Name: fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

Taze S. 1. İzolasyonu venezuelae Sporlar ve kültür aracı maddesinin hazırlanması <ol><li> DivIVA mCherry P ftsZ - gerilme SV60 yanda sayılan [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA 10 ul sporlarla, 60 ul R2 eser element solüsyonu (TE) ile desteklenmiş 30 ml maltoz-Maya Özü-Malt Extract aşılamak (MYM) orta, -ftsZ-ypet)]. istikrarlı büyüme ve hücre sporülasyonun için bir şaşkın şişeyi ya da yeterli havalandırma sağlamak için bir bahar içeren bir şişesi kullanın. </li><li> 30 ° C&#39;de 35-40 saat ve 250 rpm&#39;de Kültür hücreleri. </li><li> Sıvı monte faz-kontrast mikroskobu ile hücrelerin inceleyin. Bu noktada misel parçaları ve sporlar görünür olacaktır. </li><li> Santrifüj 1 dakika boyunca 400 x g&#39;de bir masa üstü santrifüjü içinde 1 ml hücre misel ve büyük hücre fragmanları pelet. </li><li> Yaklaşık 300 ul süpernatant co aktarınyeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe bir spor süspansiyonunun ntaining ve buz üzerinde tutun. Aşama 1.7 kalan kültür ortamı tutun. </li><li> Sporlar MYM-TE içinde 1:20 seyreltilir (nihai konsantrasyon: 0.5-5 x 10 7 spor / ml) ve gerektiği kadar buz üzerinde tutulur (adım 2.3). Not: Streptomyces içinde sporlanmasını tetikleyen tam koşullar, bir sporlanan kültürden herhangi bir bilinmeyen hücre dışı sinyaller dahil olmak üzere, harcanan MYM-TE ortamı kullanılarak, anlaşılmamış olmakla birlikte, sporulasyonunu uyarır. </li><li> sporlar ve miselial parçalar içermez MYM-TE harcanan olarak ulaşmak için kalan kültür ortamında 10 ml filtre sterilize. steril 0.22 mikron şırınga filtresi kullanın ve transfer steril 15 ml tüp MYM-TE geçirdi. </li><li> Benzer büyüme koşulları kullanılarak ek deneyler yapılacak ise 4 ° C&#39;de birkaç gün için hazırlanan harcanan MYM-TE tutun. </li></ol> Mikroakışkan Aygıt 2. Hazırlık Not: Her mikroakışkan plaTe gerçekleştirilebilir dört bağımsız deneyde kadar sağlar. bir deney kurarken kullanılmayan akış odaları kirlenmesini önlemek için, steril çözümler ve çalışma koşullarını kullanın. <ol><li> mikroakışkan plakadan nakliye çözüm çıkarın ve steril MYM-TE ile kuyu durulayın. </li><li> 300 ul MYM-TE 6 kuyular 2 iyi 1 ve 300 ul geçirdi MYM-TE girişine ekle. </li><li> Yük 40 ul şerit &quot;A&quot; hücre yükleme oyuk 8 adım 1.6 sporların seyreltildi ve uygun plaka manifold üretici talimatlarına mühür. </li><li> , Mikroakiskan kontrol yazılımı başlatmak uygun plaka türünü seçin ve oyuk başına 2 dakika süreyle 6 psi 5&#39;e giriş kuyulardan akan ortamı tarafından 1 asal akış kanalı ve kültür odasına bir akış programı kurmak. </li><li> Çimlenme ve hücrelerin vejetatif büyüme sağlamak için 6 saat süreyle giriş kuyusundan 1 MYM-TE akan: Mikroakiskan kontrol yazılımı olarak, deney için bir akış protokolü oluşturmak. anahtarDaha sonra deney kalan süre için de 2 ila 5 harcanan MYM-TE perfüzyon için. Deney sırasında (yaklaşık 9 ul ortam / saat karşılık gelir) 6 psi akış basıncı sabit tutmak. Adım 3.5 sonra akış programını başlatın. </li></ol> Mikroskop ve Time-lapse Protokolün 3. Kurma Not: Bu yöntem, bir sCMOS kamera, bir metal-halojen lamba, bir donanım otofokus, 96 oyuklu plakalar için bir sahne tutucu ve bir çevre bölmesi ile donatılmış bir tam motorlu ve otomatik ters Geniş açılı, mikroskop uygulanmıştır. <ol><li> deney başladıktan sonra otofokus sorunları önlemek amacıyla önceden 30 ° C çevre odasının ön ısıtmak. gerekli süre kullanılan çevre odasında, mikroskop ve ısıtma sistemine bağlıdır. deneyden önce sistem gece ısınmaya başlar. </li><li> mikroskop ve mikroskop otomasyon ve kontrol softwa açınyeniden. Böyle bir 100X, 1.46 NA yağı DIC hedef olarak optimal sinyal toplama ve uzaysal çözünürlüğü, yüksek bir sayısal açıklık (NA) immersiyon yağı hedefi kullanın. Sarı-floresan ve kırmızı floresan proteini füzyonlarının diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri ve görüntüleri elde etmek için uygun filtre ve iki renkli aynalar seçin. </li><li> amaç üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve görüntü alımı sırasında hücre odağı artırmak için mikroakışkan plaka üzerinde görüntüleme penceresinin altına daldırma sıvısı ekleyin. Dikkatle ters mikroskop sahneye mühürlü mikroakışkan cihaz (adım 2.5) monte edin. plaka güvenli sahne tutucu yerleştirilir ve deney boyunca kayma olmadığından emin olun. </li><li> yönlendirme için gömülü pozisyon işaretlerini kullanarak odak haline mikroakışkan kültür odasının görüntüleme penceresini getirin. ilk akış odasının soldaki kısmına odaklanın karşılık, tuzak büyüklüğü 5 ile ( &quot;A&quot; etiketli)0.7 mikron bir tuzak yüksekliği. </li><li> Mikroakiskan yazılımında, giriş kuyudan 8 den yük hücreleri 15 saniye boyunca 4 psi. görüntüleme penceresi boyunca sahne hareket ettirerek kültür odasında hücre yoğunluğu kontrol edin. Hiçbir sporların sıkışıp olsaydı, hücre yükleme adımı tekrarlayın veya alternatif istenilen hücre yoğunluğu (2.048 x 2.048 piksel görüntüleme penceresi başına 1-10 sporları) elde edilene kadar yükleme basıncı ve / veya süresini artırın. kültür odasını aşırı yüklemekten kaçının. Biz normalde Streptomyces görüntüleme için tuzak boyutu 5 kullanın, ama biz de 4 ve 3 hücreli yükleme işlemini optimize etmek konusunda ek öneriler için tedarikçinin kılavuzuna başvurun boyutları tuzağı ile iyi sonuçlar elde edilmiştir: Not. </li><li> Adım 2.5 kontrol yazılımı akış programını başlatın ve mikroakışkan plaka görüntü toplama başlamadan önce mikroskop aşamasında 1 saat ısı-gelmesini sağlayınız. </li><li> mikroskop kontrol yazılımı, mu almak için çok boyutlu bir satın kurmakzamanla çok kademeli pozisyonlarda ltiple görüntüleri: <ol><li> Autosave için: resim dosyalarının otomatik tasarrufu için dizini belirtin. </li><li> Aydınlatma ayarları için, önceden her özel yapı için en uygun aydınlatma ayarlarını belirlemek. DIC 150 msn, YFP 250 msn, RFP 100 msn: özetlenen deney için aşağıdaki pozlama süreleri kullanın. </li><li> Zaman serisi için: sırayla istenilen zaman noktalarında görüntüler elde etmek için bir zaman serisi kurdu. S. yaşam döngüsünü görüntülenmesi için venezuelae, 24 saatlik bir süre boyunca 40 dakikalık bir zaman aralığını seçin. </li><li> Sahne pozisyonları ve otomatik odaklama için: ilgi her görüntüleme konumu için sahne ve mağaza sahne pozisyonları hareket ettirerek kültür odasına tarayın. tek kademeli pozisyonları yeterince ayrı photobleaching ve phototoxicity.Typically 12 pozisyonları kadar kullanabilirsiniz aza indirmek için yer olduğundan emin olun. Her zaman noktası için çalıştırın otomatik odaklama rutin yavaş odak kayması düzeltmek için. Eğer mikroskop kontrol yazılımı mevcut&quot;Donanım otofokus yerel yüzey güncelleme&quot; olarak ayarlayın otofokus stratejisi. Seçilen sahne pozisyonların Z koordinatları doğrulandıktan sonra, donanım otofokus etkinleştirin. </li></ol></li><li> mikroskop kontrol yazılımı time-lapse deney başlatın. </li><li> Tüm sahne pozisyonları daha sonraki noktalarda odak hala olup olmadığını kontrol edin. otofokus kullanırken birkaç saat içinde çalışan time-lapse deneyler için, zaman zaman hatta bir sahne sürüklenme gözlemlemek. sahne pozisyonları odakladı gerekiyorsa, uygun bir zaman noktasında denemeyi durdurmak Odağı ayarlamak ve tanımlı görüntüleme zaman aralığının (adım 3.7.3) içinde denemeyi yeniden başlatın. Zaman serisi bağlamak için nasıl adım 4.3&#39;e bakın. </li><li> 24-30 saat sonra görüntü elde etme durdurmak veya ilgi bölgedeki hif sporları içine farklılaşmış zaman (DIC görüntü serisi bakınız). Yazılımın akış programı durdurmak ve mikroakışkan cihaz demonte. </li><li> Kısa vadeli sto için kullanılan mikroakışkan tabak hazırlayınöfke. MYM-TE kalan çıkarın ve 6 kuyusundan 1 MYM-TE geçirdi boş atık kuyu 7 ve steril koşullar altında hücre yükleme kuyu 8. yeniden dolum için şeritli &quot;A&quot; kuyu ve kullanılmayan hatlarının kuyular ( &quot;B&quot; kullanılmıştır steril fosfat tamponlu salin ile plaka üzerinde, &quot;D&quot;), (PBS). 4 ° C&#39;de ve mağaza kurumasını önlemek için parafilm plaka mühür. </li></ol> Fiji Yazılım Kullanma Time-lapse Filmler 4. Nesil Not: farklı ticari ve özgür yazılım paketleri ZenBlue, Metamorph, Icy, ImagePro veya ImageJ dahil time-lapse mikroskopi görüntüleri işlemek için kullanılabilir olduğunu unutmayın. Burada bir açık kaynak görüntü işleme ImageJ dayalı bir program ve hangi zaten yararlı önceden yüklenmiş eklentileri bir dizi sağlar olan Fiji, odaklanmak. <ol><li> Fiji yüklü olduğu bir bilgisayara time-lapse deney transfer görüntüleme verileri. </li><li> programı başlatın ve &amp; kullanarak görüntüleme dosyasını içe# 34; Dosya&gt; İçe Aktar&gt; Biyo-Biçimleri &quot;. Ya da basitçe Fiji içine görüntüleme dosyasını sürükleyerek&quot; Biyo-Biçimleri İthalat Seçenekleri her aydınlatma kanalı için ayrı bir görüntü yığını elde etmek için bölünmüş kanallar &quot;&quot;, kutuyu işaretleyin &quot;(DIC , RFP, YFP). </li><li> İsteğe bağlı: (DIC, RFP, YFP her kanal için, bağlı refocusing (adım 3.9) görüntü edinimi bir mola kaynaklanan ayrı zaman serisi birleştirme ilgili görüntü yığınlarını açmak ve çalıştırmak &quot;Image&gt; Yığınlar&gt; Araçlar&gt; Concatenate&quot; için ). </li><li> görüntü yığınlarından gezinerek zaman atlamalı veri kalitesini değerlendirmek. zamanla odak kaldı hifler, gösteri misel büyüme için bakmak ve sonunda sporlar (DIC yığını) oluştururlar. sırasıyla, bitkisel ya da sporogenic hifler (YFP yığınında) tek halkaları veya birden fazla, merdiven benzeri yapılar oluşturan hifal ucunda DivIVA-mCherry (RFP yığını) ve FtsZ-YPet için beklenen hücre içi lokalizasyonu inceleyin. </li><li> aşağı işlenme için ilgi bir bölge yalıtmakgörüntülerin ng. Time-lapse mikroskopi genellikle Fiji tarafından işlenmesini yavaşlatabilir büyük dosyaları üretir. Nedenle tespit ve faiz (ROI) bir bölge izole etmek ve görüntü yığınının bu küçük bir versiyonu hakkında daha fazla görüntü işleme adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir. <ol><li> Menüde &quot;Dikdörtgen Seçim&quot; aracını seçin ve gelişmekte olan hif görüntü dizi boyunca ROI çevrili olduğu şekilde DIC görüntü yığınında bir dikdörtgen ROI çizin. </li><li> &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot; ile YG-yığını çoğaltın. </li><li> YFP görüntü yığını adı çubuğuna tıklayın ve &quot;Düzenle&gt; Seçim&gt; Seçimi Restore&quot; YFP yığınında aynı borudaki konumuna yığını özgün DIC önceki dikdörtgen seçim geri ve &quot;Ctrl&quot; ile ROI çoğaltmak için menüde + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> RFP yığını için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> üç resim t yığınlarının görüntüleri hizalayıno zamanla xy düzleminde sahne sürüklenir kaldırın. DIC yığınında son kareye gidin ve menüden &quot;Eklenti&gt; Kayıt&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; seçeneğini seçin. RFP ve YFP görüntü yığını için bu adımı yineleyin. Gerekirse, adım 4.5.1-4.5.3 yineleyerek ROI kırpın. </li><li> İsteğe bağlı: &quot;&gt; Süreç Kontrast geliştirin&quot; &quot;Parlaklık ve Kontrast Aracı ayarlama&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) ya da seçmek her görüntü yığını için elle parlaklık ve kontrast ayarlama menüden ve &quot;Normale&quot; uygulamak yığının tüm görüntüleri komut. Ikinci komut aşağı görüntü analizi etkileyebilir, bu nedenle piksel değerlerini değiştirebilir ve olacağı unutulmamalıdır. </li><li> İsteğe bağlı: yatay veya dikey &quot;Image&gt; Yığınlar&gt; Araçlar&gt; birleştirin&quot; eklentisi kullanarak (RGB dosya formatına dönüştürülmüş 4.11 bakınız) bireysel yığınları birleştirin. </li><li> (&amp; Ve bir süre Stamper ( &quot;&gt;&gt; Ölçek Bar Araçlar Analiz&quot;) bir ölçek çubuğu ekleyin# 34; Image&gt; Yığınları&gt; Saat Stamper &quot;). </li><li> &quot;.tiff&quot; Formatında bir görüntü dizisi olarak değiştirilmiş görüntü yığınlarını kaydedin. Bir film üretmek için, &quot;.avi&quot; olarak kaydedin. Alternatif olarak, &quot;Biyo-Biçimleri&gt; Biyo-Biçimleri İhracatçı&quot; eklentisi ve &quot;.mov&quot; dosya türünü seçin kullanarak QuickTime formatında ihracat görüntü serisi. </li><li> tek kare resim elde etmek için, + &quot;D&quot; ilgi çerçeve seçin ve görüntü &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; yinelenen. &quot;Görüntü&gt; Type&gt; RGB renk veya 8-bit&quot; adı altında ortaya çıkan görüntü &quot;RGB&quot; veya &quot;8-bit&quot; türünü değiştirmek ve &quot;tiff&quot; olarak görüntüyü kaydetmek. Not: Fiji ek daha açıklamak işlevleri veya işlem time-lapse serisi bir dizi sunuyor. Ayrıntılı bilgi (http://fiji.sc/Fiji) Fiji çevrimiçi destek gidin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-di-GMP+signalling+and+the+regulation+of+developmental+transitions+in+streptomycetes.">c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes.</a> Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).</li><li>Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+and+DNA+segregation+in+Streptomyces.:+how+to+build+a+septum+in+the+middle+of+nowhere?.">Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere?.</a> Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).</li><li>McCormick, J. R., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+regulators+that+govern+Streptomyces+development.">Signals and regulators that govern Streptomyces development.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).</li><li>Fl&#228;rdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apical+growth+and+hyphal+branching+in+Streptomyces.">Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).</li><li>Hempel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ser/Thr+protein+kinase+AfsK+regulates+polar+growth+and+hyphal+branching+in+the+filamentous+bacteria+Streptomyces.">The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).</li><li>Fuchino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+gradients+of+an+intermediate+filament-like+cytoskeleton+are+recruited+by+a+polarity+landmark+during+apical+growth.">Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).</li><li>Holmes, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coiled-coil+protein+Scy+is+a+key+component+of+a+multiprotein+assembly+controlling+polarized+growth+in+Streptomyces.">Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).</li><li>McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+viability+of+Streptomyces+coelicolor.+mutant+for+the+cell+division+gene+ftsZ.">Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ.</a> Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).</li><li>Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+and+the+division+of+prokaryotic+cells+and+organelles.">FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).</li><li>Grantcharova, N., Lustig, U., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+FtsZ+assembly+during+sporulation+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).</li><li>Richards, D. M., Hempel, A. M., Fl&#228;rdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+basis+of+branch-site+selection+in+filamentous+bacteria.">Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).</li><li>Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assemblies+of+DivIVA+mark+sites+for+hyphal+branching+and+can+establish+new+zones+of+cell+wall+growth+in+Streptomyces+coelicolor.">Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor.</a> J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).</li><li>Wolanski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+trafficking+in+growing+vegetative+hyphae+of+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2).</a> J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).</li><li>Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+Streptomyces+coelicolor.growth+and+sporulation.">Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).</li><li>Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+control+of+cell+division:+FtsZ+is+recruited+by+SsgB+during+sporulation+of+Streptomyces.">Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces.</a> Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).</li><li>Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+of+Streptomyces+venezuelae.+in+submerged+cultures.">Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures.</a> J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).</li><li>Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+chaplin+and+rodlin+hydrophobic+sheath+proteins+in+Streptomyces+venezuelae.is+controlled+by+sigma(BldN)+and+a+cognate+anti-sigma+factor,+RsbN.">Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN.</a> Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).</li><li>Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+regulator+heterodimer+formation+controls+a+key+stage+in+Streptomyces+development.">Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development.</a> PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).</li><li>Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+required+for+aerial+growth,+cell+division,+and+chromosome+segregation+are+targets+of+WhiA+before+sporulation+in+Streptomyces+venezuelae.">Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae.</a> MBio. 4, e00684-e00613 (2013).</li><li>Tschowri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+c-di-GMP+mediates+effective+transcription+factor+dimerization+to+control+Streptomyces+development.">Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development.</a> Cell. 158, 1136-1147 (2014).</li><li>Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-L&#242;pez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB-Dependent+Inhibition+of+Cell+Elongation+during+the+Escape+from+Competence+in+Bacillus+subtilis.">MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).</li><li>Zopf, C. J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquiring+fluorescence+time-lapse+movies+of+budding+yeast+and+analyzing+single-cell+dynamics+using+GRAFTS.">Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS.</a> J. Vis. Exp. (e50456), (2013).</li><li>Meniche, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpolar+addition+of+new+cell+wall+is+directed+by+DivIVA+in+mycobacteria.">Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).</li><li>Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+impacts+on+cell+growth+and+division+site+selection+in+Corynebacterium+glutamicum.">Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum.</a> PLoS One. 8, e55078 (2013).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli.+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li><li>Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li><li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ.">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li><li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+(TopA)+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation.">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Streptomyces yaşam döngüsü time-lapse mikroskopi geçmişte teknik açıdan zorlayıcı olmuştur. Burada (Şekil 2) görselleştirmek ve gelişim programı aracılığıyla ilerlemesini iz yardımcı olmak için hücre polarite işaretleyici DivIVA ve hücre bölünmesi proteini FtsZ için floresan protein füzyonları kullanarak tüm yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek için sağlam bir protokol mevcut. Bu yöntem Orta S. yetiştirme (MYM-TE harcanan) harcanan orta ile sürekli orta perfüzyon ve normal büyüme ortamı (MYM&#39;nin-TE) alışverişini sağlayan bir mikroakışkan cihaz venezuelae. Kültür durumun değişim besin açısından zengin bir ortamda sürekli bir tedarik bitkisel growt uyarır, oysa sporulasyonunu teşvik nedeniyle harcanan kültür ortamında herhangi henüz tanımlanmamış hücre dışı sinyalleri olarak kuyu (örn nisap algılama sinyalleri) olarak beslenme vites açıklanan protokole önemlidirneredeyse hiç spor oluşumu H (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, bu mikro-akışkan sistemi içinde kültürlenmesi daha deney esneklik sağlar ve kültür koşullarının değiştirilmesi yanıt olarak bakteri büyümesinin değişikliklerin uzun süreli izlenmesine olanak sağlar, çünkü agaroz üzerinde hücrelerin kültürlenmesi daha üstündür. mikroakışkan plakaları tek bir kullanım için tasarlanmıştır, ancak sadece sonraki deneylerde kullanılabilen hücre ile inoküle edilmemiş kanalları akar. Biz uzun zaman açılmıştır plakalara manifoldu sızdırmazlık problemleri yaşamış gibi, bir hafta içinde bir mikroakışkan plaka tüm kanallarını kullanmanızı öneririz. Bir deney kurarken, biz mikrop tüpleri (veriler gösterilmemiştir) ortaya önce donmuş bir gliserol stoku türetilen sporlar en az 6 saat gerekli ise taze hazırlanmış sporlar, akış odasına yüklenen iki saat içinde çimlenmiş bulundu. çimlenme bu gecikme deney uzunluğunu uzatır ve engelleyebilirekipman kullanılabilirliği ve deneysel koşullar. Mikrop tüplerinin geliştirilmesi ve akıbet için yeterli besin sağlamak için en az 3 saat MYM-TE perfüzyon ile denemeyi başlatmak için de önemlidir. Deney vejetatif büyümeyi incelemek için tasarlanmış ise MYM-TE ile Perfüzyon ilk 3 saat ötesine uzatılabilir. sporların başlangıç ​​malzemesinin tercih seçeneği sağlarken, kısa hifal parçaları da mikroakışkan plakaya yüklenebilir. Ancak, makaslanmış misel kullanarak yükleme verimi düşüktür önemli ve genellikle sigara sporlanan mutantlar incelerken bir sınırlama mevcut olabilecek çeşitli yükleme çalışır gerektirir. Ne olursa olsun kullanılan inokulum Çeşidi, medya difüzyon müdahale ve görüntü analizi komplike edebilir hızlı kalabalık yol açacaktır bu kadar sporların veya hifal fragmanları ile kültür odasını aşırı önemlidir. Muhabir proteinlerin yapımını planlamak önemlidir dikkatli bir şekildLly Streptomyces floresan time-lapse görüntüleme kullanım için. Hedef protein ve flüoresan raportör ve N- veya C-terminali füzyonları seçimi arasındaki ekleyicinin boyu kritik öneme sahip olabilir. Ayrıca, görüntüleme frekansı ve maruz kalma süresi de dahil olmak üzere uygun deney koşulları, her bir floresan etiketli proteini için önceden tespit edilmesi gerekmektedir. S. düşük seviyelerde ifade edilen bir floresan etiketli protein görüntüleme sorunlu olabilir sarı / yeşil kanaldaki venezuelae hifler sergi otomatik floresans. Buna ek olarak, bu çimlenme ve ilk vejetatif büyüme fazı, S. sırasında dikkat edilmelidir venezuelae kısa dalga boylu ışığa (örneğin CFP protein füzyonları kullanırken) için özellikle duyarlıdır. Bakterilerin canlı hücre görüntüleme için görüntüleme yöntemleri ve floresan muhabiri sistemlerinde sürekli ilerlemelere rağmen, yazılım paketleri çoğu (örneğin MicrobeTracker, Schnitzelcveri setleri bu tür sonraki otomatik işleme arşın, CellProfiler) bir çok hücreli yaşam tarzı 27-29 ile ipliksi bakteriler elde edilen görüntülerin analizini desteklemez. Bu nedenle, Streptomyces ve diğer lifli bakteri görüntüleme de niceliksel veri yüksek verimli bir analizi için uygun bir algoritma geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Özetle, burada açıklanan çalışma S. muazzam potansiyelini göstermektedir Çünkü sıvı içinde sporlanmalanna kabiliyetini cinsi için yeni bir model gelişim sistem olarak venezuelae. Mikroakışkan kültür cihazı deneyimsiz kullanıcılar için bile kullanımı basittir. Bu dinamik protein lokalizasyonu, polarize büyüme ve unigenomic sporların zincirleri içine çok hücreli misel morfolojik farklılaşma dahil Streptomyces yaşam döngüsü, merkezi hücre biyolojik süreçleri incelemek için mükemmel bir platform sağlar. Buna ek olarak, bu deney u ayarlamakp ayrıca peptidoglikan sentezini veya propidium iyodür ve 4 izlemek için floresan D-amino asitler &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol olarak kültür koşulları alternatif gerektiren gelişme olayları, ya da floresan boyaların kullanımını araştırmak için cezbedici bir başlangıç ​​noktası sağlar (DAPI) kromozom organizasyonu 30,31 görselleştirmek için.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The author&#39;s name was updated from:
Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/53863/fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle" target="_blank">Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device</a>
The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycet&#39;ler uykuda, unigenomic sporlar 1-3 bir çok hücreli, besin süpürücü misel gelen morfolojik farklılaşma içeren karmaşık bir gelişimsel döngüsünde ile karakterize edilir toprakta yaşayan bakteriler vardır. Uygun büyüme koşulları altında, tipik bir Streptomyces spor bir ya da iki tohum tüpü (Şekil 1) haddelenmesiyle çimlenme başlar. Bu tüpler ucu uzantısı uzamış ve vejetatif misel olarak bilinen dallı hifal ağına büyür. Polar büyüme ve hifal dallanma temel protein DivIVA tarafından yönetilmektedir. Bu halkalı-halka proteini büyük sitoplazmik kompleks bir parçası olarak uzanan uç 4-7 yeni hücre kılıfı malzemesinin sokulması için çok önemlidir polarisome olarak adlandırılır. Vejetatif büyüme sırasında, hifal filamentler sözde çapraz duvarların 8 seyrek oluşumu ile bölümlere olur. yeniden bu çapraz duvarların oluşumu<html> quires FtsZ, çoğu bakteri 9 hücre bölünmesi için gerekli olan tübülin gibi iskelet proteindir. Streptomyces, ancak, bu vejetatif çapraz duvarlar daralma ve hücre-hücre ayrımına neden olmayan ve bu nedenle de misel kütle birbiriyle bağlantılı sinsityal bölmelerin ağı olarak kalır. Iyi anlaşılmış değildir besin sınırlaması ve diğer sinyallere yanıt olarak, uzman bir anten hif vejetatif misel uzakta kırmaya ve havaya 3 dönüşebilir. Bu yapıların montajı haline uzun multi-genomik hava hifler eşit büyüklükte unigenomic Prospore bölmeleri onlarca bölünmüş sırasında gelişme üreme fazını başlatır. Bu büyük hücre bölünmesi olayı tek sporogenic hifler 2,10 içinde birden fazla FtsZ yüzük senkron daralma tarafından tahrik edilir. Morfolojik ayrım uykuda, kalın duvarlı, pigmentli sporların salınımı ile tamamlanır. t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> Şekil 1:. Katı ortam üzerinde Streptomyces yaşam döngüsü Bu S. klasik çalışmalara dayalı yaşam döngüsünün bir modeldir agar plakaları üzerinde büyüyen coelicolor. Bir sporun hücresel gelişim hif dallanma bir ağ oluşturmak üzere uç uzantısı büyür bir ya da iki germ tüpleri, oluşumu ile başlar. Polar büyüme ve bitkisel hiflerin dallanma DivIVA (kırmızı) tarafından yönetilmektedir. vejetatif çapraz duvarların oluşumu FtsZ (yeşil) gerektirir. besin sınırlamalar ve diğer sinyallere yanıt olarak, hava hif inşa edilmiştir. hava büyüme tutuklanması sıkıca kutu benzeri Prospore bölmeye sporogenic hif bölümlendirirse sporülasyon septa doğuran FtsZ-ringler, bir merdiven montaj ile koordine edilir. Bu bölmeler kalın spor Duvara montaj ve sonunda Relea vardırolgun pigmentli sporlar sed. Streptomyces yaşam döngüsünün kilit gelişim olayları iyi 1,3 karakterize edilir. Ancak, yine de ne kıt, protein yerelleştirme dinamikleri, kromozom hareketi ve gelişimsel kontrollü hücre bölünmesi olarak farklılaşmasını destekleyen hücre içi süreçlere, içgörü sağlamak için floresan time-lapse mikroskobu kullanan hücre biyolojik çalışmalar vardır. Streptomyces gelişme Canlı hücre görüntüleme nedeniyle yaşam döngüsünün karmaşıklığı ve organizmanın fizyolojik özelliklerinin zorlu olmuştur. Bitkisel büyüme önceki çalışmaları ve sporlaşma septasyon başlangıç ​​aşamaları oksijen geçirgen görüntüleme odaları veya mikroskop sahnede 11-15 Streptomyces coelicolor agaroz destekli büyüme istihdam var. Ancak bu yöntemler, bir dizi faktöre ile sınırlıdır. Bazı sistemler sadece hücresel büyümenin kısa vadeli görüntüleme izinhücreler önce d floresan proteinleri yetersiz oksijen kaynağı muzdarip veya bağlı hifal geliştirme üç boyutlu desen odak düzleminden dışarı büyür. Uzun vadeli görüntüleme hücreleri alternatif büyüme ya da stres koşullarına maruz ve agaroz pedleri ortamdan eşiğe ciddi zayıf floresan izlemek için yeteneği sınırlar olamaz çünkü agaroz pedleri sınırları deneysel esneklik üzerinde hücrelerin yetiştirilmesi mümkün olduğu durumlarda sinyaller. Burada mükemmel hassasiyet ve duyarlılığı ile tam Streptomyces yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme için bir protokol açıklar. Bir floresan geniş açılı mikroskobu (Şekil 2) bağlı olan bir mikro sıvısal tertibat Streptomyces büyüyerek, şimdi en fazla 30 saatlik bir süre boyunca çimlenme, vejetatif büyüme ve sporulizasyon septumu oluşumunu izlemek mümkündür. Bu büyük ölçüde, yeni bir model organizma Streptomyces kullanılmasıyla kolaylaştırılır </em&gt; venezuelae o batık kültürde yakın tamamlanması için sporulates ve böylece klasik bir model türlerinin S. sınırlama üstesinden gelir, çünkü Katı ortam 16-20 sadece sporulates coelicolor. vejetatif gelişmesi ve spor görselleştirmek yardımcı olmak için, birlikte express floresan hücre polarite işaretleyici DivIVA ve anahtar hücre bölünmesi proteini FtsZ sürümlerini etiketledi. Başarıyla mikobakteriler, Escherichia coli Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis ve maya 21-25 için kullanılan olan bir ticari olarak temin edilebilir mikroakışkan cihaz kullanmaktadır. Sistem tek bir odak düzlemi hücreleri yakalar ve farklı haznelerden kültür ortamının sürekli perfüzyon kontrol edilmesini sağlar. Ayrıntılı protokolde S. ortaya çıkarmak için bu özellikten yararlanmak sporulasyonunu tanıtmak için bir beslenme downshift için bitkisel misel venezuelae. protokol deScribed tüm Streptomyces yaşam döngüsünün canlı hücre görüntüleme için, ancak belirli gelişim evreleri özel ilgi ise alternatif medya koşulları veya mikroskop ayarları seçilebilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> Şekil 2: Şematik deneysel iş akışı betimleyen. protokol açıklanan üç temel adım gösterilmiştir. İlk olarak, sporlar ve harcanan ortam sabit faz kültüründen hazırlanmıştır. İkincisi, taze sporlar mikroakışkan sistemi ve S. yüklenir venezuelae gelişimsel ömrü optimal büyüme sıcaklığı korumak için bir kuluçka hücresine sahip, tam otomatik bir ters mikroskop kullanılarak boyunca görüntüsü alınır. Üçüncü olarak, elde edilen time-lapse serisi analiz ve açık kaynak yazılımı Fiji kullanılarak işlenir.

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Microfluidic culture plates</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td></tr><tr><td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Environmental chamber surrounding the microscope</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td></tr><tr><td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Stage holder for microfluidic plate</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Microscope control software</td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/Positions</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open-source software package</td><td>&lt;u&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>Generation of time-lapse movies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 4 g Maltose&lt;br/&gt; 4 g Yeast extract&lt;br/&gt; 10 g Malt extract&lt;br/&gt; add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td><td></td><td></td><td>Sporulation medium used to culture &lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; SV60</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R2 Trace element solution (TE)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 8 mg ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 40 mg FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;-10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; add 200 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; Autoclave and store at 4 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td><td></td><td></td><td>Add 0.002 volumes to MYM</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>Preparation of spent MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre strain collection</td><td></td><td>&lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; strain expressing &lt;em&gt;divIVA-mcherry&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;ftsZ-ypet&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Tüm S. başarılı canlı hücre görüntüleme venezuelae yaşam döngüsü çimlenme, vejetatif büyüme ve sporlanma (Şekil 3, Film 1) en önemli gelişim aşamaları dahil olmak üzere, sürekli bir zaman serisi elde edilir. yaşam döngüsü boyunca ilerlemenin Görselleştirme daha DivIVA mCherry ve FtsZ-YPet ayrı hücre içi lokalizasyonu ile geliştirilmiştir. Çimlenme ve vejetatif büyüme sırasında, DivIVA mCherry sadece büyüyen hifal ipuçları ya da yeni şube noktaları (Şekil 4A) oluşturan işaretleri birikir. Bu sonuçlar DivIVA 12,26 önceden bildirilen hücre içi konumlandırma ile uyumludur. Bunun aksine, FtsZ-YPet artan misel (Şekil 4B) düzensiz aralıklarla tek halka-benzeri yapılar oluşturmaktadır. Bu yapılar İnterconn oluşumuna neden olmayan konstriktif bitkisel çapraz duvarlar sentezi için iskele temintutarları hifal bölmeleri 8. Sporogenic hif içine hif büyüyen hücre farklılaşması polar DivIVA mCherry odaklarının kaybolması ile görünür hale gelir, polar büyüme yakalanması ve FtsZ-YPet floresans birlikte artış (Şekil 4C). hif sporlanan olarak FtsZ-YPet lokalizasyonu deseni dramatik değişiklikler; İlk sarmal FtsZ-YPet filamentler hypha boyunca takla ve sonra aniden neredeyse eşzamanlı olay, bu helezonlar düzenli aralıklı FtsZ-YPet halkaların bir merdiven içine birleşmek. Burada tarif edilen deney koşulları altında, bu eşit olarak dağıtılmış FtsZ-YPet merdivenler yaklaşık 2 saat süre ile devam etmektedir. Son olarak, sporulasyon septa diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri (Şekil 4D) ve en sonunda yeni sporlar yayımlanan içinde fark edilebilir hale gelir. olarak sağlayan Fiji yazılımını kullanarak görüntü işleme açıklayan sonraki protokol<html> TEP-adım edinilen time-lapse serisi (Film 1) den yayınlanması için bir film üretmek için nasıl bir açıklama. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> Şekil 3: S. temsili time-lapse floresan mikroskopi serisinden Anlık görüntüler venezuelae üreten floresan etiketli FtsZ (yeşil) ve DivIVA (Kırmızı) birleştirilmiş görüntülerin seçilen kareleri vardır Gösterildi (üst panel: RFP-YFP DIC, alt panel: DIC). çimlenme, vejetatif büyüme ve sporülasyonun dahil Streptomyces yaşam döngüsü görselleştirerek. Görüntüler Film 1. Zaman alınmıştır saat şöyledir: dk. Ölçek çubukları = 5 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> d / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4: Streptomyces yaşam döngüsünün başarılı zaman atlamalı serisi için Örnek sonuçlar DivIVA mCherry (A) lokalizasyonu.. RFP ve DIC kanallarının birleştirilmiş görüntüleri ile Movie 1 iki sonraki zaman noktalarında anlık gösterilmiştir. DivIVA mCherry yeni hifal şube siteleri (dolu ok başı) işaretler ve polar büyüme (açık ok başı) doğrudan hifal ucunda lokalize. Ölçek çubuğu = 10 vejetatif büyüme (ok başı) sırasında um (B) FtsZ-YPet yerelleştirme. FtsZ-YPet (DIC, alt panel) sıkmak yok tek halka benzeri yapılar (üst panel) oluşturur. Sporlanma septasyon sırasında (C) FtsZ-YPet (yeşil) yerelleştirme. (Sa: dk) DivIVA mCherry odakları aşağıda gösterildiği geçen süre, kırmızı renkle gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 5 mikron. (C) den sporlanan hif DIC görüntüleri İlgili (D) şeklini gösterensonunda sporların bir zincir (sağ resim) içine olgun görünür sporlanma septa (sol resim) ile Prospore bölmeleri, bir tirme. Zaman saat şöyledir: dk. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1 Çerçeve" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> Film 1: yaşam döngüsünün venezuelae Streptomyces Time-lapse floresan mikroskopi dizileri film birleştirilmiş RFP-YFP görüntüleri (solda) ve karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleri (sağda) oluşur.. DivIVA mCherry yeşil, kırmızı ve FtsZ-YPet gösterilmiştir. tek kare arasındaki zaman aralığı 40 dk. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">Thi görmek için buraya tıklayınız</a>s film.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device at JoVE.com

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme<em&gt; S. venezuelae</emBir mikroakışkan Cihaz Kullanımı&gt; Yaşam Döngüsü

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

fluorescence-time-lapse-imaging-complete-s-venezuelae-life-cycle

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.8K Görüntüleme.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Video: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Biyomühendislik

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biyokimya

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Gelişim Biyolojisi

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Nörobilim

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

FLIM Tabanlı Metabolik ve Hipoksi Analizi için Çok Hücreli Spheroid Oluşumu

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Yazar Spotlight: Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Metabolik ve Oksijenasyon Analizi için Küresel Oluşum Yöntemlerinin Standardizasyonu

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Tam Floresans Zaman atlamalı Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Için basit Mikroakışkan Cihazlar

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)