Name: fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device
Uploaded: 2016-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
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The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

1. Isolamento de fresco S. venezuelae Esporos e Preparação de Gasto Meio de Cultura <ol><li> Inocular 30 ml de maltose-Yeast Extract Extracto de Malte (PJM) médio, suplementado com 60 ul R2 solução oligoelemento (TE), com 10 esporos ul de tensão SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mCherry P FtsZ -ftsZ-ypet)]. Para o crescimento consistente e esporulação das células, utilizar um balão ou um balão confuso que contém uma mola para permitir arejamento suficiente. </li><li> Células de cultura de 35-40 h a 30 ° C e 250 rpm. </li><li> Examine as células por microscopia de contraste de fase líquida montado. Neste ponto fragmentos de micélio e esporos será visível. </li><li> Centrifugar 1 ml de células numa centrífuga de mesa a 400 xg durante 1 min para sedimentar o micélio e os fragmentos de células maiores. </li><li> Transferir aproximadamente 300 ul co sobrenadantentaining uma suspensão de esporos para um novo tubo de 1,5 ml e manter em gelo. Manter o meio de cultura restante para o passo 1.7. </li><li> Diluir esporos 1:20 em MYM-TE (concentração final: 0,5-5 x 10 7 esporos / ml) e manter em gelo até ser necessário (veja o passo 2.3). Nota: Embora as condições exatas que desencadeiam esporulação em Streptomyces não são compreendidos, utilizando meio MYM-TE gasto, incluindo quaisquer sinais extracelulares desconhecidos de uma cultura esporulação, estimula a esporulação. </li><li> Filtro-esterilizar 10 ml do meio de cultura restante para obter passou MYM-TE que é livre de esporos e fragmentos de micélio. Usar um filtro de seringa estéril de 0,22 um e transferência gasto PJM-TE para um tubo estéril de 15 ml. </li><li> Mantenha o preparado passou MYM-TE por alguns dias a 4 ° C, se experimentos adicionais usando condições de crescimento semelhantes devem ser conduzidos. </li></ol> 2. Preparação do Dispositivo de microfluidos Nota: Cada pla microfluídicote permite até quatro experiências independentes para ser realizado. Para evitar a contaminação das câmaras de fluxo não utilizados, usar soluções estéreis e condições de trabalho quando a criação de um experimento. <ol><li> Remoção da solução de transporte a partir da placa de microfluidos e lavar os poços com estéril MYM-TE. </li><li> Adicionar 300 ul MYM-TE para a entrada do poço 1 e 300 ul passou MYM-TE para poços de 2 a 6. </li><li> Carregar 40 ul diluída esporos do passo 1.6 em células de carga 8 da pista assim &quot;A&quot; e selar o colector para a placa de acordo com instruções do fabricante. </li><li> Inicie o software de controle de microfluídica, selecione o tipo de placa apropriado e estabelecer um programa de fluxo para preparar o canal de fluxo e câmara de cultura por meio de fluxo de poços de entrada de 1 a 5 a 6 psi por 2 min por poço. </li><li> No software de controlo microfluidos, criar um protocolo de fluxo para a experiência: fluir PJM-TE da entrada de um bem durante 6 horas para permitir a germinação e o crescimento vegetativo das células. Interruptorem seguida, a perfusão de gasto PJM-TE da cavidade 2 a 5, para o restante tempo da experiência. Durante o decurso da experiência manter o fluxo constante a pressão a 6 psi (correspondendo a cerca de 9 ul de meio / h). Iniciar o fluxo de programa depois do passo 3.5. </li></ol> 3. Set Up do microscópio e do Protocolo de Time-lapse Nota: Este método foi implementado em um microscópio invertido widefield totalmente motorizada e automatizado equipado com uma câmera scmos, uma lâmpada de metal-halogeneto, um autofocus hardware, um suporte de palco para placas de 96 poços e uma câmara ambiental. <ol><li> Pré-aquecer a câmara ambiental a 30 ° C em avanço, a fim de evitar problemas com a focagem automática, depois de começar a experiência. O tempo necessário depende da câmara ambiental utilizado, o microscópio e o sistema de aquecimento. Começam a aquecer o sistema na noite antes do experimento. </li><li> Ligue o microscópio e automação de microscopia e controle softwaré. Use uma alta abertura numérica (NA) objectiva de imersão em óleo para a coleta de sinal ótima e resolução espacial, como um 100X, 1,46 NA óleo objectivo DIC. Escolha filtros adequados e espelhos dicromáticos para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagens de fusões de proteínas amarelo-fluorescente e vermelho fluorescentes. </li><li> Coloque uma gota de óleo de imersão para o objectivo e adicionar fluido de imersão até ao fundo da janela de imagem na placa de microfluidos para melhorar-foco celular durante a aquisição de imagem. Cuidadosamente montar o dispositivo de microfluidos selado (passo 2.5) sobre a fase de microscópio invertido. Certifique-se de que a placa está firmemente colocado no suporte de fase e não mudar ao longo do curso do experimento. </li><li> Traga a janela de imagem da câmara de cultura microfluídico em foco usando os marcadores de posição embarcados para orientação. Concentre-se para a parte mais à esquerda da primeira câmara de escoamento (identificadas como &quot;A&quot;) com o tamanho armadilha 5, correspondendo auma altura armadilha de 0,7 um. </li><li> No software microfluidos, células de carga entre a entrada bem 8 a 4 psi durante 15 seg. Verifique a densidade de células na câmara de cultura movendo o palco ao longo da janela de imagem. Se não há esporos foram presos, repetir o passo de carregamento de células ou, alternativamente, aumentar a pressão de carga e / ou o tempo até que a densidade celular desejada é atingida (1-10 esporos por janela de imagem com 2.048 x 2048 pixels). Evite sobrecarregar a câmara de cultura. Nota: Nós normalmente usamos tamanho armadilha 5 para imagiologia Streptomyces, mas nós também obtiveram bons resultados com a armadilha dos tamanhos 4 e 3. Consulte o manual do fornecedor para obter outras sugestões sobre como otimizar o processo de carregamento celular. </li><li> Inicie o programa de fluxo no software de controlo a partir do passo 2.5 e permitir que a placa de microfluidos para aquecer-se equilibrar durante 1 hora na platina do microscópio antes de iniciar a aquisição de imagem. </li><li> No software de controle de microscópio, configurar uma aquisição multi-dimensional para tomar multiple imagens em várias posições de fase ao longo do tempo: <ol><li> Para Autosave: Diretório especificar para a gravação automática dos arquivos de imagem. </li><li> Para as configurações de iluminação, determinar as configurações de iluminação ideal para cada construção específica com antecedência. Para o experimento delineado, utilize os seguintes tempos de exposição: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms. </li><li> Para o período de-série: configurar uma série de tempo para adquirir imagens nos pontos de tempo desejado em sequência. Para imagiologia do ciclo de vida de S. venezuelae, selecione um intervalo de tempo de 40 minutos ao longo de um período de 24 horas. </li><li> Para os cargos de palco e autofocus: digitalizar a câmara de cultura, movendo as posições de palco e palco loja para cada posição de imagem de interesse. Certifique-se de que as posições de estágio único estão localizados suficientemente distante para minimizar a fotodegradação e phototoxicity.Typically usar até 12 posições. Executar rotina autofocus para cada ponto de tempo para corrigir o desvio focal lento. Se estiver disponível no software de controle de microscópio, A estratégia de foco automático definido como &quot;atualização superfície local, autofocus hardware&quot;. Uma vez que os Z-coordenadas das posições estágio selecionados são verificados, ativar o autofocus hardware. </li></ol></li><li> Iniciar o experimento de lapso de tempo no software de controle de microscópio. </li><li> Verifique se todas as posições de palco ainda estão em foco em pontos posteriores. Para experiências de lapso de tempo que funcionam ao longo de várias horas, ocasionalmente observar um desvio palco mesmo quando utilizando a focagem automática. Se as posições de estágio necessário recentrar, interromper a experiência a um ponto de tempo apropriado, ajustar o foco e reiniciar o experimento dentro do intervalo de tempo de imagem definido (passo 3.7.3). Veja o passo 4.3 para saber como concatenar a série temporal. </li><li> Pare a aquisição de imagem depois de 24-30 horas, ou quando as hifas na região de interesse foram diferenciadas em esporos (ver série de imagens DIC). Pare de programa de fluxo no software e desmontar o dispositivo microfluídico. </li><li> Prepare placa microfluídico utilizado para sto de curto prazoraiva. Remover restante MYM-TE e passou MYM-TE do poço 1 a 6, resíduos poço vazio 7 e carregamento de células bem 8. Em condições estéreis, re-fill poços de pista &quot;A&quot; e poços de pistas não utilizados ( &quot;B&quot;, utilizado para &quot;D&quot;) na placa com estéril salina tamponada com fosfato (PBS). Selar a placa com parafilme para evitar que ela seque e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 4. Geração de Time-lapse Filmes Usando Fiji Software Nota: Observamos que diferentes pacotes de software comercial e livre estão disponíveis para processar imagens de microscopia de lapso de tempo, incluindo ZenBlue, Metamorph, gelado, ImagePro ou ImageJ. Aqui vamos nos concentrar em Fiji, que é um programa de processamento de imagem de código aberto baseado em ImageJ, e que já oferece uma série de plugins pré-instalados úteis. <ol><li> dados de imagem de transferência de sua experiência de lapso de tempo a um computador que tenha instalado Fiji. </li><li> Lançamento do programa e importar o arquivo de imagem usando o &amp;# 34; File&gt; Import&gt; Bio-Formatos &quot;. Ou simplesmente arrastando o arquivo de imagem em Fiji no&quot; bio-formatos opções de importação &quot;, marque a caixa&quot; canais de divisão &quot;para obter uma pilha de imagem separada para cada canal de iluminação (DIC , RFP, YFP). </li><li> Opcional: Para mesclar as séries cronológicas em separado resultante de uma ruptura na na aquisição de imagem devido à reorientação (passo 3.9), abra respectivas pilhas de imagens e executar &quot;Imagem&gt; Pilhas&gt; Ferramentas&gt; Concatenar&quot; para cada canal (DIC, RFP, YFP ). </li><li> Avaliar a qualidade dos dados de intervalo de tempo percorrendo as pilhas de imagens. Procure por hifas que ficou em foco ao longo do tempo, mostra o crescimento micelial e, eventualmente, formar esporos (DIC pilha). Examinar a localização subcelular esperado para DivIVA-mCherry nas pontas das hifas (pilha RFP) e FtsZ-YPet formando anéis simples ou múltiplas estruturas, escada-like em vegetativa ou hifas esporogênico (pilha YFP), respectivamente. </li><li> Isolar uma região de interesse para reciclag jusanteng das imagens. microscopia de lapso de tempo, muitas vezes produz grandes arquivos que podem retardar o processamento de Fiji. Por conseguinte, recomenda-se a identificar e isolar uma região de interesse (ROI) e a realização de mais passos de processamento de imagem nesta versão mais pequena da pilha de imagem. <ol><li> Seleccionar a função &quot;Selecção retangular&quot; no menu e desenhar uma ROI rectangular na pilha de DIC, de tal maneira que as hifas em desenvolvimento são delimitados por o ROI ao longo da série de imagens. </li><li> Duplicar ROI-stack com &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Clique na barra de nome da pilha de YFP e selecione &quot;Editar&gt; Seleção&gt; Restaurar seleção&quot; no menu para restaurar a seleção retangular anterior do DIC originais pilha ao mesmo positon na pilha YFP e duplicar o ROI com &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Repita esse processo para a pilha de RFP. </li></ol></li><li> Alinhar as imagens na imagem Três pilhas to remover desvios estágio no plano xy ao longo do tempo. Vá até o último quadro na pilha DIC e selecione &quot;Plugin&gt; Registro&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; a partir do menu. Repita este passo para a RFP ea pilha de YFP. Se necessário, cortar o ROI repetindo o passo 4.5.1-4.5.3. </li><li> Opcional: Ajustar o brilho eo contraste manualmente para cada pilha de imagens com o &quot;Ajustar o brilho eo contraste da ferramenta&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) ou selecione &quot;Processo&gt; Melhorar Contraste&quot; do menu e aplicar o &quot;Normalizar&quot; comando para todas as imagens da pilha. Deve notar-se que o último comando irá alterar os valores de pixel e, portanto, pode afectar a jusante de análise de imagem. </li><li> Opcional: Combine pilhas individuais (convertido para o formato de arquivo RGB, consulte 4.11) horizontalmente ou verticalmente usando o plugin &quot;Imagem&gt; Pilhas&gt; Ferramentas&gt; Combinar&quot;. </li><li> Adicionar uma barra de escala ( &quot;Analisar&gt; Ferramentas&gt; Barra de Escala&quot;) e um batedor de tempo (&amp;# 34; Imagem&gt; Pilhas&gt; Tempo Stamper &quot;). </li><li> Salvar pilhas de imagens modificadas como uma sequência de imagens no formato &quot;tiff&quot;. Para produzir um filme, salvar como &quot;.avi&quot;. Alternativamente, série de imagens de exportação no formato QuickTime usando o &quot;Bio-Formatos&gt; Bio-Formatos Exportador&quot; plug-in e selecione a opção &quot;.mov&quot; tipo de arquivo. </li><li> Para obter imagens de quadros individuais, selecione o quadro de interesse e duplicar a imagem &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. Alterar o tipo de imagem, resultando em &quot;RGB&quot; ou &quot;8-bit&quot; em &quot;Imagem&gt; Tipo&gt; a cor RGB ou 8-bit&quot; e salvar a imagem como &quot;tiff&quot;. Nota: Fiji oferece uma série de funções adicionais para anotar mais ou séries processo de lapso de tempo. Ir para suporte on-line Fiji para obter informações detalhadas (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

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U S A. 111, 7807-7812 (2014).</li><li>Fl&#228;rdh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+DivIVA+in+polar+growth+and+morphogenesis+in+Streptomyces+coelicolor+A3(2).">Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2).</a> Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).</li><li>Young, J. 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The authors have nothing to disclose.

Microscopia de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces tem sido tecnicamente desafiador no passado. Aqui apresenta-se um protocolo robusto para realizar processamento de imagem de células vivas do ciclo de vida completo utilizando fusões de proteínas fluorescentes para o marcador DivIVA polaridade celular e a divisão celular proteína FtsZ para ajudar a visualizar e detectar a progressão através do programa de desenvolvimento (Figura 2). Central ao presente método é a cultura de S. venezuelae em um dispositivo micro que permite perfusão média constante e a troca de meio de crescimento normal (MYM-TE) com meio gasto (gasto MYM-TE). A mudança de condição de cultura é importante para o protocolo descrito porque o downshift nutricional como poços como quaisquer sinais extracelulares ainda não identificados (por exemplo, detecção do quórum sinais) no meio de cultura gasto, promover a esporulação, ao passo que um fornecimento contínuo de meio rico em nutrientes estimula growt vegetativoh, com quase nenhuma formação de esporos (dados não mostrados). Assim, a cultura de células neste sistema microfluídico é superior para a cultura de células em agarose, pois oferece uma maior flexibilidade e experimental permite a monitorização de longo prazo de alterações de crescimento bacteriano em resposta à mudança das condições de cultura. Embora as placas microfluídicos são projetados para uso único, o fluxo canais que não foram inoculados com células podem ser utilizados em experiências posteriores. Recomendamos a utilização de todos os canais de uma placa de microfluidos dentro de uma semana, como temos experimentado problemas de vedação do colector de placas que foram abertas por mais tempo. Quando da criação de uma experiência, verificou-se que os esporos preparados de fresco germinado dentro de duas horas de serem carregados para dentro da câmara de fluxo, enquanto que os esporos derivados de um estoque de glicerol congelado necessária, pelo menos, 6 horas antes de tubos germinais, emergiu (dados não mostrados). Este atraso na germinação prolonga a duração da experiência e podem interferir coma disponibilidade do equipamento e das condições experimentais. É também importante para iniciar a experiência com a perfusão de PJM-TE para, pelo menos, três horas para proporcionar nutrientes suficientes para o desenvolvimento e crescimento de tubos germinativos. Perfusão com MYM-TE pode ser estendido para além do 3 hr inicial se o experimento é projetado para estudar o crescimento vegetativo. Enquanto esporos proporcionar a escolha de material de partida preferido, os fragmentos de hifas curta também pode ser carregado para a placa de microfluidos. No entanto, a eficiência de carga quando se utiliza micélio cortado é significativamente menor e muitas vezes requer várias corridas de carga que pode ser uma limitação ao examinar mutantes não-esporulantes. Independentemente do tipo de inóculo utilizado, é importante não sobrecarregar a câmara de cultura com esporos ou fragmentos de hifas como isso vai levar a superlotação rápida, que pode interferir com a difusão da mídia e complicar a análise de imagem. É importante planejar a construção de proteínas repórter carefully para uso na fluorescência de imagem time-lapse em Streptomyces. comprimento do ligante entre a proteína alvo e o repórter fluorescente e a escolha de N- ou fusões de terminal C pode ser crítica. Além disso, as condições experimentais ótimas, incluindo a frequência de imagem e tempo de exposição, precisa ser determinado antecipadamente para cada proteína fluorescente-marcadas. S. venezuelae hifas exibem auto-fluorescência no canal verde / amarelo, que pode tornar-se problemática quando imagiologia de uma proteína marcada com fluorescência que é expressa em níveis baixos. Além disso, deve notar-se que, durante a germinação e a fase de crescimento vegetativo inicial, S. venezuelae é particularmente sensível à luz de curto comprimento de onda (por exemplo, quando se utiliza proteínas de fusão para PCP). Apesar dos contínuos avanços nas técnicas de imagem e sistemas repórter fluorescentes para imagens ao vivo de células de bactérias, a maioria dos pacotes de software (por exemplo MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) para o processamento automatizado subsequente destes tipos de conjuntos de dados não suportam a análise de imagens derivadas de bactérias filamentosas com um estilo de vida multicelular 27-29. Assim, existe uma necessidade de desenvolver um algoritmo adequado para a análise de alto rendimento quantitativo de dados de imagem a partir de Streptomyces e outras bactérias filamentosas. Em resumo, o trabalho aqui descrito demonstra o imenso potencial de S. venezuelae como um novo sistema de desenvolvimento modelo para o género, devido à sua capacidade de esporulação em líquido. O dispositivo microfluídico cultura é simples de usar, mesmo para usuários inexperientes. Ele fornece uma excelente plataforma para estudar processos biológicos celulares centrais para o ciclo de vida Streptomyces, incluindo localização dinâmica de proteína, o crescimento polarizado, ea diferenciação morfológica de um micélio multicelular em cadeias de esporos unigenomic. Além disso, este conjunto experimental up também fornece um ponto de partida atraente para investigar acontecimentos do desenvolvimento que requerem alternadas condições de cultura, ou a utilização de corantes fluorescentes, tais como D-aminoácidos fluorescentes para monitorizar a síntese do peptidoglicano ou iodeto de propídio e 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) organização de visualizar cromossoma 30,31.

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Mark Buttner
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Mark J. Buttner

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The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes são bactérias que vivem no solo, que se caracterizam por um ciclo de desenvolvimento complexo envolvendo diferenciação morfológica a partir de, um micélio multicelular de remoção de nutrientes para dormentes, esporos unigenomic 1-3. Sob condições favoráveis ​​de crescimento, um esporo Streptomyces típicos começa a germinar por extrusão de um ou dois tubos germinais (Figura 1). Estes tubos alongados por extensão ponta e crescer em uma rede de hifas ramificadas conhecido como o micélio vegetativo. crescimento polar e ramificação das hifas é dirigido pelo DivIVA proteína essencial. Esta proteína de filamento helicoidal é parte de um grande complexo citoplasmático chamado o polarisome, que é crucial para a inserção de material novo envelope celular na ponta que se estende 4-7. Durante o crescimento vegetativo, os filamentos tornam-se hifas compartimentada pela formação frequente de chamadas paredes transversais 8. A formação destas paredes transversais re<html> quires FtsZ, a proteína do citoesqueleto afim da tubulina, que é essencial para a divisão celular na maioria das bactérias 9. Em Streptomyces, no entanto, estas paredes transversais vegetativas não conduzem à constrição e célula-célula de separação e, por conseguinte, a massa de micélio permanece como uma rede de compartimentos interligados sinciciais. Em resposta a limitação de nutrientes e de outros sinais que não são bem compreendidos, hifas aéreas especializado romper a partir do micélio vegetativo e crescer para o ar 3. A construção destas estruturas inicia a fase de desenvolvimento reprodutivo, durante o qual a longa hifas aéreas multi-genómico tornar-se dividida em dezenas de compartimentos prespore unigenomic de tamanho igual. Este evento divisão celular massiva é impulsionado pela constrição síncrono de múltiplos anéis FtsZ numa única esporogênico 2,10 hifas. diferenciação morfológica é completado pela liberação de dormentes, esporos, pigmentadas de paredes espessas. t &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> Figura 1:. O ciclo de vida de Streptomyces em meios sólidos Este é um modelo do ciclo de vida com base em estudos clássicos de S. coelicolor crescimento em placas de agar. O desenvolvimento celular de um esporo começa com a formação de um ou dois tubos germinais, que crescem por extensão ponta para formar uma rede de hifas ramificadas. crescimento polar e ramificação das hifas vegetativas é dirigido por DivIVA (vermelho). A formação de paredes transversais vegetativas requer FtsZ (verde). Em resposta às limitações de nutrientes e de outros sinais, hifas aéreas são erguidas. Prisão de crescimento aéreo está estreitamente coordenada com a montagem de uma escada de FtsZ-rings, que dão origem aos septos esporulação que compartimentalizar as hifas esporogênico em compartimentos prespore box-like. Estes compartimentos montar uma parede de esporos de espessura e, eventualmente, são RELEAsed esporos pigmentados como maduros. Os eventos de desenvolvimento chave do ciclo de vida de Streptomyces estão bem caracterizados 1,3. No entanto, o que ainda é escasso são estudos com células biológicas que empregam microscopia de lapso de tempo de fluorescência para fornecer informações sobre os processos subcelulares que sustentam a diferenciação, como a dinâmica de localização de proteínas, o movimento dos cromossomas e divisão celular developmentally controlada. Processamento de imagem de células vivas do desenvolvimento Streptomyces tem sido um desafio devido à complexidade do ciclo de vida e as características fisiológicas do organismo. Estudos anteriores sobre o crescimento vegetativo e as fases iniciais da formação de septos esporulação empregaram câmaras de imagem permeável ao oxigénio, ou o crescimento de agarose-suportado de Streptomyces coelicolor num palco de microscópio 11-15. Estes métodos, no entanto, está limitado por um número de factores. Alguns sistemas só permitem imagiologia de curto prazo de um crescimento celulard proteínas fluorescentes antes que as células sofrem de fornecimento de oxigénio insuficiente ou crescer para fora do plano focal devido ao padrão tridimensional de desenvolvimento de hifas. Nos casos em imagiologia de longo prazo é possível, as células sobre os limites de almofadas de agarose flexibilidade experimental cultivo porque as células não podem ser expostos a condições de crescimento ou de stress alternativos, e a fluorescência de fundo do meio nas almofadas de agarose limita severamente a capacidade de monitorar fluorescente fraco sinais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a criação de imagens de células vivas do ciclo de vida completo Streptomyces com excelente precisão e sensibilidade. Ao cultivar Streptomyces num dispositivo de microfluidos ligado a um microscópio de fluorescência widefield (Figura 2), que agora são capazes de monitorizar a germinação, o crescimento vegetativo e a formação de septos esporulação ao longo de um período de tempo de até 30 horas. Isto é muito facilitada pela utilização dos novos Streptomyces organismo modelo </em&gt; venezuelae porque esporula a conclusão perto em cultura submersa e desse modo ultrapassa a limitação da espécie S. modelo clássico coelicolor, que esporula apenas em meios sólidos 16-20. Para ajudar a visualizar o crescimento vegetativo e esporulação, que co-expressam fluorescente etiquetado versões do DivIVA marcador polaridade celular ea proteína divisão celular chave FtsZ. Nós estamos usando um dispositivo microfluídico disponível comercialmente que tem sido empregada com sucesso para micobactérias, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e fermento 21-25. O sistema retém as células num único plano focal e permite o controlo da perfusão contínua do meio de cultura a partir de reservatórios diferentes. No protocolo detalhado que aproveitar este recurso para expor S. venezuelae micélio vegetativo de uma redução de marcha nutricional para promover a esporulação. O protocolo decrito é para geração de imagens ao vivo de células de todo o ciclo de vida Streptomyces, mas as condições mídia alternativa ou configurações de microscópio pode ser escolhido se estágios de desenvolvimento específicas são de particular interesse. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema representando o fluxo de trabalho experimental. Os três passos principais descritos no protocolo são mostrados. Em primeiro lugar, os esporos e o meio gasto são preparados a partir de uma cultura de fase estacionária. Em segundo lugar, os esporos frescos são carregados para um sistema de microfluidos e S. venezuelae é trabalhada por todo o seu ciclo de vida de desenvolvimento usando um microscópio invertido completamente automatizado, com uma câmara de incubação para manter uma temperatura óptima de crescimento. Em terceiro lugar, a série de lapso de tempo obtidos são analisados ​​e processados ​​usando o software de código aberto Fiji.

<table><tbody><tr><td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td><td>Merck-Millipore</td><td>B04A-03-5PK</td><td>Microfluidic culture plates</td></tr><tr><td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td><td>Merck-Millipore</td><td>EV-262</td><td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td></tr><tr><td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td><td>Zeiss</td><td>411857-9061-000</td><td>Environmental chamber surrounding the microscope</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td></td></tr><tr><td>Ocra FLASH 4 V2</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator HXP 120V</td><td>Zeiss</td><td>423013-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489046-9901-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td></tr><tr><td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td><td>Zeiss</td><td>489063-0000-000</td><td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td></tr><tr><td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td><td>Zeiss</td><td>000000-1272-644</td><td>Stage holder for microfluidic plate</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>Zeiss</td><td>410135-1002-120</td><td>Microscope control software</td></tr><tr><td>ZEN Module Time Lapse</td><td>Zeiss</td><td>410136-1031-110</td><td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td></tr><tr><td>ZEN Module Tiles/Positions</td><td>Zeiss</td><td>410136-1025-110</td><td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>open-source software package</td><td>&lt;u&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/u&gt;</td><td>Generation of time-lapse movies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 4 g Maltose&lt;br/&gt; 4 g Yeast extract&lt;br/&gt; 10 g Malt extract&lt;br/&gt; add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td><td></td><td></td><td>Sporulation medium used to culture &lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; SV60</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;R2 Trace element solution (TE)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 8 mg ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 40 mg FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;-10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 2 mg (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;Mo&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;24&lt;/sub&gt;-4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; add 200 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; Autoclave and store at 4 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td><td></td><td></td><td>Add 0.002 volumes to MYM</td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filters</td><td>Satorius stedim</td><td>16532-K</td><td>Preparation of spent MYM-TE</td></tr><tr><td>SV60</td><td>John Innes Centre strain collection</td><td></td><td>&lt;em&gt;S. venezuelae&lt;/em&gt; strain expressing &lt;em&gt;divIVA-mcherry&lt;/em&gt; and &lt;em&gt;ftsZ-ypet&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

O processamento de imagem de células vivas bem sucedida de toda a S. ciclo de vida venezuelae produz uma série temporal contínua, incluindo os estágios de desenvolvimento chave de germinação, crescimento vegetativo e esporulação (Figura 3, Filme 1). A visualização da progressão através do ciclo de vida é ainda reforçada pela localização subcelular distinta de DivIVA-mCherry e FtsZ-YPet. Durante a germinação e crescimento vegetativo, DivIVA-mCherry acumula exclusivamente nas pontas das hifas crescem ou marcas recém-formando pontos de ramificação (Figura 4A). Estes resultados estão em linha com o posicionamento subcelular anteriormente relatados de DivIVA 12,26. Em contraste, FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis individuais em intervalos irregulares no micélio crescente (Figura 4B). Estas estruturas proporcionam o andaime para a síntese de não-constritiva paredes transversais vegetativas, levando à formação de interconncompartimentos de hifas ete 8. A diferenciação celular de crescer hifas em hifas esporogênico se torna visível pelo desaparecimento da polar focos DivIVA-mCherry, a prisão de crescimento polar eo aumento concomitante de FtsZ-YPet de fluorescência (Figura 4C). Em esporulação hifas, o padrão de localização de FtsZ-YPet muda drasticamente; primeiros helicoidais filamentos FtsZ-YPet cair ao longo da hifa e, em seguida, em um evento súbito, quase síncrono, estas hélices se aglutinam em uma escada de anéis de FtsZ-YPet regularmente espaçados. Sob as condições experimentais descritas aqui, essas escadas FtsZ-YPet uniformemente distribuídos persistir durante aproximadamente 2 h. Finalmente, esporulação septos se tornar perceptível nas imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) (Figura 4D) e, eventualmente, novos esporos são liberados. O protocolo subsequente que descreve o processamento de imagem usando o software Fiji prevê o<html> TEP-a-passo de como produzir um filme para a publicação da série de lapso de tempo adquirida (Filme 1). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> Figura 3: Fotografias instantâneas de uma série de microscopia de fluorescência representante de lapso de tempo de S. venezuelae produzir fluorescente etiquetado FtsZ (verde) e DivIVA (vermelho) São mostrados os quadros selecionados de imagens fundidas (painel superior: RFP-YFP-DIC, painel inferior: DIC). visualizar o ciclo de vida Streptomyces incluindo germinação, crescimento vegetativo e esporulação. Imagens foram tiradas de Filme 1. O tempo é na hr: min. Barras de escala = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> d / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Os resultados representativos para uma bem sucedida série de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces (A) Localização dos DivIVA-mCherry.. Mostrado são instantâneos da dois pontos de tempo subsequentes do Filme 1 com imagens fundidas da SDP e canais DIC. DivIVA-mCherry marca novos sites de hifas Branch (cabeça da seta cheia) e localiza na ponta de hifas para direcionar o crescimento polar (ponta de seta aberta). Barra de escala = 10 mm (B) FtsZ-YPet localização durante o crescimento vegetativo (cabeça de seta). FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis individuais (painel superior) que não se contraem (DIC, painel inferior). (C) FtsZ-YPet (verde) de localização durante a septação esporulação. focos DivIVA-mCherry são mostrados em vermelho, com o tempo decorrido representado abaixo (hr: min). Barra de escala: 5 um. (D) correspondente imagens DIC das hifas esporulados a partir de (C) que mostra a formação de compartimentos prespore com septos esporulação visível (imagem da esquerda), que eventualmente amadurecer em uma cadeia de esporos (imagem à direita). O tempo é na hr: min. Scale bar = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Quadro do Filme 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> Filme 1: Time-lapse série microscopia de fluorescência dos Streptomyces venezuelae ciclo de vida O filme consiste de imagens RFP-YFP mescladas (esquerda) e as imagens correspondentes contraste de interferência diferencial (DIC) (à direita).. DivIVA-mCherry é mostrado em vermelho e FtsZ-YPet em verde. O intervalo de tempo entre quadros individuais é de 40 min. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver thi</a>s filme.

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Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluorescência tempo-lapso da completa<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo de Vida Usando um dispositivo micro

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.8K visualizações.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Vídeo: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengenharia

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Imagem latente da Live-pilha fluorescência de completa ciclo vegetativo celular do lento crescimento Social bactéria Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Bioquímica

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Biologia do Desenvolvimento

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biologia

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Neurociência

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Formação de esferoides multicelulares para análise metabólica e de hipóxia baseada em FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autor em destaque: Padronizando métodos de formação de esferóides para análise metabólica e de oxigenação usando microscopia de imagem de fluorescência

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Fluorescência tempo-lapso da completa

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Simples dispositivos microfluídicos para

Imagem latente da Live-pilha fluorescência de completa ciclo vegetativo celular do lento crescimento Social bactéria Myxococcus xanthus

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Visualizando Único complexos moleculares In Vivo Usando microscopia de fluorescência avançada

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares