We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

過去には、内および実験群間の形態学的変動はほとんど考慮されませんでした。しかし、定量的な方法の適用は、現在の形態および解剖学的な形態の数学的記述の比較研究におけるノルムが計算されますなってきています。定量の使用は、特定の細胞プロセスに対して遺伝子操作の影響を評価する際に分析し、形態学的変化を検出する能力を高める上で、これらの変更が記載されている精度を向上させるのに有望です。また、定量的データの統計分析は、私たちが表現型との間に観察された差が有意であるかどうかを評価することができます。 横紋筋では、核は明確な丸みを帯びた構造を示し、均等に筋線維に沿って分布しています。確立およびサイズ​​、形状および核の構造を維持する分子メカニズムは知られていないが、これらの核の特徴は、おそらく、TでありますO筋機能を制御する基本的な役割を果たしています。実際、いくつかの筋疾患は、筋肉内核の形態や位置を制御する遺伝子の変異によって引き起こされます。細胞内の核の形状及び分布の機能的重要性は、筋肉に限定されるものではありません。証拠を蓄積すると、核内の欠陥はまた、パーキンソン病18,24などの神経変性疾患と関連していることを示しています。さらに、当社は、小胞体とミトコンドリアを含む他の細胞小器官の形態、大きさや細胞内分布は、機能的結果を有していてもよいことを理解し始めています。例えば、ミトコンドリアの形態の変化は、視神経萎縮型-1（OPA1）とシャルコー・マリー・トゥースタイプ2Aの神経障害25などの神経障害に関連しています。 これらの重要なプロセスの根底にある分子メカニズムを解明するプロセスを支援するために、我々は、高解像度の共焦点を結合することを提案しますイメージングソフトウェアおよび形態計測を使用してデータを定量的操作は筋繊維内の形状、大きさ、および核の場所にどのように影響するかの遺伝子を評価するために分析します。一緒にショウジョウバエの幼虫における神経筋システムの高度紋切り自然とショウジョウバエ遺伝学のパワーと汎用性は、幼虫のNMJに分析のこのタイプのために特に適した実験モデルを作ります。幼虫のNMJでは、表現型分析はのNMJの数が同じフライ内で研究することができると同じであっても識別可能なNMJは、異なる遺伝子型3,4のハエとの間で比較することができ、正確な形態計測分析を可能にする単一シナプスの解像度で行うことができます。 ショウジョウバエ幼虫NMJにおける核の位置、形状、大きさの表現型の特徴は、筋肉内の筋肉と核をハイライト抗体を用いて解剖のNMJの免疫染色を行うことによって開始します。 THIで概説したプロトコルでsの紙、筋核は全体の筋肉を染色するDVAPする特異的核内部とを有する抗体を強調核マーカーで、ラミン、核膜のマーカーに対するポリクローナル抗体で染色しました。これらの実験で使用ラミン抗体は、親切にポールフィッシャー19~22によって提供されたが、抗ラミン抗体の代替源を使用することができます。さらに、核膜のための具体的な他の抗体の数は、市販されています。筋肉は抗アクチンまたは抗チューブリン抗体で染色して可視化することができながら、最後に、DAPIやヨウ化プロピジウム、核マーカーは、もご利用いただけます。この実験手順において使用されるもの以外の抗体が使用される場合、免疫染色プロトコルは、固定条件と新しい抗体の作業濃度を最適化する必要があるれる余分なステップを必要とします。このプロトコルにおける1つの重要なステップは、ボリュームレンダリングを分析する必要がある場合は特に、目でありますスライド上のサンプルの電子実装。この場合には、試験片が押しつぶさ取得しないように、スライドとカバーガラスの間にスペーサーを含めることが重要です。カバーガラスの両側にスライドに巻き付けセルローステープの3つのバンドは、スペーサーを作る簡単な方法を表します。 ImageJのは、2D画像のために用いたが、3Dマルチチャンネル画像のほとんどが、この論文で提示分析、理由は、その社内可用性のIMARISを使用して行われました。しかしながら、他の同様の市販のソフトウェアパッケージは、これらの用途に使用することができます。 いくつかのオープンソース（例えば、ImageJの、CellProfiler、Vaa3D、アイシー、KNIMEなど）と共焦点画像の分析に利用可能な商用ソフトウェアプラットフォームがあります。 ImageJの26、フィジー27として知られているNIHまたはそのより強化されたバージョンからのフリーソフトウェアは、世界的なイメージングcommuniために利用可能なインポートフィルタ、マクロやプラグインの数が多いですTY。これらのプラグインのほとんどは、スライス・バイ・スライス方法で情報を処理に焦点を当てています。マルチチャンネル3D画像の可視化と分析に利用可能なプラグインもあります。しかし、それらは多くの場合、特定のタスクのために設計されており、ユーザーが自分のニーズにこれらのプラグインを拡張したり、適応する必要があるかもしれません。一方、商用プラットフォームは、比較的経験の浅いユーザーをターゲットにし、多くの場合、信じられないほどの速度で画像処理タスクの容易に使用できる、広いカバレッジに焦点を当てています。 このプロトコルで概説定量的表現型解析と一緒に実験手順は、細胞小器官の形態および細胞内でのそれらの分布を制御する分子機構の解明に役立つことができます。しかしながら、このアプローチは、特定のエンドポイントでこれらのプロセスを分析する明らか限界があります。細胞小器官の形態および分布を制御するプロセスは非常に動的であるために、異なる細胞TYとの間だけでなく、変化させる可能性があります発達または生理学的状態に応じて、同じセル内のPESも。この分析のさらなる実装は、細胞小器官の形態及び位置の変化を経時的にモニターされることを可能にするタイムラプスイメージングによって表されることになります。

Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations. 
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems. 
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1. 
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.

<table><tbody><tr><td>Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11030-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard dissection plates&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>76103</td><td>Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 &amp;deg;C for at least 24 hr</td></tr><tr><td>Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors (ultra-fine)&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 7 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 130 mM NaCl, pH 7</td><td></td><td></td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (SIGMA-S8282), Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1)</td><td></td><td></td><td>Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)</td></tr><tr><td>1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Triton-X100. SIGMA-T8787</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Guinea Pig anti-DVAP antibody</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS</td></tr><tr><td>Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-065-021</td><td>Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Lamin antibody</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Molecular Probes</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-295G-A555-BSS</td><td>Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td></tr><tr><td>Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>bs-0358G-Cy3-BSS</td><td>Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium for fluorescence</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

why quantification matters: characterization of phenotypes at the drosophila larval neuromuscular junction

形態形成上のほとんどの研究は、特定の遺伝子と遺伝的経路の破壊によってどのように影響されるか、解剖学的特性の定性的な記述に依存しています。遺伝子操作は、表現型効果の範囲を生成し、変動があっても、対照群内の個体間に観察されるが、定量的な説明はほとんど、実行されません。新興の証拠は、細胞小器官の形態、大きさや位置が細胞の機能と生存の以前に過小評価、まだ基本的な役割を果たしていることを示しています。ここでは、 ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部（NMJ）で表現型の定量分析を実行するためのステップバイステップの手順を提供します。我々は、バイオイメージング技術と組み合わせて、いくつかの信頼性の免疫組織化学的マーカーを使用し、形態学的には、特定の細胞プロセス上の遺伝子変異の効果を調べるために分析します。特に、我々は、nの形態、大きさ及び位置に影響を与える表現型の定量分析に焦点を当てますショウジョウバエの幼虫の横紋筋肉内uclei。 ショウジョウバエ幼虫NMJは、健康と病気の両方の構造や神経筋システムの機能を、根底にある分子メカニズムを研究する貴重な実験モデルです。しかし、ここで説明する方法は、他のシステムに拡張することができます。

ALSは、具体的には横紋筋7の進行と致命的な麻痺につながる運動ニューロンに影響を与える変性疾患です。ヒトVAMP関連タンパク質B（hVAPB）におけるミスセンス変異は、ALSの種類8 8-12を含む運動ニューロン疾患の範囲を引き起こします。 hVAPB遺伝子におけるミスセンス変異（V234I）は、最近、ヒト13における典型的なALSの一つのケースで同定されています。その病原性の可能性を評価するために、我々は、疾患の原因となる変異（DVAP-V260I）を運ぶhVAPB ショウジョウバエオルソログDVAPを発現するトランスジェニックハエを生成しました。この導入遺伝子の発現は、UAS / GAL4系と筋固有のドライバのBG57-GAL4 14,15を使用して、筋肉を標的としました。 DVAP-V260Iトランスジェニック発現の効果を比較し、野生型DVAPタンパク質16の異なるレベルで発現する他の二つの導入遺伝子（DVAP-WT1とDVAP-WT2）、のそれに対比しました。モルeは具体的には、DVAP免疫反応性の増加は、同じ信号16のDVAP-V260IおよびDVAP-WT1の展示匹敵すると低いレベルながらDVAP-WT2ラインのコントロールに比べて2.2倍高いです。 核の変化は、加齢とパーキンソン病17,18を含むいくつかの神経変性疾患と関連しています。 ALS8のための私達のフライモデルが核アーキテクチャ、位置や大きさの変化を示しているかどうかを評価するために、我々は、核マーカーおよび核膜を可視化抗ラミン抗体19-22、との適切な遺伝子型の横紋筋肉内核を染色しました。筋肉を強調表示するには、DVAP特異的抗体はまた、同じ試料（ 図1）に加えました。共焦点画像を収集し、詳細な形態学的分析は、画像分析ソフトウェアを用いて行きました。対照筋において、核は均一に筋肉に沿って分布されることが見出されました筋肉を表現DVAP-V260IおよびDVAP-WTにいる間の繊維は、核が密接に関連したクラスター（ 図1）で再配布する傾向を示します。 我々は、すべての遺伝子型の筋線維に沿って核の分布を定量的に評価を行うために最近隣分析を行いました。最近隣分析は、最初に与えられた核の中心部や他のすべての周囲の核の中心との距離を測定することにより、すべての核のための最も近い隣人を識別します。この手順は、次いで、筋繊維に沿って他のすべての核に対して繰り返されます。最後に、特定の筋肉内の核との間の最短距離は、すべての核とその最も近い隣人の最短距離を平均することによって計算されます。 （ 図2A - C）。対照と比較して、DVAP-V260I導入遺伝子または導入遺伝子のいずれかのいずれかを発現する筋肉は、野生型タンパク質を過剰発現します、結果として、核が密接にクラスターに関連すると思われる、核間の平均最短距離の劇的な減少を提示し。アレルDVAP-V260Iを引き起こすALSの影響が最も強いDVAP-WT2導入遺伝子は、（ 図1および図2D）を用いる場合であっても、野生型タンパク質の過剰発現に関連したよりも深刻です。 DVAP-V260IまたはDVAP-WTのいずれかの導入遺伝子の過剰発現はまた、細長い構造（ 図1）と変形核で生じた核アーキテクチャの深刻な悪化を示します。この構造的収差は円形が式Cによって定義されたImageJソフトウェアを用いて定量しました。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53821/53821eq3.jpg" /> 、真円とC = 0無限に細長いポリゴンを表すC = 1とすべての核の長さの比に幅を測定します。 CONTRでトランスジェニック変異体では、円形の必然的損失を伴う形状の変化は、この値（ 図1及び図3）からの大きな逸脱を引き起こしながら、明確な丸い形状を呈するオール核は、Cは1に等しいです。 また、ALS原因対立遺伝子がDVAP-WT導入遺伝子（ 図4）と比較して、この表現型を誘導することで、より効率的であると思われるが、筋肉が同じ導入遺伝子の発現において、核は、対照と比較してマークされ、拡大核体積を表示することがわかりました。 ほぼすべての神経変性疾患は、病原性タンパク質を含有する凝集体の細胞内蓄積によって特徴付けられます。我々は、3D再構成および核のボリュームレンダリングを行ったし、我々は筋肉変異導入遺伝子を発現しているか、野生型タンパク質を過剰発現するには、DVAPの免疫反応性がクラスター形成されていることがわかっNDそれらのいくつかはまた、核（ 図5）に局在していること。逆に、コントロールのNMJで、DVAPの免疫反応性はかすかに筋線維全体に分散され、核16から除外されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig1.jpg" /> 図1：WT DVAP-またはDVAP-260Iの導入遺伝子のいずれかを発現する横紋筋肉内筋核の共焦点画像 （A）BG57-GAL4 / +コントロール、（B）BG57; DVAP-V260I、（C）BG57; DVAP-WT1。および（D）BG57;示された導入遺伝子を発現しているDVAP-WT2の筋肉は、DVAP（赤信号）に特異的な抗体で染色されたラミン（緑信号）と核（青色信号）を可視化するための核特異的マーカーです。スケールバー=30μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig1large.jpg" target="_blank">表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig2.jpg" /> 図2：核とその単一の最も近い隣接間の平均距離を決定するために、最も近い隣人分析 （B）代表的な結果は、（A）のコントロールと比較した場合、DVAP-WT2導入遺伝子を過剰発現する筋肉に変更された核の位置を示します。示された遺伝子型の筋肉の平均核の距離が（C）式を用いて推定し、データ（D）に報告されています。幼虫のNMJは、DVAP（赤信号）に特異的な抗体で染色したラミン（緑）、核マーカー（青色信号）とされています。アスタリスクは統計的有意性を示しています。 *** P &lt;0.001、** P &lt;0.01。この実験の統計分析とANOVA検定を使用した一方向およびTukeyのmultipの下に報告されたすべての実験について遺伝子型間の差異は、ANOVA試験により有意であることが判明した場合ルの比較試験は、事後検定として適用しました。エラーバーはSEMを表します。スケールバー=30μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig3.jpg" /> 図 3： 核体積の計算における代表的なステップを示す画像 （A）表面作成ウィザードを使用してセグメント化された核を示す代表的な画像。画像の境界で核が無視されました。周囲のDVAP染色後の核DVAP信号を示す（B）の画像は、核マーカーチャネルで作成した表面を使用することによりマスクされています。 （C）表面層は、追加のパラメータの情報を提供します核体積及び球形度を含みます。様々な遺伝子型の核ボリューム上の（D）データ。アスタリスクは統計的有意性を示しています。切開のNMJ抗DVAP抗体（赤シグナル）、抗ラミン抗体（緑色シグナル）および核マーカー（青色信号）で染色しました。 *** P &lt;0.001、** P &lt;0.01。エラーバーはSEMを表します。スケールバー=30μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig4.jpg" /> 図4：ImageJ のによる核形状の推定における代表的なステップを示す画像。 &#160;&#160;画像の最大強度投影は、筋肉内の核の真円度を推定するためのImageJを用いて分析しました。 （A）投影の代表例プロトコルのステップ7.9のように、3チャネル画像の。 （B）チャネルが分割され、核マーカーチャネルが選択されたプロトコルのステップ7.10を示す画像。 （C）セグメントにImageJの中の核とROIマネージャープラグインを強度閾値を適用した後、関心のあるすべての核が選択することができ、その形状は、形状記述子を介して測定していることを示す代表的な画像（7.11から7.15ステップ）。 （D）は、種々の遺伝子型の円形の定量。緑が核を概説し、ラミン染色に対応している幼虫のNMJで、赤信号はDVAP染色を示しています。すべての核の内部が原因で核マーカーでの染色に青色で標識されています。アスタリスクは統計的有意性を示しています。 *** P &lt;0.001、** P &lt;0.01。エラーバーはSEMを表します。スケールバー=30μmの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig4large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>eは、この図の拡大版を表示します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53821/53821fig5.jpg" /> 図5：筋核のボリュームレンダリングの作成 ​​で特定のステップを示す画像 。 （A）DVAPタンパク質（赤）、ラミン（緑）、DNAマーカー（青色）で染色した筋肉の3D強度ブレンドビューを示す画像。 （B）セグメントに核ラミンチャネルを使用して生成された表面層を表す画像。 （C）表面層を選択核外DVAP信号をマスクするために使用された核を表す画像。黄色でハイライト表示は画像に追加されたクリッピング平面です。ビューと位置のその角度は、対話的に核の内部信号の分布を可視化するために調節することができます。 （D）USIを作成した核の表面層の断面図を報告画像ngのラミンチャンネルがマスクされていないDVAPと核マーカー信号と合併しました。 （EおよびF）は、同じ核の追加の区分ボリュームレンダリング。スケールバー=10μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53821/53821fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

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Research

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Neuroscience

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

8.1K ビュー.  University of Edinburgh. Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques. 

ビデオ: Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

神経科学

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

生物学

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

ショウジョウバエの神経筋接合部および筋細胞における微小管ネットワークの表示

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

著者スポットライト:ショウジョウバエの神経筋接合部における微小管ネットワークの理解 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション

要約

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この動画の章

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出するショウジョウバエ成脚の解剖と免疫染色

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション

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で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出するショウジョウバエ成脚の解剖と免疫染色