The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).

1. Isolamento de fresco S. venezuelae Esporos e Preparação de Gasto Meio de Cultura <ol><li> Inocular 30 ml de maltose-Yeast Extract Extracto de Malte (PJM) médio, suplementado com 60 ul R2 solução oligoelemento (TE), com 10 esporos ul de tensão SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mCherry P FtsZ -ftsZ-ypet)]. Para o crescimento consistente e esporulação das células, utilizar um balão ou um balão confuso que contém uma mola para permitir arejamento suficiente. </li><li> Células de cultura de 35-40 h a 30 ° C e 250 rpm. </li><li> Examine as células por microscopia de contraste de fase líquida montado. Neste ponto fragmentos de micélio e esporos será visível. </li><li> Centrifugar 1 ml de células numa centrífuga de mesa a 400 xg durante 1 min para sedimentar o micélio e os fragmentos de células maiores. </li><li> Transferir aproximadamente 300 ul co sobrenadantentaining uma suspensão de esporos para um novo tubo de 1,5 ml e manter em gelo. Manter o meio de cultura restante para o passo 1.7. </li><li> Diluir esporos 1:20 em MYM-TE (concentração final: 0,5-5 x 10 7 esporos / ml) e manter em gelo até ser necessário (veja o passo 2.3). Nota: Embora as condições exatas que desencadeiam esporulação em Streptomyces não são compreendidos, utilizando meio MYM-TE gasto, incluindo quaisquer sinais extracelulares desconhecidos de uma cultura esporulação, estimula a esporulação. </li><li> Filtro-esterilizar 10 ml do meio de cultura restante para obter passou MYM-TE que é livre de esporos e fragmentos de micélio. Usar um filtro de seringa estéril de 0,22 um e transferência gasto PJM-TE para um tubo estéril de 15 ml. </li><li> Mantenha o preparado passou MYM-TE por alguns dias a 4 ° C, se experimentos adicionais usando condições de crescimento semelhantes devem ser conduzidos. </li></ol> 2. Preparação do Dispositivo de microfluidos Nota: Cada pla microfluídicote permite até quatro experiências independentes para ser realizado. Para evitar a contaminação das câmaras de fluxo não utilizados, usar soluções estéreis e condições de trabalho quando a criação de um experimento. <ol><li> Remoção da solução de transporte a partir da placa de microfluidos e lavar os poços com estéril MYM-TE. </li><li> Adicionar 300 ul MYM-TE para a entrada do poço 1 e 300 ul passou MYM-TE para poços de 2 a 6. </li><li> Carregar 40 ul diluída esporos do passo 1.6 em células de carga 8 da pista assim &quot;A&quot; e selar o colector para a placa de acordo com instruções do fabricante. </li><li> Inicie o software de controle de microfluídica, selecione o tipo de placa apropriado e estabelecer um programa de fluxo para preparar o canal de fluxo e câmara de cultura por meio de fluxo de poços de entrada de 1 a 5 a 6 psi por 2 min por poço. </li><li> No software de controlo microfluidos, criar um protocolo de fluxo para a experiência: fluir PJM-TE da entrada de um bem durante 6 horas para permitir a germinação e o crescimento vegetativo das células. Interruptorem seguida, a perfusão de gasto PJM-TE da cavidade 2 a 5, para o restante tempo da experiência. Durante o decurso da experiência manter o fluxo constante a pressão a 6 psi (correspondendo a cerca de 9 ul de meio / h). Iniciar o fluxo de programa depois do passo 3.5. </li></ol> 3. Set Up do microscópio e do Protocolo de Time-lapse Nota: Este método foi implementado em um microscópio invertido widefield totalmente motorizada e automatizado equipado com uma câmera scmos, uma lâmpada de metal-halogeneto, um autofocus hardware, um suporte de palco para placas de 96 poços e uma câmara ambiental. <ol><li> Pré-aquecer a câmara ambiental a 30 ° C em avanço, a fim de evitar problemas com a focagem automática, depois de começar a experiência. O tempo necessário depende da câmara ambiental utilizado, o microscópio e o sistema de aquecimento. Começam a aquecer o sistema na noite antes do experimento. </li><li> Ligue o microscópio e automação de microscopia e controle softwaré. Use uma alta abertura numérica (NA) objectiva de imersão em óleo para a coleta de sinal ótima e resolução espacial, como um 100X, 1,46 NA óleo objectivo DIC. Escolha filtros adequados e espelhos dicromáticos para adquirir imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) e imagens de fusões de proteínas amarelo-fluorescente e vermelho fluorescentes. </li><li> Coloque uma gota de óleo de imersão para o objectivo e adicionar fluido de imersão até ao fundo da janela de imagem na placa de microfluidos para melhorar-foco celular durante a aquisição de imagem. Cuidadosamente montar o dispositivo de microfluidos selado (passo 2.5) sobre a fase de microscópio invertido. Certifique-se de que a placa está firmemente colocado no suporte de fase e não mudar ao longo do curso do experimento. </li><li> Traga a janela de imagem da câmara de cultura microfluídico em foco usando os marcadores de posição embarcados para orientação. Concentre-se para a parte mais à esquerda da primeira câmara de escoamento (identificadas como &quot;A&quot;) com o tamanho armadilha 5, correspondendo auma altura armadilha de 0,7 um. </li><li> No software microfluidos, células de carga entre a entrada bem 8 a 4 psi durante 15 seg. Verifique a densidade de células na câmara de cultura movendo o palco ao longo da janela de imagem. Se não há esporos foram presos, repetir o passo de carregamento de células ou, alternativamente, aumentar a pressão de carga e / ou o tempo até que a densidade celular desejada é atingida (1-10 esporos por janela de imagem com 2.048 x 2048 pixels). Evite sobrecarregar a câmara de cultura. Nota: Nós normalmente usamos tamanho armadilha 5 para imagiologia Streptomyces, mas nós também obtiveram bons resultados com a armadilha dos tamanhos 4 e 3. Consulte o manual do fornecedor para obter outras sugestões sobre como otimizar o processo de carregamento celular. </li><li> Inicie o programa de fluxo no software de controlo a partir do passo 2.5 e permitir que a placa de microfluidos para aquecer-se equilibrar durante 1 hora na platina do microscópio antes de iniciar a aquisição de imagem. </li><li> No software de controle de microscópio, configurar uma aquisição multi-dimensional para tomar multiple imagens em várias posições de fase ao longo do tempo: <ol><li> Para Autosave: Diretório especificar para a gravação automática dos arquivos de imagem. </li><li> Para as configurações de iluminação, determinar as configurações de iluminação ideal para cada construção específica com antecedência. Para o experimento delineado, utilize os seguintes tempos de exposição: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms. </li><li> Para o período de-série: configurar uma série de tempo para adquirir imagens nos pontos de tempo desejado em sequência. Para imagiologia do ciclo de vida de S. venezuelae, selecione um intervalo de tempo de 40 minutos ao longo de um período de 24 horas. </li><li> Para os cargos de palco e autofocus: digitalizar a câmara de cultura, movendo as posições de palco e palco loja para cada posição de imagem de interesse. Certifique-se de que as posições de estágio único estão localizados suficientemente distante para minimizar a fotodegradação e phototoxicity.Typically usar até 12 posições. Executar rotina autofocus para cada ponto de tempo para corrigir o desvio focal lento. Se estiver disponível no software de controle de microscópio, A estratégia de foco automático definido como &quot;atualização superfície local, autofocus hardware&quot;. Uma vez que os Z-coordenadas das posições estágio selecionados são verificados, ativar o autofocus hardware. </li></ol></li><li> Iniciar o experimento de lapso de tempo no software de controle de microscópio. </li><li> Verifique se todas as posições de palco ainda estão em foco em pontos posteriores. Para experiências de lapso de tempo que funcionam ao longo de várias horas, ocasionalmente observar um desvio palco mesmo quando utilizando a focagem automática. Se as posições de estágio necessário recentrar, interromper a experiência a um ponto de tempo apropriado, ajustar o foco e reiniciar o experimento dentro do intervalo de tempo de imagem definido (passo 3.7.3). Veja o passo 4.3 para saber como concatenar a série temporal. </li><li> Pare a aquisição de imagem depois de 24-30 horas, ou quando as hifas na região de interesse foram diferenciadas em esporos (ver série de imagens DIC). Pare de programa de fluxo no software e desmontar o dispositivo microfluídico. </li><li> Prepare placa microfluídico utilizado para sto de curto prazoraiva. Remover restante MYM-TE e passou MYM-TE do poço 1 a 6, resíduos poço vazio 7 e carregamento de células bem 8. Em condições estéreis, re-fill poços de pista &quot;A&quot; e poços de pistas não utilizados ( &quot;B&quot;, utilizado para &quot;D&quot;) na placa com estéril salina tamponada com fosfato (PBS). Selar a placa com parafilme para evitar que ela seque e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 4. Geração de Time-lapse Filmes Usando Fiji Software Nota: Observamos que diferentes pacotes de software comercial e livre estão disponíveis para processar imagens de microscopia de lapso de tempo, incluindo ZenBlue, Metamorph, gelado, ImagePro ou ImageJ. Aqui vamos nos concentrar em Fiji, que é um programa de processamento de imagem de código aberto baseado em ImageJ, e que já oferece uma série de plugins pré-instalados úteis. <ol><li> dados de imagem de transferência de sua experiência de lapso de tempo a um computador que tenha instalado Fiji. </li><li> Lançamento do programa e importar o arquivo de imagem usando o &amp;# 34; File&gt; Import&gt; Bio-Formatos &quot;. Ou simplesmente arrastando o arquivo de imagem em Fiji no&quot; bio-formatos opções de importação &quot;, marque a caixa&quot; canais de divisão &quot;para obter uma pilha de imagem separada para cada canal de iluminação (DIC , RFP, YFP). </li><li> Opcional: Para mesclar as séries cronológicas em separado resultante de uma ruptura na na aquisição de imagem devido à reorientação (passo 3.9), abra respectivas pilhas de imagens e executar &quot;Imagem&gt; Pilhas&gt; Ferramentas&gt; Concatenar&quot; para cada canal (DIC, RFP, YFP ). </li><li> Avaliar a qualidade dos dados de intervalo de tempo percorrendo as pilhas de imagens. Procure por hifas que ficou em foco ao longo do tempo, mostra o crescimento micelial e, eventualmente, formar esporos (DIC pilha). Examinar a localização subcelular esperado para DivIVA-mCherry nas pontas das hifas (pilha RFP) e FtsZ-YPet formando anéis simples ou múltiplas estruturas, escada-like em vegetativa ou hifas esporogênico (pilha YFP), respectivamente. </li><li> Isolar uma região de interesse para reciclag jusanteng das imagens. microscopia de lapso de tempo, muitas vezes produz grandes arquivos que podem retardar o processamento de Fiji. Por conseguinte, recomenda-se a identificar e isolar uma região de interesse (ROI) e a realização de mais passos de processamento de imagem nesta versão mais pequena da pilha de imagem. <ol><li> Seleccionar a função &quot;Selecção retangular&quot; no menu e desenhar uma ROI rectangular na pilha de DIC, de tal maneira que as hifas em desenvolvimento são delimitados por o ROI ao longo da série de imagens. </li><li> Duplicar ROI-stack com &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Clique na barra de nome da pilha de YFP e selecione &quot;Editar&gt; Seleção&gt; Restaurar seleção&quot; no menu para restaurar a seleção retangular anterior do DIC originais pilha ao mesmo positon na pilha YFP e duplicar o ROI com &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. </li><li> Repita esse processo para a pilha de RFP. </li></ol></li><li> Alinhar as imagens na imagem Três pilhas to remover desvios estágio no plano xy ao longo do tempo. Vá até o último quadro na pilha DIC e selecione &quot;Plugin&gt; Registro&gt; StackReg&gt; RigedBody&quot; a partir do menu. Repita este passo para a RFP ea pilha de YFP. Se necessário, cortar o ROI repetindo o passo 4.5.1-4.5.3. </li><li> Opcional: Ajustar o brilho eo contraste manualmente para cada pilha de imagens com o &quot;Ajustar o brilho eo contraste da ferramenta&quot; ( &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;C&quot;) ou selecione &quot;Processo&gt; Melhorar Contraste&quot; do menu e aplicar o &quot;Normalizar&quot; comando para todas as imagens da pilha. Deve notar-se que o último comando irá alterar os valores de pixel e, portanto, pode afectar a jusante de análise de imagem. </li><li> Opcional: Combine pilhas individuais (convertido para o formato de arquivo RGB, consulte 4.11) horizontalmente ou verticalmente usando o plugin &quot;Imagem&gt; Pilhas&gt; Ferramentas&gt; Combinar&quot;. </li><li> Adicionar uma barra de escala ( &quot;Analisar&gt; Ferramentas&gt; Barra de Escala&quot;) e um batedor de tempo (&amp;# 34; Imagem&gt; Pilhas&gt; Tempo Stamper &quot;). </li><li> Salvar pilhas de imagens modificadas como uma sequência de imagens no formato &quot;tiff&quot;. Para produzir um filme, salvar como &quot;.avi&quot;. Alternativamente, série de imagens de exportação no formato QuickTime usando o &quot;Bio-Formatos&gt; Bio-Formatos Exportador&quot; plug-in e selecione a opção &quot;.mov&quot; tipo de arquivo. </li><li> Para obter imagens de quadros individuais, selecione o quadro de interesse e duplicar a imagem &quot;Ctrl&quot; + &quot;Shift&quot; + &quot;D&quot;. Alterar o tipo de imagem, resultando em &quot;RGB&quot; ou &quot;8-bit&quot; em &quot;Imagem&gt; Tipo&gt; a cor RGB ou 8-bit&quot; e salvar a imagem como &quot;tiff&quot;. Nota: Fiji oferece uma série de funções adicionais para anotar mais ou séries processo de lapso de tempo. Ir para suporte on-line Fiji para obter informações detalhadas (http://fiji.sc/Fiji). </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy.">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+fluorescent+D-amino+acids+and+their+use+for+probing+peptidoglycan+synthesis+and+bacterial+growth+in+situ.">Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ.</a> Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).</li><li>Szafran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+(TopA)+is+recruited+to+ParB+complexes+and+is+required+for+proper+chromosome+organization+during+Streptomyces+coelicolor.+sporulation.">Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation.</a> J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Microscopia de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces tem sido tecnicamente desafiador no passado. Aqui apresenta-se um protocolo robusto para realizar processamento de imagem de células vivas do ciclo de vida completo utilizando fusões de proteínas fluorescentes para o marcador DivIVA polaridade celular e a divisão celular proteína FtsZ para ajudar a visualizar e detectar a progressão através do programa de desenvolvimento (Figura 2). Central ao presente método é a cultura de S. venezuelae em um dispositivo micro que permite perfusão média constante e a troca de meio de crescimento normal (MYM-TE) com meio gasto (gasto MYM-TE). A mudança de condição de cultura é importante para o protocolo descrito porque o downshift nutricional como poços como quaisquer sinais extracelulares ainda não identificados (por exemplo, detecção do quórum sinais) no meio de cultura gasto, promover a esporulação, ao passo que um fornecimento contínuo de meio rico em nutrientes estimula growt vegetativoh, com quase nenhuma formação de esporos (dados não mostrados). Assim, a cultura de células neste sistema microfluídico é superior para a cultura de células em agarose, pois oferece uma maior flexibilidade e experimental permite a monitorização de longo prazo de alterações de crescimento bacteriano em resposta à mudança das condições de cultura. Embora as placas microfluídicos são projetados para uso único, o fluxo canais que não foram inoculados com células podem ser utilizados em experiências posteriores. Recomendamos a utilização de todos os canais de uma placa de microfluidos dentro de uma semana, como temos experimentado problemas de vedação do colector de placas que foram abertas por mais tempo. Quando da criação de uma experiência, verificou-se que os esporos preparados de fresco germinado dentro de duas horas de serem carregados para dentro da câmara de fluxo, enquanto que os esporos derivados de um estoque de glicerol congelado necessária, pelo menos, 6 horas antes de tubos germinais, emergiu (dados não mostrados). Este atraso na germinação prolonga a duração da experiência e podem interferir coma disponibilidade do equipamento e das condições experimentais. É também importante para iniciar a experiência com a perfusão de PJM-TE para, pelo menos, três horas para proporcionar nutrientes suficientes para o desenvolvimento e crescimento de tubos germinativos. Perfusão com MYM-TE pode ser estendido para além do 3 hr inicial se o experimento é projetado para estudar o crescimento vegetativo. Enquanto esporos proporcionar a escolha de material de partida preferido, os fragmentos de hifas curta também pode ser carregado para a placa de microfluidos. No entanto, a eficiência de carga quando se utiliza micélio cortado é significativamente menor e muitas vezes requer várias corridas de carga que pode ser uma limitação ao examinar mutantes não-esporulantes. Independentemente do tipo de inóculo utilizado, é importante não sobrecarregar a câmara de cultura com esporos ou fragmentos de hifas como isso vai levar a superlotação rápida, que pode interferir com a difusão da mídia e complicar a análise de imagem. É importante planejar a construção de proteínas repórter carefully para uso na fluorescência de imagem time-lapse em Streptomyces. comprimento do ligante entre a proteína alvo e o repórter fluorescente e a escolha de N- ou fusões de terminal C pode ser crítica. Além disso, as condições experimentais ótimas, incluindo a frequência de imagem e tempo de exposição, precisa ser determinado antecipadamente para cada proteína fluorescente-marcadas. S. venezuelae hifas exibem auto-fluorescência no canal verde / amarelo, que pode tornar-se problemática quando imagiologia de uma proteína marcada com fluorescência que é expressa em níveis baixos. Além disso, deve notar-se que, durante a germinação e a fase de crescimento vegetativo inicial, S. venezuelae é particularmente sensível à luz de curto comprimento de onda (por exemplo, quando se utiliza proteínas de fusão para PCP). Apesar dos contínuos avanços nas técnicas de imagem e sistemas repórter fluorescentes para imagens ao vivo de células de bactérias, a maioria dos pacotes de software (por exemplo MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) para o processamento automatizado subsequente destes tipos de conjuntos de dados não suportam a análise de imagens derivadas de bactérias filamentosas com um estilo de vida multicelular 27-29. Assim, existe uma necessidade de desenvolver um algoritmo adequado para a análise de alto rendimento quantitativo de dados de imagem a partir de Streptomyces e outras bactérias filamentosas. Em resumo, o trabalho aqui descrito demonstra o imenso potencial de S. venezuelae como um novo sistema de desenvolvimento modelo para o género, devido à sua capacidade de esporulação em líquido. O dispositivo microfluídico cultura é simples de usar, mesmo para usuários inexperientes. Ele fornece uma excelente plataforma para estudar processos biológicos celulares centrais para o ciclo de vida Streptomyces, incluindo localização dinâmica de proteína, o crescimento polarizado, ea diferenciação morfológica de um micélio multicelular em cadeias de esporos unigenomic. Além disso, este conjunto experimental up também fornece um ponto de partida atraente para investigar acontecimentos do desenvolvimento que requerem alternadas condições de cultura, ou a utilização de corantes fluorescentes, tais como D-aminoácidos fluorescentes para monitorizar a síntese do peptidoglicano ou iodeto de propídio e 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) organização de visualizar cromossoma 30,31.

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Mark Buttner
to:
Mark J. Buttner

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The middle initial J. has been added to author Mark Buttner.

Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomycetes são bactérias que vivem no solo, que se caracterizam por um ciclo de desenvolvimento complexo envolvendo diferenciação morfológica a partir de, um micélio multicelular de remoção de nutrientes para dormentes, esporos unigenomic 1-3. Sob condições favoráveis ​​de crescimento, um esporo Streptomyces típicos começa a germinar por extrusão de um ou dois tubos germinais (Figura 1). Estes tubos alongados por extensão ponta e crescer em uma rede de hifas ramificadas conhecido como o micélio vegetativo. crescimento polar e ramificação das hifas é dirigido pelo DivIVA proteína essencial. Esta proteína de filamento helicoidal é parte de um grande complexo citoplasmático chamado o polarisome, que é crucial para a inserção de material novo envelope celular na ponta que se estende 4-7. Durante o crescimento vegetativo, os filamentos tornam-se hifas compartimentada pela formação frequente de chamadas paredes transversais 8. A formação destas paredes transversais re<html> quires FtsZ, a proteína do citoesqueleto afim da tubulina, que é essencial para a divisão celular na maioria das bactérias 9. Em Streptomyces, no entanto, estas paredes transversais vegetativas não conduzem à constrição e célula-célula de separação e, por conseguinte, a massa de micélio permanece como uma rede de compartimentos interligados sinciciais. Em resposta a limitação de nutrientes e de outros sinais que não são bem compreendidos, hifas aéreas especializado romper a partir do micélio vegetativo e crescer para o ar 3. A construção destas estruturas inicia a fase de desenvolvimento reprodutivo, durante o qual a longa hifas aéreas multi-genómico tornar-se dividida em dezenas de compartimentos prespore unigenomic de tamanho igual. Este evento divisão celular massiva é impulsionado pela constrição síncrono de múltiplos anéis FtsZ numa única esporogênico 2,10 hifas. diferenciação morfológica é completado pela liberação de dormentes, esporos, pigmentadas de paredes espessas. t &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig1.jpg" /> Figura 1:. O ciclo de vida de Streptomyces em meios sólidos Este é um modelo do ciclo de vida com base em estudos clássicos de S. coelicolor crescimento em placas de agar. O desenvolvimento celular de um esporo começa com a formação de um ou dois tubos germinais, que crescem por extensão ponta para formar uma rede de hifas ramificadas. crescimento polar e ramificação das hifas vegetativas é dirigido por DivIVA (vermelho). A formação de paredes transversais vegetativas requer FtsZ (verde). Em resposta às limitações de nutrientes e de outros sinais, hifas aéreas são erguidas. Prisão de crescimento aéreo está estreitamente coordenada com a montagem de uma escada de FtsZ-rings, que dão origem aos septos esporulação que compartimentalizar as hifas esporogênico em compartimentos prespore box-like. Estes compartimentos montar uma parede de esporos de espessura e, eventualmente, são RELEAsed esporos pigmentados como maduros. Os eventos de desenvolvimento chave do ciclo de vida de Streptomyces estão bem caracterizados 1,3. No entanto, o que ainda é escasso são estudos com células biológicas que empregam microscopia de lapso de tempo de fluorescência para fornecer informações sobre os processos subcelulares que sustentam a diferenciação, como a dinâmica de localização de proteínas, o movimento dos cromossomas e divisão celular developmentally controlada. Processamento de imagem de células vivas do desenvolvimento Streptomyces tem sido um desafio devido à complexidade do ciclo de vida e as características fisiológicas do organismo. Estudos anteriores sobre o crescimento vegetativo e as fases iniciais da formação de septos esporulação empregaram câmaras de imagem permeável ao oxigénio, ou o crescimento de agarose-suportado de Streptomyces coelicolor num palco de microscópio 11-15. Estes métodos, no entanto, está limitado por um número de factores. Alguns sistemas só permitem imagiologia de curto prazo de um crescimento celulard proteínas fluorescentes antes que as células sofrem de fornecimento de oxigénio insuficiente ou crescer para fora do plano focal devido ao padrão tridimensional de desenvolvimento de hifas. Nos casos em imagiologia de longo prazo é possível, as células sobre os limites de almofadas de agarose flexibilidade experimental cultivo porque as células não podem ser expostos a condições de crescimento ou de stress alternativos, e a fluorescência de fundo do meio nas almofadas de agarose limita severamente a capacidade de monitorar fluorescente fraco sinais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a criação de imagens de células vivas do ciclo de vida completo Streptomyces com excelente precisão e sensibilidade. Ao cultivar Streptomyces num dispositivo de microfluidos ligado a um microscópio de fluorescência widefield (Figura 2), que agora são capazes de monitorizar a germinação, o crescimento vegetativo e a formação de septos esporulação ao longo de um período de tempo de até 30 horas. Isto é muito facilitada pela utilização dos novos Streptomyces organismo modelo </em&gt; venezuelae porque esporula a conclusão perto em cultura submersa e desse modo ultrapassa a limitação da espécie S. modelo clássico coelicolor, que esporula apenas em meios sólidos 16-20. Para ajudar a visualizar o crescimento vegetativo e esporulação, que co-expressam fluorescente etiquetado versões do DivIVA marcador polaridade celular ea proteína divisão celular chave FtsZ. Nós estamos usando um dispositivo microfluídico disponível comercialmente que tem sido empregada com sucesso para micobactérias, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e fermento 21-25. O sistema retém as células num único plano focal e permite o controlo da perfusão contínua do meio de cultura a partir de reservatórios diferentes. No protocolo detalhado que aproveitar este recurso para expor S. venezuelae micélio vegetativo de uma redução de marcha nutricional para promover a esporulação. O protocolo decrito é para geração de imagens ao vivo de células de todo o ciclo de vida Streptomyces, mas as condições mídia alternativa ou configurações de microscópio pode ser escolhido se estágios de desenvolvimento específicas são de particular interesse. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig2.jpg" /> Figura 2: Esquema representando o fluxo de trabalho experimental. Os três passos principais descritos no protocolo são mostrados. Em primeiro lugar, os esporos e o meio gasto são preparados a partir de uma cultura de fase estacionária. Em segundo lugar, os esporos frescos são carregados para um sistema de microfluidos e S. venezuelae é trabalhada por todo o seu ciclo de vida de desenvolvimento usando um microscópio invertido completamente automatizado, com uma câmara de incubação para manter uma temperatura óptima de crescimento. Em terceiro lugar, a série de lapso de tempo obtidos são analisados ​​e processados ​​usando o software de código aberto Fiji.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Microfluidic culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>EV-262</td>
			<td>The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer.Z1 Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Fully automated and motorized inverted widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411857-9061-000</td>
			<td>Environmental chamber surrounding the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420792-9800-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocra FLASH 4 V2</td>
			<td>Hamamatsu Photonics K.K.</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illuminator HXP 120V</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>423013-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 46 HE YFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489046-9901-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FL Filter Set 63 HE RFP shift free</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>489063-0000-000</td>
			<td>Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting frame K-M for multiwell plates</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1272-644</td>
			<td>Stage holder for microfluidic plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>Microscope control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td>Software module to set up time-lapse microscopy experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/Positions</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td>Software module to save specific stage positions (xzy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>open-source software package</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td>Generation of time-lapse movies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 
			4 g Maltose 
			4 g Yeast extract 
			10 g Malt extract 
			add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2 Trace element solution (TE) 
			8 mg ZnCl2 
			40 mg FeCl3-6H2O 
			2 mg CuCl2-2H2O 
			2 mg MnCl2-4H2O 
			2 mg Na2B4O7-10H2O 
			2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O 
			add 200 ml H2O 
			Autoclave and store at 4 oC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 0.002 volumes to MYM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Satorius stedim</td>
			<td>16532-K</td>
			<td>Preparation of spent MYM-TE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SV60</td>
			<td>John Innes Centre strain collection</td>
			<td></td>
			<td>S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence time-lapse imaging of the complete s. venezuelae life cycle using a microfluidic device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

O processamento de imagem de células vivas bem sucedida de toda a S. ciclo de vida venezuelae produz uma série temporal contínua, incluindo os estágios de desenvolvimento chave de germinação, crescimento vegetativo e esporulação (Figura 3, Filme 1). A visualização da progressão através do ciclo de vida é ainda reforçada pela localização subcelular distinta de DivIVA-mCherry e FtsZ-YPet. Durante a germinação e crescimento vegetativo, DivIVA-mCherry acumula exclusivamente nas pontas das hifas crescem ou marcas recém-formando pontos de ramificação (Figura 4A). Estes resultados estão em linha com o posicionamento subcelular anteriormente relatados de DivIVA 12,26. Em contraste, FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis individuais em intervalos irregulares no micélio crescente (Figura 4B). Estas estruturas proporcionam o andaime para a síntese de não-constritiva paredes transversais vegetativas, levando à formação de interconncompartimentos de hifas ete 8. A diferenciação celular de crescer hifas em hifas esporogênico se torna visível pelo desaparecimento da polar focos DivIVA-mCherry, a prisão de crescimento polar eo aumento concomitante de FtsZ-YPet de fluorescência (Figura 4C). Em esporulação hifas, o padrão de localização de FtsZ-YPet muda drasticamente; primeiros helicoidais filamentos FtsZ-YPet cair ao longo da hifa e, em seguida, em um evento súbito, quase síncrono, estas hélices se aglutinam em uma escada de anéis de FtsZ-YPet regularmente espaçados. Sob as condições experimentais descritas aqui, essas escadas FtsZ-YPet uniformemente distribuídos persistir durante aproximadamente 2 h. Finalmente, esporulação septos se tornar perceptível nas imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) (Figura 4D) e, eventualmente, novos esporos são liberados. O protocolo subsequente que descreve o processamento de imagem usando o software Fiji prevê o<html> TEP-a-passo de como produzir um filme para a publicação da série de lapso de tempo adquirida (Filme 1). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53863/53863fig3.jpg" /> Figura 3: Fotografias instantâneas de uma série de microscopia de fluorescência representante de lapso de tempo de S. venezuelae produzir fluorescente etiquetado FtsZ (verde) e DivIVA (vermelho) São mostrados os quadros selecionados de imagens fundidas (painel superior: RFP-YFP-DIC, painel inferior: DIC). visualizar o ciclo de vida Streptomyces incluindo germinação, crescimento vegetativo e esporulação. Imagens foram tiradas de Filme 1. O tempo é na hr: min. Barras de escala = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> d / 53863 / 53863fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Os resultados representativos para uma bem sucedida série de lapso de tempo do ciclo de vida Streptomyces (A) Localização dos DivIVA-mCherry.. Mostrado são instantâneos da dois pontos de tempo subsequentes do Filme 1 com imagens fundidas da SDP e canais DIC. DivIVA-mCherry marca novos sites de hifas Branch (cabeça da seta cheia) e localiza na ponta de hifas para direcionar o crescimento polar (ponta de seta aberta). Barra de escala = 10 mm (B) FtsZ-YPet localização durante o crescimento vegetativo (cabeça de seta). FtsZ-YPet forma estruturas semelhantes a anéis individuais (painel superior) que não se contraem (DIC, painel inferior). (C) FtsZ-YPet (verde) de localização durante a septação esporulação. focos DivIVA-mCherry são mostrados em vermelho, com o tempo decorrido representado abaixo (hr: min). Barra de escala: 5 um. (D) correspondente imagens DIC das hifas esporulados a partir de (C) que mostra a formação de compartimentos prespore com septos esporulação visível (imagem da esquerda), que eventualmente amadurecer em uma cadeia de esporos (imagem à direita). O tempo é na hr: min. Scale bar = 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/53863fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Quadro do Filme 1" src="/files/ftp_upload/53863/53863mov1.jpg" /> Filme 1: Time-lapse série microscopia de fluorescência dos Streptomyces venezuelae ciclo de vida O filme consiste de imagens RFP-YFP mescladas (esquerda) e as imagens correspondentes contraste de interferência diferencial (DIC) (à direita).. DivIVA-mCherry é mostrado em vermelho e FtsZ-YPet em verde. O intervalo de tempo entre quadros individuais é de 40 min. Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53863/movie1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver thi</a>s filme.

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Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Fluorescência tempo-lapso da completa<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Ciclo de Vida Usando um dispositivo micro

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

13.7K visualizações.  John Innes Centre, Norwich Research Park. Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

Vídeo: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Usando imagens Bioluminescent para Investigar sinergismo entre Streptococcus pneumoniae E Vírus da Influenza A em Ratos infantil

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Imunologia e Infecção

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

Isolamento e Análise do Genoma do vírus da única usando &#39;Genomics vírus simples&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non-invasive<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...