.2 x 0.2 x 0.5 mikron 3 kullanılarak z-yığınları elde edin. Görüntüler Dekonvolüsyonun tabi tutulacaktır sonra 0.06 x 0.06 x 0.15 mikron ila 3 voksel boyutunu ayarlayın. </li><li> .nd2 dosya biçimi veya .ics formatında görüntü kaydetmek. </li></ol> Çizgili içinde Çekirdeklerin Arasındaki Mesafe 6. HESAPLAMA60; En Yakın Komşu Analiz Yöntemi ile Kaslar <ol><li> Bu analiz için, kasları görselleştirmek için DVAP antikorlar ile ve lamin antikorlar ve çekirdekleri vurgulamak için bir nükleer işaretleyici ile boyandı larva vücut duvarı kasları görüntüleyen konfokal görüntüleri kullanın. </li><li> Çekirdekleri arasındaki yakın mesafeyi tahmin etmek için, görüntü analiz yazılımı (örneğin, Imaris) ve MeasurementPro modülü içinde Ölçüm Noktaları kullanın. Görüntü analizi için diğer benzer yazılım uygulamaları aynı amaçlar için kullanılabilir. </li><li> konfokal görüntüleri açın. Yazılım simgesine çift tıklayın başlatmak için. Sürükle ve Arenaya konfokal z yığın görüntüleri bırakın. </li><li> Görüntülerde çift tıklayın otomatik olarak menü araç çubuğu simgesinin altında, Aşmak View bunları açmak için <img alt="görüntü 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821img1.jpg" /> . Görünüm Alanı, Özellikler Alanı Listesi Nesne ve Nesne: Aşan Görünüm üç ana çalışma alanı panelleri vardır. </li><li> Bir ses görüntü render t oluşturmenü simgesini 3B Görünüm tıklayarak hree kanal görüntü <img alt="görüntü 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821img2.jpg" /> . </li><li> Ekle Yeni Ölçüm Noktaları simgesini tıklayın <img alt="görüntü 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821img3.jpg" /> itibaren Nesneler araç çubuğu ve Nesne Özellikleri Alanında görünen yaratma sihirbazı izleyin. </li><li> oluşturma sihirbazı ilk Düzen sekmesini seçin ve ardından Özgü Kanal. Nükleer işaretleyici veya çekirdekleri vurgulamak için lamin kanalı birini seçin. </li><li> klavyenizdeki Esc sekmesine basarak seçin moduna işaretçi olarak ayarlayın. </li><li> Görüntünün belirli bir çekirdeği içeren fare tekerleği ile 3D imleç kutusunun boyutunu ayarlayın. Aynı çekirdeği üzerinde Shift tuşunu ve sol fare tıklaması tutarak ölçüm noktası eklemek. </li><li> Önceki adımları yineleyerek aynı kası üzerindeki yakındaki bir çekirdeği üzerinde ikinci noktası ekleyin. Bir çizgi otomatik olarak iki nokta ile ölçülen mesafeye arasındaki çizilir<html> iki çekirdek gösterilir. İki çekirdekleri arasındaki mesafe şimdi sekmesi İstatistik&gt; Ayrıntılı&gt; Uzaktan veri altında Nesne Özellikleri Area istatistiksel değişken olarak kaydedilir. </li><li> Belirli bir çekirdeğini çevreleyen tüm çekirdeklerin için 6.10 adımları 6.6 prosedürü tekrarlayın. </li><li> İstatistikler&gt; tüm toplanan ölçüm noktaları görüntüleme Ayrıntılı&gt; Mesafe verileri, en kısa mesafe belirleyebilirsiniz itibaren. </li><li> Dosya Sekme Ekranında İhracat İstatistikleri tıklayarak <img alt="image 4" src="/files/ftp_upload/53821/53821img4.jpg" /> Nesne Özellikleri Alanı altında bulunan veriler bir tablo üzerinde kaydedilir. </li><li> çevredeki diğer çekirdeklerin ve genotip başına kas liflerinin seçilen bir dizi için aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Bir tablo dosyasına ihraç verileri kullanarak, aşağıdaki denklem kullanılarak kasların tüm M numarası için ortalama en kısa mesafeyi (D ave) hesaplamak: OAD / 53821 / 53821eq1.jpg &quot;/&gt; Di i 0 ila N değişir ve N kas başına analiz çekirdeklerin sayısı, belirli bir çekirdeği i komşu çekirdeğe en kısa mesafedir. j değerlerin toplamıdır = 0 j = m analiz kasların M sayısını gösterir. </li><li> Alternatif olarak, kullanımı Noktalar Oluşturma sihirbazı ve Spotlar Spotlar yakın mesafe yakın komşu çekirdeğine ortalama mesafeyi tahmin etmek. Bu, bir Matlab uzatma modülü gereklidir. <ol><li> Arena ve 3D hacimli görüntü üzerinde belirli bir resme çift tıklayınız gör Alanında görüntülenir. Nesne Oluşturma simgesine tıklayın ve Yeni Noktalar ekleyin <img alt="Resim 5" src="/files/ftp_upload/53821/53821img5.jpg" /> Nesneler araç çubuğundan. </li><li> Nesne Özellikleri Bölgesindeki oluşturma sihirbazı itibaren seçeneği Atla Otomatik Oluşturma, Düzenleme Manuel tıklayın. </li><li> Lamin veya çekirdekleri görüntülemek için nükleer işaretleyici kanal birini seçin. </li><li> lef Shift ve tıklayınGörüntüdeki belirli bir kas bütün çekirdekler t fare düğmesi. Her çekirdeğin üzerine bir nokta belirir. </li><li> Spotlar Spotlar Nesne Özellikleri Alan Araçlar sekmesinin altında listelenen en yakın mesafe seçin. Sonuç modu ve Matlab penceresinin altında seçin Noktalar İstatistik görünür. </li><li> İstatistikler sekmesi altında, detaylı ve daha sonra özel Değerler seçin. Distmin tıklayın ve her çekirdeğin asgari mesafeler değerleri görünür. </li><li> Bir tablo dosyasına veri ihracat ve kas başına bu mesafelerin ortalamasını hesaplar. Belirli bir genotip tüm kaslar için prosedürü tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 7. Drosophila Larva Vücut duvarı kasları içinde Çekirdeklerin Şekli belirlenmesi <ol><li> Bu analiz için, lamin ve çekirdekleri görselleştirmek için bir nükleer işaretleyici ile boyandı vücut duvarı kasları konfokal görüntüleri kullanmak. </li><li> myonuclei, ölçü küresellik şeklini değerlendirmek (sur oranı olarak tanımlanmaktadırYüzey çekirdeğinin alan) ya da ellipticity (verilen çekirdekten aynı hacme sahip bir küre, yüzü alanı / basık uzun elipsoitlere ve parçacıklarının) arasında ayrım yapmaktadır. </li><li> daha önce açıklandığı gibi görüntüyü açın. Yeni Yüzeyler ekle Nesneler araç çubuğu simgesini tıklayın <img alt="görüntü 6" src="/files/ftp_upload/53821/53821img6.jpg" /> . </li><li> Nesne Özellikleri Alanı görünen oluşturma sihirbazı olarak, çekirdekleri görüntülemek için Kaynak Channel gibi nükleer işaretleyici boyama seçin. </li><li> eşik olarak seçenek Mutlak Yoğunluk ayarlayın. çekirdeklerin çoğu eşik eğrisinde değerini değiştirerek sorunsuz ve aşırı render gösterdiğinden emin olun. Aynı zamanda, aynı eğrisi kullanılarak bir çekirdeğe delik veya eksik maskenin varlığı önlemek. </li><li> Kullan Filtre aracı yüzey işleme herhangi bir gürültü dışlamak için. Yeni oluşturulan yüzey tabakasının, Split Düzen sekmesinde veya yanlış olduğunu yeniden çekirdekler yüzeyleri Birleştirmendered. </li><li> Bir e-tabloya İhracat İstatistikleri sekmesinin altında mevcut yüzey render çekirdeklerin elipsliği ve küresellik değerleri dosya. </li><li> Circularity (C) C tanımlandığı gibidir Alternatif olarak, çekirdek daireselliğe ölçmek için ImageJ ya da Fiji yazılımı kullanmak <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq2.jpg" /> . sıfıra yaklaşan bir değer giderek uzatılmış şekli gösterir iken birinin değeri mükemmel bir daire temsil eder. </li><li> Menü Görüntüleri&gt; Stacks&gt; Z Projesi z yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları oluşturun. Maksimum Şiddeti olarak ayarlayın projeksiyon tipi. </li><li> kanal bölünmüş ve nükleer işaretleyici kanalını seçin. </li><li> Ana menüde, Görüntü&gt;&gt; Eşik ayarlayın. </li><li> Segment yoğunluğu eşiği ayarlayarak çekirdekleri. Yakın çekirdekler tek bir birim olarak segmente ise,&gt; Süreci Hakkında çekirdekleri kesmek İkili&gt; Havza aracı tıklatın. </li><li> Ana menüden Düzenle&gt; seçin SSeçim&gt; seçim oluşturun. </li><li> &gt; Araçlar&gt; ROI Yöneticisi Analiz menüsünde tıklayarak ROI Yöneticisi seçilen tüm ROI ekleyin. ROI Manager penceresinde Ekle üzerine tıklayın. aynı pencere içinde fazla&gt; bölme seçin. </li><li> Analiz&gt; Set Ölçümler Shape Tanıtıcılar seçin. ROI Manager penceresinde sekmesini tıklayın Ölçün. Bu seçilen tüm çekirdeklerin dairesellik değerlerinin bir listesini görüntüler. </li><li> Buna ek olarak, nükleer hacmini ölçmek alt 7,3-7,7 açıklandığı gibi nükleer işaretleyici boyama kanalını kullanarak yüzey oluşturma sihirbazı takip etmek. </li></ol> Belirli Protein intranüklear Yerelleştirme değerlendirin Drosophila Larvaların vücut duvarı kasları içinde Seçilmiş Çekirdeklerin 8. 3D ses Çizimler <ol><li> Nükleer işaretleyici ile ve lamin ve DVAP için spesifik antikorlar ile boyandı vücut duvarı kasları raporlama konfokal görüntüleri kullanın. </li><li> yazılım ve sel başlatarak görüntüleri açınvb özel çekirdek analiz edilecek. Bu ana menü öğesi Düzen&gt; Kırpma 3D seçerek yapılabilir. </li><li> fıkrasında 7,3-7,7 açıklandığı gibi lamin kanalını kullanarak yüzey oluşturma sihirbazını izleyin. </li><li> Yüzey oluşturulduktan sonra, Nesneler Özellikleri Bölgesindeki Düzenle üzerine tıklayın ve ardından çekirdeğinde sinyali izole etmek için tüm Maske seçin. Bu yeni bir pencere oluşturur. </li><li> Kanal Seç açılır menüden seçin DVAP sinyali. sıfıra Yüzey dışında seçenek Seti Voksellerden tıklayarak çekirdeğin içinde DVAP immün reaktivite sinyalini seçin. Yeni bir maskeli bir kanal oluşturulur ve seçimi için gösterge ayar penceresinde temin edilebilir. </li><li> çekirdeğin içinde sinyalin varlığını görselleştirmek ekle ikonuna Yeni Kırpma Plane tıklayarak bir kontur düzlemi oluşturmak <img alt="görüntü 7" src="/files/ftp_upload/53821/53821img7.jpg" /> Nesneler araç çubuğundan. </li><li> Etkileşimli kırpma açısını ayarlamakdüzlem ve çekirdeğin içinde sinyal dağılımını görselleştirmek için konumu. </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+development:+insights+from+Drosophila.">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li><li>Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+human+disease+gene+counterparts+in+the+Drosophila+genome.">A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome.</a> J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Dissection of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> JoVE. (24), (2009).</li><li>Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> JoVE. (25), (2009).</li><li>Ramachandran, P., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+staining+of+Drosophila+larval+body-wall+muscles.">Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles.</a> Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Nishimura, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+vesicle-trafficking+protein+VAPB+causes+late-onset+spinal+muscular+atrophy+and+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).</li><li>Chen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+properties+of+a+novel+mutation+in+VAPB+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).</li><li>Funke, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P56S+mutation+in+the+VAPB+gene+is+not+due+to+a+single+founder:+the+first+European+case.">The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case.</a> Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).</li><li>Millecamps, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOD1,ANG,VAPB,TARDBP,+and+FUS+mutations+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis:+genotype-phenotype+correlations.">SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations.</a> J Med. Genet. 47 (8), 554-560 (2010).</li><li>Landers, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+VAPB+deletion+variant+and+exclusion+of+VAPB+mutations+in+familial+ALS.">New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS.</a> Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).</li><li>Van Blitterswijk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAPB+and+C9orf72+mutations+in+1+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+patient.">VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Budnik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synapse+structure+and+function+by+the+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg.">Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg.</a> Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).</li><li>Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+in+the+ALS8+causative+gene+VAPB+have+detrimental+effects+on+neurons+and+muscles.">Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles.</a> Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).</li><li>Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diseases+of+the+nuclear+envelope.">Diseases of the nuclear envelope.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a000760 (2010).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+human+neural+stem+cells+caused+by+pathogenic+LRRK2.">Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.</a> Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).</li><li>Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+VAP-33A+directs+bouton+formation+at+neuromuscular+junctions+in+a+dosage-dependent+manner.">Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner.</a> Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).</li><li>Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+proteinaceous+subnuclear+fraction+composed+of+nuclear+matrix,+peripheral+lamina,+and+nuclear+pore+complexes+from+embryos+of+Drosophila+melanogaster.">Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster.</a> J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).</li><li>Smith, D. E., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+developmental+regulation,+and+response+to+heat+shock+of+two+antigenically+related+forms+of+a+major+nuclear+envelope+protein+in+Drosophila+embryos:+application+of+an+improved+method+for+affinity+purification+of+antibodies+using+polypeptides+immobilized+on+nitrocellulose+blots.">Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots.</a> J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).</li><li>Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+interconversion+of+Drosophila+nuclear+lamin+isoforms+during+normal+growth+and+in+response+to+heat+shock.">Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock.</a> J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).</li><li>Puckelwartz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+nesprin-1+produces+an+Emery+Dreifuss+muscular+dystrophy-like+phenotype+in+mice.">Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice.</a> Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).</li><li>Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+positioning+the+cell+nucleus+in+vertebrate+photoreceptors.">Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).</li><li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death.">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Geçmişte, içinde ve deney grupları arasında morfolojik farklılıklar nadiren dikkate alınmıştır. Ancak, nicel yöntemlerin uygulanması artık morfolojisi ve anatomik formları matematiksel tanımı karşılaştırmalı çalışmalar norm hesaplanır haline gelmektedir. kantitatif kullanımı belirli hücresel süreçleri üzerinde genetik manipülasyon etkilerini değerlendirirken analizleri, morfolojik değişiklikleri saptamak için kabiliyetinin artırılması ve bu değişiklikler açıklanan hangi ile doğruluğunu artıran umut tutun. Ayrıca, nicel verilerin istatistiksel analizi bize fenotipleri arasında gözlenen farklılıkların anlamlı olup olmadığını değerlendirmek için izin verir. çizgili kaslarda, çekirdeklerin ayrı bir yuvarlak yapı sergiler ve eşit kas lifi boyunca dağıtılır. kurulması ve boyut, şekil ve çekirdeklerin mimarisini koruyarak moleküler mekanizmalar bilinmemekle birlikte, bu nükleer özellikler muhtemel t vardıro kas fonksiyonunu kontrol edilmesinde temel bir rol oynar. Nitekim, birkaç Miyopatiler kasların içinde çekirdeklerin morfoloji ve konumunu düzenleyen genlerdeki mutasyonların neden olur. şekil ve bir hücre içinde çekirdeklerin dağılım fonksiyonel önemi kas ile sınırlı değildir. Giderek artan kanıtlar, nükleer kusurlar da Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların 18,24 ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu morfoloji, boyut ve endoplazmik retikulum ve fonksiyonel sonuçlar doğurabilir mitokondri dahil olmak üzere diğer organellerin hücre içi dağıtımını takdir başlıyor. Örneğin, mitokondriyal morfolojisi değişiklikler gibi optik atrofi tip-1 (OPA1) ve Charcot-Marie-Tooth tip 2A nöropati 25 gibi nörolojik bozukluklar ile ilişkili. Bu önemli süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların sürecinde yardımcı olmak için, biz yüksek çözünürlüklü konfokal birleştirmek için teklifgörüntüleme yazılımı ve morfometrik veri nicel genetik manipülasyonlar kas liflerinin içinde çekirdeklerin şekil, boyut ve konumunu nasıl etkileyebileceğini değerlendirmek için analiz eder. Drosophila larvaları nöromüsküler sistemin son derece basmakalıp doğa ile güç ve birlikte Drosophila genetiği çok yönlülüğü Larvaların NMJ analizler bu tür için özellikle uygun bir deneysel model olun. Larva NMJs, fenotipik analizi NMJs bir sayıda aynı sinek içinde incelenebilir ve hatta aynı tanımlanabilir NMJ farklı genotipler 3,4 sinekler arasında karşılaştırılabilir doğru bir morfometrik sağlayan tek bir sinaps çözünürlükte gerçekleştirilebilir. Drosophila larva NMJ nükleer pozisyon, şekil ve boyut Fenotipik karakterizasyon kaslarının içinde kasları ve çekirdekler vurgulamak antikorlar ile disseke NMJs immün gerçekleştirerek başlar. Protokolde Thi özetlenenödevi, myonuclei bütün kas leke DVAP özel çekirdek iç ve sahip antikorlar vurgulama nükleer işaretleyici ile, lamin, çekirdek zarfına bir göstergesi karşı poliklonal antikorlar ile lekelendi. Bu deneylerde kullanılan lamin antikorlar nazik Paul Fisher 19-22 temin edilmiştir, ancak anti-lamin antikorların alternatif kaynaklar kullanılabilir. Buna ek olarak, çekirdek zarfı için özel diğer antikorlar bir takım ticari olarak temin edilebilir. kasları, anti-aktin ya da anti-tubulin antikor ile boyanarak görünür olabilir süre Son olarak, DAPI ve propidyum iyodür nükleer belirteçler de mevcuttur. Bu deneysel prosedürde kullanılan dışındaki antikorlar kullanılırsa, immün protokol sabitleme koşulları ve yeni antikorlar için çalışan konsantrasyonları optimize edilmesi gerekecektir ekstra-adımlar gerektirir. hacim render analiz edilmesi gerekir, özellikle bu protokol, bir kritik adım, the slaytta numunelerin montajı. Bu durumda, slayt ve örnekler ezilmiş değildir, böylece lamel arasında aralayıcılar dahil etmek çok önemlidir. lamel her iki sürgünün sarılı selüloz bandı üç bant ara parçalar yapmak için kolay bir yol göstermektedir. ImageJ 2D görüntüleri için kullanılan iken, 3D çok kanallı görüntü çoğu bu makalede sunulan analizleri, çünkü onun içi durumu Imaris kullanılarak yapılmıştır. Bununla birlikte, herhangi bir diğer benzer ticari yazılım paketi bu uygulamalar için de kullanılabilir. Konfokal görüntüleri analiz için kullanılabilir (örneğin, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME ve diğerleri için) birçok açık kaynak ve ticari yazılım platformları bulunmaktadır. ImageJ 26, Fiji 27 olarak bilinen NIH ya da daha gelişmiş versiyonu ücretsiz yazılım, dünya çapında görüntüleme haberleşme için kullanılabilir ithalat filtreleri, makro ve eklentileri çok sayıda varty. Bu eklentileri çoğu bir dilim-dilim yan şekilde bilgi işlem odaklandık. Çok kanallı 3D görüntülerin görüntülenmesi ve analiz için uygun eklentiler vardır. Ancak, genellikle belirli bir görev için tasarlanmış ve kullanıcıların kendi ihtiyaçlarına bu eklentileri uzatmak veya uyarlamak gerekebilir. Öte yandan, ticari platformlar nispeten deneyimsiz kullanıcıları hedef ve genellikle inanılmaz bir hızla görüntü işleme görevleri kolaylığı kullanımı, geniş kapsama odaklandık. Bu protokolde belirtilen nicel fenotipik analizi ile birlikte deneysel prosedür, organel morfolojisi ve hücre içindeki dağılımını kontrol moleküler mekanizmaların yardımcı olabilir. Ancak, bu yaklaşım, belirli bir uç noktada bu süreçleri analiz bariz bir sınırlama vardır. morfoloji ve organellerin dağılımı kontrol süreci çok dinamik olması ve sadece farklı hücre ty arasında değişmektedir muhtemelengelişimsel ya da fizyolojik durumuna bağlı olarak aynı hücre içinde pes değil, aynı zamanda. Bu analizin bir başka uygulama organel morfolojisi ve pozisyon değişiklikleri zamanla izlenecek izin zaman atlamalı görüntüleme ile temsil edilecektir.

Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations. 
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems. 
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1. 
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.

<table><tbody><tr><td>Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11030-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard dissection plates&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>76103</td><td>Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 &amp;deg;C for at least 24 hr</td></tr><tr><td>Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors (ultra-fine)&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 7 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 130 mM NaCl, pH 7</td><td></td><td></td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (SIGMA-S8282), Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1)</td><td></td><td></td><td>Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)</td></tr><tr><td>1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Triton-X100. SIGMA-T8787</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Guinea Pig anti-DVAP antibody</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS</td></tr><tr><td>Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Lamin antibody</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Molecular Probes</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-295G-A555-BSS</td><td>Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td></tr><tr><td>Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-0358G-Cy3-BSS</td><td>Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium for fluorescence</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

why quantification matters: characterization of phenotypes at the drosophila larval neuromuscular junction

morfolojilerinden üzerinde çalışmaların çoğu belirli genler ve genetik yolların bozulması nasıl etkilendiğini anatomik özelliklerin niteliksel açıklamaları güveniyor. Genetik manipülasyon fenotipik etkilerin bir dizi üretmek ve varyasyonların da kontrol grubu içindeki bireyler arasında görülen, ancak nicel Tanımlar nadiren yapılır. delil Yükselen morfolojisi, boyut ve organellerin konumu hücre fonksiyonu ve sağkalım daha önce underappreciated, henüz temel bir rol oynadığını göstermektedir. Burada Drosophila larva nöromüsküler bileşke (NMJ) de fenotipleri kantitatif analizleri gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar. Biz biyo-görüntüleme teknikleri ve morfometrik spesifik hücresel süreçlere genetik mutasyonların etkilerini incelemek için analizler ile birlikte birçok güvenilir immunohistokimyasal işaretleri kullanmak. Özellikle, morfoloji, boyut ve n durumunu etkileyen fenotipleri nitel analiz odakuclei Drosophila larvaların çizgili kasların içinde. Drosophila larva NMJ sağlık ve hastalık hem yapısını ve kas sinir sistemi işlevini, altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli bir deneysel model. Bununla birlikte, burada tarif yöntemleri gibi diğer sistemlere uzatılabilir.

ALS özellikle çizgili kaslar 7 ilerleyici ve ölümcül bir felç yol açan motor nöronların etkileyen dejeneratif bir hastalıktır. İnsan VAMP-ilişkili protein B (hVAPB) missense mutasyonlar ALS tip 08-12 Ağustos olmak üzere motor nöron hastalıklarının bir dizi neden olur. HVAPB genindeki bir yanlış anlamlı bir mutasyon (V234I) en son insanlarda 13 tipik ALS bir olguda saptanmıştır. Patojenik potansiyeli değerlendirmek için, hastalığa neden olan bir mutasyon (DVAP-V260I) taşıyan hVAPB Drosophila ortolog DVAP ifade eden transgenik sinekler oluşturulur. Bu transgen ifadesi UAS / GAL4 sistemi ve kas-özel bir sürücü BG57-Gal4 14,15 kullanarak kas hedeflenmiştir. DVAP-V260I transgenik ekspresyonu etkisi karşılaştırılmıştır ve vahşi tip DVAP proteininin 16 farklı düzeylerde eksprese iki transgenlerin (DVAP-WT1 ve DVAP-WT2), bu tezat edilmiştir. More özellikle DVAP immünoreaktivitesinde artış DVAP-WT2 hattı için kontrollere göre daha yüksek 2,2 kat iken, aynı sinyalin 16 DVAP-V260I ve DVAP-WT1 sergi karşılaştırılabilir ve daha düşük seviyeleri. Nükleer değişiklikler yaşlanma ve Parkinson hastalığı dahil olmak üzere çeşitli 17,18 nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. ALS8 için sinek modeli nükleer mimarisi, konumu ve büyüklüğü değişiklikleri sergiler olmadığını değerlendirmek için, bir nükleer işareti ve nükleer zarf görselleştiren bir anti-lamin antikoru 19-22, uygun genotiplerin çizgili kaslar içinde çekirdekleri boyandı. Kasları vurgulamak için bir DVAP özgü antikor aynı numune (Şekil 1) ilave edildi. Konfokal görüntüler toplandı ve ayrıntılı morfometrik analizleri bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapıldı. Kontrol kaslarda, çekirdekler eşit kas boyunca dağıtılmış bulunmuşturkas ifade DVAP-V260I ve DVAP-WT ise elyaf çekirdekler yakın ilişkili kümeleri (Şekil 1) dağıtmak için bir eğilim gösterirler. Her genotip kas lifleri boyunca çekirdeklerin dağılımının kantitatif değerlendirmesini gerçekleştirmek için en yakın komşu analizi yapılmıştır. Bir yakın komşu analizi ilk verilen bir çekirdeğin merkezi ve diğer her çevreleyen çekirdeğin merkezi arasındaki mesafeyi ölçerek her çekirdeğe en yakın komşu tanımlar. Bu prosedür daha sonra kas lifi boyunca her çekirdekleri için tekrarlanır. Son olarak, belirli bir kas içinde çekirdekleri arasındaki en kısa mesafe, her çekirdek ve onun en yakın komşularının kısa mesafelerde ortalaması alınarak hesaplanır. (Şekil 2A - C). kontrol ile karşılaştırıldığında, DVAP-V260I transgeni ya da vahşi-tip protein aşırı ifade transgenlerin herhangi birini ifade eden kaslarıBunun sonucu olarak, çekirdekler yakın kümeler halinde ilişkili gibi görünmektedir, çekirdek arasındaki ortalama en kısa mesafe belirgin bir azalma bu vb. Alel DVAP-V260I neden ALS etkisi güçlü DVAP-WT2 transgen (Şekil 1 ve Şekil 2D) kullanılmış olsa bile, doğal tipte proteinin aşırı ekspresyonu ile ilişkili daha fazla şiddetlidir. DVAP-V260I ya DVAP-WT, ya transgenlerin aşırı ifadesi aynı zamanda, uzatılmış bir yapı (Şekil 1) deforme çekirdeklerde elde nükleer mimari ciddi bir bozulma gösterir. Bu yapısal sapmaları dairesellik formül Cı tarafından tanımlandığı ImageJ yazılımı kullanılarak nicelleştirilmiştir <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq3.jpg" /> C = 1 mükemmel bir daire temsil ve C = 0 sonsuz uzun çokgen her çekirdeğin uzunluğu oranı genişliğini ölçmek hangi. Contr içindeTransgenik mutantlar döngüsellik kaybı ile sonuçlanan şeklinde bir değişiklik, bu değere (Şekil 1 ve Şekil 3) önemli bir sapma neden olurken farklı bir yuvarlak sergileyen ol çekirdekleri, C 1&#39;e eşittir. Ayrıca ALS neden alel DVAP-WT transgenlerin (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında, bu bir fenotipi uyarmak için daha etkili olduğu görülmektedir, ancak, aynı transgenlerin sentezlenmesi kaslarda, çekirdekler, kontroller ile karşılaştırıldığında belirgin bir büyütülmüş çekirdek hacmi gösterdikleri bulundu. Hemen hemen tüm nörodejeneratif hastalıklar, patojenik proteini içeren agregaların hücre birikimi ile karakterize edilir. Bu 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve çekirdek hacmi kaplamalar yapılmış ve kas mutan transgen eksprese eden ya da vahşi-tip protein aşırı ifade olarak DVAP immüno-reaktivite kümeleri meydana getirdiği görülmüştürnd bazıları da çekirdeklerinde (Şekil 5) içine lokalize olduğunu. Bunun aksine, kontrol NMJs olarak DVAP immüno-reaktivite zayıf kas lifi boyunca dağıtılır ve nükleus 16 hariç tutulmuştur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig1.jpg" /> . Şekil 1: DVAP-wt ya da DVAP-260I transgenlerin eksprese çizgili kaslar olan myonuclei Konfokal görüntüler (A) BG57-Gal4 / + kontrol, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 ve (D) BG57; belirtilen transgenlerin ifade DVAP-WT2 kasları DVAP (kırmızı sinyal), lamin (yeşil sinyal) için spesifik ve çekirdekleri (mavi sinyali) görselleştirmek için bir nükleer özel işaretleyici ile antikorlar ile boyandı. Ölçek çubuğu = 30 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">bir görüntülemek için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig2.jpg" /> Şekil 2: En yakın komşu analizi çekirdeği ve tek en yakın komşusu arasındaki ortalama mesafeyi belirlemek için (B) DVAP-WT2 transgeni aşın ifade eden kaslarda değişmiş nükleer konumlandırma gösteren Temsilcisi sonuçları (A) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında.. Belirtilen genotiplerinin kaslarda ortalama çekirdek mesafe (C) &#39;de formül kullanılarak tahmin edilmiştir ve veri (D)&#39; de rapor edilmiştir. Larvaların NMJs DVAP (kırmızı sinyal) lamin (yeşil) için özel antikorlar ile nükleer işaretleyici (mavi sinyali) ile boyanır. Yıldız istatistiksel olarak anlamlı belirtir. *** P &lt;0.001, ** p &lt;0.01. İstatistiksel Bu deney analizi ve tek yönlü ANOVA testi aşağıda bildirilen tüm deneyler kullanıldı ve bir Tukey MULTIP içingenotipler arasındaki farklar ANOVA testi ile anlamlı bulunmuştur zaman le karşılaştırma testi post-hoc test olarak uygulanmıştır. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 30 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53821/53821fig3.jpg" /> Şekil 3:. Nükleer hacminin hesaplanmasında temsilcisi adımları gösteren Görüntüler (A) yüzey oluşturma sihirbazı kullanılarak segmente çekirdekleri gösteren bir temsili resim. Görüntülerin sınırında Çekirdekleri göz ardı edildi. Çevredeki DVAP boyama sonrası nükleer DVAP sinyali gösteren (B) Görüntü nükleer işaretleyici kanalda oluşturulan yüzey kullanarak maskelenmiş edilmiştir. (C) yüzey tabakası ilave parametrelerin bilgi sağlarNükleer hacim ve küresellik dahil. Çeşitli genotiplerin nükleer birimde (D) Veri. Yıldız istatistiksel olarak anlamlı belirtir. Dissected NMJs önleyici DVAP antikorları (kırmızı sinyal), anti-lamin antikorlar (yeşil sinyali) ve nükleer işaretleyici (mavi sinyali) ile boyanmıştır. *** P &lt;0.001, ** p &lt;0.01. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 30 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53821/53821fig4.jpg" /> Şekil 4: Görüntüler ImageJ nükleer şekil tahmininde temsilcisi adımları gösteren. &#160;&#160; görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyon kaslar içinde çekirdeklerin daireselliğe tahmin etmek ImageJ kullanılarak analiz edildi. (A) yoğunluk projeksiyonu temsili bir örneği,protokolün adım 7.9 olarak üç kanal resmin. Kanallar bölünmüş olduğu protokol ve nükleer işaretleyici kanalının adım 7.10 gösteren (B) Görüntü seçilir. ImageJ segmente çekirdekler ve ROI yöneticisi eklentisi yoğunluğu eşik uyguladıktan sonra, tüm ilgi çekici çekirdekleri seçilebilir ve şekil Şekil tanımlayıcıları ile ölçülen gösteren (C) bir temsilci görüntü (7.117.15 adımlar). Çeşitli genotiplerinin döngüsellik (D) miktarının belirlenmesi. Yeşil çekirdekleri özetliyor ve lamin boyanma tekabül ederken larva NMJs üzerinde, kırmızı sinyal DVAP boyama gösterir. Her çekirdeğin iç yüzünden nükleer işaretleyici ile lekelenmeye karşı mavi etiketli. Yıldız istatistiksel olarak anlamlı belirtir. *** P &lt;0.001, ** p &lt;0.01. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 30 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig4large.jpg" target="_blank">onu tıklayınız</a>E bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53821/53821fig5.jpg" /> Şekil 5: myonuclei hacmi kaplamalar oluşturulmasında belirli adımları gösteren görüntüler. 3D yoğunluğunu gösteren (A) Görüntü DVAP protein (kırmızı), lamin (yeşil) ve DNA markeri (mavi) ile boyandı kasların görünümü harmanlanmış. (B) segmentine çekirdekleri lamin kanalı kullanılarak oluşturulan bir yüzey tabakası temsil Görüntü. (C) yüzey tabakası seçilen çekirdeğin dışında DVAP sinyalini maskelemek için kullanılan edildiği bir çekirdek temsil Görüntü. sarı renkle vurgulanmış görüntüye eklenmiş bir kırpma uçağı. görünüm ve pozisyon açısını etkileşimli çekirdeğinde sinyallerin dağılımını görselleştirmek için ayarlanabilir. (D), nükleer yüzey tabakası oluşturulur USI enine kesit bir görünümü rapor bir resimng lamin kanalı maskesiz DVAP ve nükleer işaretleyici sinyalleri ile birleşti. (E ve F) aynı çekirdeğin ek kesitli hacmi render. Ölçek çubuğu = 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction at JoVE.com

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

why-quantification-matters-characterization-phenotypes-at-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

8.1K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques. 

Video: Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Nörobilim

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Biyoloji

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Drosophila Larva NMJ Synaptic Potansiyeller kayıt için Elektrofizyolojik Yöntemler

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Drosophila Nöromüsküler Kavşaklarda ve Kas Hücrelerinde Mikrotübül Ağlarının Görüntülenmesi

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Yazar Spotlight: Drosophila nöromüsküler kavşaklarında mikrotübül ağını anlamak 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler