The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

<ol>
	<li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes.">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li><li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.:+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere?.">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?.</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li><li>McCormick, J. R., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development.">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li><li>Fl&#228;rdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces.">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li><li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ser/Thr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces.">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li><li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth.">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li><li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces.">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li><li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ.">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li><li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles.">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li><li>Grantcharova, N., Lustig, U., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li><li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria.">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).</li><li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor.">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li><li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li><li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation.">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li><li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+control+of+cell+division:+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces.">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li><li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures.">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li><li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma(BldN)+and+a+cognate+anti-sigma+factor,+RsbN.">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li><li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development.">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).</li><li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+aerial+growth,+cell+division,+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae.">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li><li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development.">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li><li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-L&#242;pez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis.">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).</li><li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS.">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li><li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria.">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li><li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum.">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078 (2013).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li><li>Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ.">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li><li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+(TopA)+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation.">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

كان الوقت الفاصل بين المجهري دورة حياة السبحية تحديا تقنيا في الماضي. هنا نقدم بروتوكول قوية لأداء التصوير الخلية الحية من دورة حياة كاملة باستخدام اندماج بروتين فلوري إلى DivIVA علامة الخلية القطبية والبروتين انقسام الخلايا بروتين زد للمساعدة في تصور وتتبع التقدم من خلال البرنامج التنموي (الشكل 2). المركزية إلى هذا الأسلوب هو زراعة س. venezuelae في جهاز ميكروفلويديك التي تسمح نضح المتوسط ​​المستمر وتبادل المتوسطة النمو الطبيعي (حركة الشباب المجاهدين-TE) مع المتوسط ​​أمضى (قضى حركة الشباب المجاهدين-TE). تغيير حالة الثقافة مهم للبروتوكول وصفها لأن بالاستعداد الغذائية والآبار وأي إشارات الخلية لم تحدد هويتهم بعد (على سبيل المثال النصاب الاستشعار إشارات) في مستنبت قضى، وتعزيز تبوغ، في حين أن إمدادات مستمرة من المتوسط ​​الغنية بالمغذيات يحفز growt الخضريح مع أي تشكيل بوغ (لا تظهر البيانات). وهكذا، زراعة الخلايا في هذا النظام ميكروفلويديك متفوقة لزراعة الخلايا على الاغاروز لأنه يوفر مرونة أكثر التجريبية ويتيح رصد طويل الأجل للتغيرات في نمو البكتيريا في استجابة لتغير الظروف والثقافة. على الرغم من أن لوحات ميكروفلويديك مصممة للاستخدام مرة واحدة فقط، وتدفق القنوات التي لم يتم تلقيح مع خلايا يمكن استخدامها في تجارب لاحقة. ننصحك باستخدام جميع قنوات لوحة ميكروفلويديك في غضون أسبوع، ونحن قد واجهت مشاكل ختم متعددة للوحات التي تم فتحها لمرات أطول. عند إعداد التجربة، وجدنا أن طازجة جراثيم نبتت في غضون سنتين ساعة من يجري تحميلها في غرفة التدفق، في حين جراثيم المستمدة من المخزون الجلسرين المجمدة المطلوبة لا يقل عن 6 ساعة قبل ظهر الأنابيب الجرثومية (لا تظهر البيانات). هذا التأخير في إنبات يمتد طول التجربة ويمكن أن تتداخل معتوافر المعدات والظروف التجريبية. ومن المهم أيضا أن تبدأ التجربة مع نضح من حركة الشباب المجاهدين-TE لا يقل عن 3 ساعة لتوفير المواد الغذائية الكافية لتطوير ونمو أنابيب الجرثومية. نضح مع حركة الشباب المجاهدين-TE ويمكن تمديد يتجاوز 3 ساعة الأولية إذا تم تصميم التجربة لدراسة النمو الخضري. بينما توفر جراثيم الخيار المفضل البدء المواد، شظايا القصير خوطي كما يمكن تحميلها في لوحة ميكروفلويديك. ومع ذلك، فإن كفاءة التحميل عند استخدام أفطورة المنفصمة مهم أقل، وغالبا ما يتطلب عدة أشواط التحميل والتي قد تشكل القيد عند فحص المسوخ غير sporulating. بغض النظر عن نوع اللقاح المستخدم، فمن المهم أن لا تفرط في غرفة الثقافة بجراثيم أو شظايا خوطي لأن ذلك سوف يؤدي إلى اكتظاظ السريع التي يمكن أن تتداخل مع انتشار وسائل الإعلام وتعقيد تحليل الصور. من المهم التخطيط لبناء البروتينات مراسل يتنبهLLY للاستخدام في مضان الوقت الفاصل بين التصوير في السبحية. طول رابط بين بروتين الهدف ومراسل الفلورسنت واختيار N- أو اندماج C-محطة يمكن أن تكون حاسمة. وعلاوة على ذلك، الظروف التجريبية الأمثل، بما في ذلك تردد التصوير ووقت التعرض، ويجب أن يتم تحديد مقدما لكل البروتين fluorescently الموسومة. س. venezuelae خيوط معرض لصناعة السيارات في مضان في القناة أخضر / أصفر التي قد تصبح مشكلة عندما التصوير البروتين fluorescently المسمى التي يتم التعبير عند مستويات منخفضة. وبالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه خلال إنبات ومرحلة النمو الخضري الأولية، S. venezuelae حساسة بشكل خاص للضوء الطول الموجي القصير (على سبيل المثال عند استخدام اندماج البروتين لCFP). وعلى الرغم من التقدم المستمر في تقنيات التصوير وأنظمة مراسل الفلورية للتصوير الخلايا الحية من البكتيريا، أكثر من حزم البرامج (مثل MicrobeTracker، Schnitzelcملتعلمي اللغة اإلنكليزية، CellProfiler) للمعالجة الآلية لاحق من هذه الأنواع من مجموعات البيانات لا تدعم تحليل الصور المستمدة من البكتيريا الخيطية مع نمط الحياة متعددة الخلايا 27-29. وبالتالي، هناك حاجة إلى تطوير الخوارزمية المناسبة لتحليل الإنتاجية العالية الكمي للبيانات التصوير من السبحية والبكتيريا الخيطية أخرى. وباختصار، فإن العمل الموصوفة هنا يوضح الإمكانات الهائلة س venezuelae كنظام التنموي نموذج جديد للجنس، بسبب قدرتها على sporulate في السائل. الجهاز زراعة ميكروفلويديك بسيط الاستخدام حتى بالنسبة للمستخدمين عديمي الخبرة. أنه يوفر منصة ممتازة لدراسة العمليات البيولوجية الخلية المركزية لدورة الحياة السبحية، بما في ذلك توطين دينامية البروتين والنمو الاستقطاب، والتفريق الصرفي من أفطورة متعددة الخلايا في سلاسل من الجراثيم unigenomic. وبالإضافة إلى ذلك وضعت هذا التجريبية شكما يوفر ص نقطة انطلاق مغرية للتحقيق في الأحداث في التنمية التي تتطلب بالتناوب الظروف والثقافة، أو استخدام الأصباغ الفلورية مثل الأحماض D الفلورسنت -amino لمراقبة تركيب ببتيدوغليكان أو يوديد propidium و 4 &quot;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) لتصور منظمة كروموسوم 30،31.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes هي البكتيريا التي تعيش في التربة التي تتميز بها دورة التنموية المعقدة التي تنطوي على تمييز الصرفي من ذلك، أفطورة متعددة الخلايا، مسح المغذيات إلى نائمة، جراثيم unigenomic 1-3. في ظل ظروف النمو المواتية، يبدأ بوغ نموذجية السبحية لتنبت قذف واحد أو اثنين من أنابيب الجرثومية (الشكل 1). هذه الأنابيب استطال استطرادا طرف وتنمو لتصبح شبكة خوطي متفرعة المعروفة باسم أفطورة الخضري. يتم توجيه النمو القطبي والمتفرعة خوطي من قبل DivIVA البروتين ضروري. هذا البروتين ملفوف لفائف هو جزء من مجمع حشوية كبير يسمى polarisome، وهو أمر حاسم لإدخال مواد جديدة خلية المغلف في الطرف تمتد 4-7. خلال النمو الخضري، وخيوط خوطي تصبح مجزأة عن طريق تشكيل نادرة من ما يسمى عبر الجدران 8. تشكيل هذه الجدران عبر إعادة<html> ملازم بروتين زد، البروتين مثل تويولين هيكل الخلية التي لا غنى عنها لانقسام الخلايا في معظم البكتيريا 9. في السبحية، ولكن هذه الخضري عبر الجدران لا تؤدي إلى انقباض وخلية خلية الانفصال، وبالتالي يبقى كتلة فطر كشبكة من المقصورات المخلوي مترابطة. وردا على الحد من المغذيات والإشارات الأخرى التي ليست مفهومة جيدا، خيوط جوي متخصص كسر بعيدا عن أفطورة الخضري وتنمو في الهواء 3. تشييد هذه الهياكل يبدأ المرحلة الإنجابية للتنمية، وخلالها خيوط الجوي متعدد الجيني طويلة تصبح مقسمة إلى عشرات متساوية الحجم مقصورات prespore unigenomic. هو الدافع وراء هذا الحدث انقسام الخلايا الهائل من انقباض متزامن من حلقات بروتين زد متعددة داخل واحد 2،10 خيوط مولد الأبواغ. اكتمال التمايز الصرفي من قبل الافراج عن نائمة، وجراثيم المصطبغة سميكة الجدران. ر &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> الشكل 1: والسبحية دورة الحياة على وسائل الاعلام الصلبة وهذا هو نموذج من دورة الحياة تقوم على أساس الدراسات الكلاسيكية من S. coelicolor المتزايد على لوحات أجار. تطوير الخلوية من الجراثيم تبدأ مع تشكيل واحد أو اثنين من أنابيب الجرثومية، التي تنمو استطرادا طرف لتشكيل شبكة من خيوط المتفرعة. يتم توجيه النمو القطبي والمتفرعة من خيوط الخضري بواسطة DivIVA (الحمراء). تشكيل الخضري الجدران عبر يتطلب بروتين زد (الخضراء). وردا على قيود المغذيات وإشارات أخرى، تقام خيوط الجوي. ويتم تنسيق القبض على النمو الجوي بشكل وثيق مع الجمعية من سلم من بروتين زد الحلقات، التي تؤدي إلى الحاجز تبوغ أن تجزئة للخيوط مولد الأبواغ إلى مربع يشبه المقصورات prespore. هذه المقصورات تجميع جدار بوغ سميكة وهي relea في نهاية المطافالحوار الاقتصادي الاستراتيجي جراثيم المصطبغة الناضجة. أحداث التنموية الرئيسية في دورة الحياة السبحية تتميز بشكل جيد 1،3. ومع ذلك، ما يزال نادرة هي الخلايا البيولوجية الدراسات التي تستخدم مضان الوقت الفاصل بين المجهري لتوفير نظرة ثاقبة على العمليات التي تقوم عليها التحت خلوية التمايز، مثل ديناميات البروتين التوطين والحركة كروموسوم وانقسام الخلايا تسيطر تنمويا. وقد تم التصوير تعيش خلايا التنمية السبحية صعبة بسبب تعقيد دورة الحياة والخصائص الفسيولوجية للكائن الحي. وقد استخدمت الدراسات السابقة على النمو الخضري والمراحل الأولى من تحوجز تبوغ غرف التصوير الأكسجين منفذة، أو نمو المدعومة الاغاروز من السبحية coelicolor على خشبة المسرح المجهر 11-15. هذه الطرق، ومع ذلك، محدودة بسبب عدد من العوامل. بعض الأنظمة لا تسمح التصوير على المدى القصير من النمو الخلويد البروتينات الفلورية قبل خلايا تعاني من عدم كفاية إمدادات الأوكسجين أو تنمو من طائرة الوصل بسبب نمط ثلاثي الأبعاد للتنمية خوطي. في الحالات التي يكون فيها التصوير على المدى الطويل هو ممكن، وزراعة الخلايا على منصات الاغاروز حدود المرونة التجريبية لأن الخلايا لا يمكن أن تتعرض لظروف النمو أو الإجهاد البديلة، ومضان الخلفية من المتوسط ​​في منصات الاغاروز يحد بشدة من قدرة على رصد أضعف الفلورسنت إشارات. نحن هنا تصف بروتوكول للتصوير الخلايا الحية من دورة الحياة الكاملة السبحية بدقة ممتازة وحساسية. من خلال زراعة السبحية في جهاز ميكروفلويديك متصلة مضان widefield المجهر (الشكل 2)، ونحن الآن قادرون على رصد الإنبات والنمو الخضري وتحوجز تبوغ على مدى فترة زمنية تصل إلى 30 ساعة. ومما يسهل هذا كثيرا من استخدام السبحية نموذج حي الجديدة </م&gt; venezuelae لأنه sporulates إلى قرب الانتهاء في الثقافة المغمورة، وبالتالي يتغلب على الحد من الأنواع النموذج الكلاسيكي س. coelicolor، التي sporulates فقط على وسائل الاعلام الصلبة 16-20. للمساعدة في تصور النمو الخضري وتبوغ، شاركنا في التعبير عن الموسومة fluorescently إصدارات DivIVA علامة الخلية القطبية والمفتاح البروتين انقسام الخلايا بروتين زد. نحن نستخدم جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا التي استخدمت بنجاح لالمتفطرات، كولاي، الوتدية glutamicum، العصوية الرقيقة والخميرة 21-25. نظام الفخاخ الخلايا في المستوى البؤري واحدة، وتتيح للسيطرة نضح المستمر من مستنبت من مختلف الخزانات. في بروتوكول مفصلة علينا أن نستفيد من هذه الميزة لفضح س. venezuelae أفطورة الخضري إلى بالاستعداد الغذائية لتعزيز تبوغ. بروتوكول ديمكتوب هو للتصوير الخلايا الحية من دورة حياة السبحية بأكملها، ولكن الظروف وسائل الإعلام البديلة أو إعدادات المجهر ويمكن اختيار إذا مراحل نمو محددة ذات أهمية خاصة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> الشكل 2: رسم تخطيطي تصور التجريبي تدفق العمل. وتظهر الخطوات الرئيسية الثلاثة المذكورة في البروتوكول. أولا، يتم إعداد الجراثيم والمتوسطة أمضى من ثقافة مرحلة ثابتة. ثانيا، يتم تحميل جراثيم جديدة في نظام ميكروفلويديك وس. والتقط venezuelae طوال دورة حياتها التنموية باستخدام المجهر المقلوب مؤتمتة بالكامل مع غرفة الحضانة للحفاظ على درجة حرارة النمو المثلى. ثالثا، تحليل السلاسل الزمنية الفاصل بين الحصول على ومعالجتها باستخدام برمجيات المصدر المفتوح فيجي.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Microfluidic culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411857-9061-000</td>
			<td>Environmental chamber surrounding the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocra FLASH 4 V2</td>
			<td>Hamamatsu Photonics K.K.</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator HXP 120V</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>423013-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489046-9901-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489063-0000-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1272-644</td>
			<td>Stage holder for microfluidic plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>Microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/Positions</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open-source software package</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Generation of time-lapse movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 
			4 g Maltose 
			4 g Yeast extract 
			10 g Malt extract 
			add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2 Trace element solution (TE) 
			8 mg ZnCl2 
			40 mg FeCl3-6H2O 
			2 mg CuCl2-2H2O 
			2 mg MnCl2-4H2O 
			2 mg Na2B4O7-10H2O 
			2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O 
			add 200 ml H2O 
			Autoclave and store at 4 oC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.002 volumes to MYM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Satorius stedim</td>
			<td>16532-K</td>
			<td>Preparation of spent MYM-TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV60</td>
			<td>John Innes Centre strain collection</td>
			<td></td>
			<td>S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

الناجح التصوير الخلية الحية من S. كامل دورة الحياة venezuelae غلة مستمر السلاسل الزمنية بما في ذلك مراحل النمو الرئيسية للإنبات والنمو الخضري وتبوغ (الشكل 3، فيلم 1). ومما يعزز التصور للتطور من خلال دورة حياة أبعد من ذلك توطين التحت خلوية متميزة من DivIVA-mCherry وبروتين زد-YPet. أثناء الإنبات والنمو الخضري، DivIVA-mCherry يتراكم على وجه الحصر في تزايد نصائح خوطي أو علامات تشكيل حديثا نقاط فرع الشكل (4A). هذه النتائج تتماشى مع المواقع التحت خلوية ذكرت سابقا من DivIVA 12،26. في المقابل، بروتين زد-YPet تشكل هياكل تشبه حلقة واحدة على فترات غير منتظمة في المشيجة تبعها (الشكل 4B). وتوفر هذه الهياكل السقالة لتركيب غير التضييقية الخضري الجدران عبر، مما يؤدي إلى تشكيل interconnالمقصورات خوطي ECTED 8. وتمايز الخلايا على النمو خيوط في خيوط مولد الأبواغ تصبح مرئية من قبل اختفاء القطبية بؤر DivIVA-mCherry، القبض على النمو القطبي ويصاحب ذلك زيادة في بروتين زد-YPet مضان (الشكل 4C). في sporulating خيوط، ونمط توطين بروتين زد-YPet يتغير بشكل كبير. الأولى حلزونية خيوط بروتين زد-YPet تعثر على طول خوط وبعد ذلك، في المفاجئ، حدث متزامن تقريبا، وهذه اللوالب تتجمع في سلم متباعدة بصورة منتظمة حلقات بروتين زد-YPet. في ظل الظروف التجريبية الموصوفة هنا، هذه موزعة بالتساوي سلالم بروتين زد-YPet تستمر لحوالي 2 ساعة. وأخيرا، تبوغ الحاجز تصبح مميزا في المقابل تدخل الفرق (DIC) صور (الشكل 4D) وفي النهاية يتم الافراج عن جراثيم جديدة. بروتوكول لاحق واصفا معالجة الصور باستخدام تنص على البرنامج فيجي<html> تيب بخطوة شرح لكيفية إنتاج فيلم للنشر من سلسلة مرور الزمن المكتسب (فيلم 1). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> الشكل (3): صور لقطة من ممثل الوقت الفاصل بين مضان المجهر سلسلة من س. venezuelae إنتاج fluorescently المسمى بروتين زد (الخضراء) وDivIVA (الأحمر) أظهرت هي إطارات مختارة من الصور المدمجة (أعلى لوحة: طلب تقديم العروض-YFP-مدينة دبي للإنترنت، أسفل لوحة: DIC). تصور دورة حياة السبحية بما في ذلك الإنبات والنمو الخضري والتجرثم. وقد أخذت صور من الفيلم 1. الوقت في ساعة: دقيقة. على نطاق والحانات = 5 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> د / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; الشكل 4: نتائج الممثل لنجاح سلسلة الوقت الفاصل بين دورة حياة السبحية (A) توطين DivIVA-mCherry. المعروضة هي لقطات من يومين النقاط الزمنية اللاحقة من الفيلم 1 مع الصور المدمجة من طلب تقديم العروض والقنوات مدينة دبي للإنترنت. يصادف DivIVA-mCherry مواقع فرع خوطي الجديدة (شغل في رأس السهم) ويموضع في الطرف خوطي لتوجيه النمو القطبي (مفتوحة رأس السهم). شريط مقياس = 10 ميكرومتر (ب) بروتين زد-YPet توطين خلال النمو الخضري (رأس السهم). بروتين زد-YPet تشكل هياكل تشبه حلقة واحدة (لوحة العليا) التي لا انقباض (DIC، اللوحة السفلى). (C) بروتين زد-YPet (الأخضر) توطين خلال تحوجز تبوغ. وتظهر بؤر DivIVA-mCherry باللون الأحمر، مع الوقت المنقضي يصور أدناه (ساعة: دقيقة). مقياس شريط: 5 ميكرون. (D) الموافق صور مدينة دبي للإنترنت من خيوط sporulating من (C) والتي تبين شكلأوجه من المقصورات prespore مع الحاجز تبوغ مرئية (الصورة اليسرى)، والتي تستحق في نهاية المطاف إلى سلسلة من الجراثيم (الصورة اليمنى). الوقت في ساعة: دقيقة. مقياس شريط = 5 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="إطار من الفيلم 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> فيلم 1: الوقت الفاصل بين مضان المجهر سلسلة من السبحية venezuelae دورة الحياة ويتكون الفيلم من صور-طلب تقديم العروض YFP المدمجة (يسار) والمقابلة تدخل الفرق المقابل (DIC) صور (يمين). يظهر DivIVA-mCherry في الحمراء وبروتين زد-YPet باللون الأخضر. الفاصل الزمني بين الإطارات واحدة 40 دقيقة. شريط النطاق = 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض ثي</a>الصورة الفيلم.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

مضان الوقت الفاصل بين التصوير من كامل<em&gt; S. venezuelae</em&gt; دورة الحياة عن طريق جهاز ميكروفلويديك

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.7K Views.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Video: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام &#39;جينوم فيروس واحد&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

غير الغازية<em&gt; في فيفو</em&gt; الإسفار التصوير البصري من مب النشاط التهابات باستخدام عامل التصوير الفلورسنت أكتيفاتابل

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...