نشكر البروفيسور مايكل Klymkowsky في جامعة كولورادو في بولدر والبروفيسور نانسي Papalopulu في جامعة مانشستر لتوفير يرجى مكافحة Sox3 ومكافحة Myt1 الأجسام المضادة، على التوالي. نشكر أعضاء المختبر Papalopulu للحصول على اقتراحات الثاقبة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من شفاء دراسية مؤسسة لSZ وJL، منحتين المشروع من مؤسسة شفاء لSZ / EA وJL / EA على التوالي، منحة برنامج واحد من ويلكوم ترست لEA (WT082450MA)، واحد منحة الدعم المؤسسي الاستراتيجية من ويلكوم ترست [097820 / Z / 11 / Z].

<ol><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li>
<li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li>
<li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsoventral+patterning+in+Xenopus%3A+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li>
<li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li>
<li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li>
<li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li>
<li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-catenin%2FVegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li>
<li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li>
<li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-MyT1%2C+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li>
<li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+%28Xenopus+laevis%29%3A+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li>
<li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li>
<li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li>
<li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurogenesis+in+Xenopus%3A+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li>
<li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li>
<li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li>
<li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li>
<li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2%2F3+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469(2013).</li>
<li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li>
<li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107(2007).</li>
<li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Ca2%2B-binding+protein%2C+parvalbumin%2C+during+embryonic+development+of+the+frog%2C+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li>
<li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xaml1%2FRunx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li>
<li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+%28FISH%29+on+whole+mounts+and+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li>
<li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTransgenesis%3A+a+cross-species%2C+modular+transgenesis+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li>
<li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter%3A+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li>
<li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن هنا لشرح طريقة مريحة وفعالة لتصور الخلايا العصبية الأولية في أجنة القيطم. يسمح هذا الأسلوب تقييم أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية متباينة باستخدام خلية علامات نوع محدد. بروتوكول قوي عموما مع مستوى عال جدا من التكاثر. للأجنة التي هي في مراحل الفقس مسبقا (أي ما يصل لمرحلة 28)، ونحن نوصي إزالة الغشاء المحي قبل تثبيت يدويا كما يسمح هذا الأجنة إلى سدل بالكامل قبل التثبيت. هذا مهم بشكل خاص عند جمع الأجنة في مراحل مبكرة نسبيا (قبل الفقس)، منذ الأجنة عازمة صعبة للغاية لترتيب في الاتجاه المطلوب داخل غرفة في تصاعد مستمر. لم نشهد فقدان المناعة بعد MEMFA أو PFA تثبيت بالتالي إضافية خطوة استرجاع مستضد ليس من الضروري لهذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، وهذايمكن أن يتم إجراء المناعية في عينات من مولد اللون / الفلورية في الموقع التهجين. في هذا السيناريو، فمن المستحسن لتخطي البروتيني K خطوة العلاج خلال الموقع في بروتوكول التهجين. بعد مولد اللون / الفلورسنت رد فعل الركيزة، والعينات ويمكن غسلها مع TBS وجزءا لا يتجزأ من حل الجيلاتين الأسماك بطريقة مشابهة لMEMFA / PFA عينات ثابتة. قارورة العينة يمكن أن تكون محمية من الضوء من خلال التفاف قارورة في رقائق الألومنيوم إذا كان سيتم تصويرها الفلورية في الموقع التهجين مع تلوين مناعي في وقت لاحق. في بعض الحالات، قد الأجنة يتقلص بشكل مفرط بعد اختراق الجيلاتين. وعلى الأرجح سبب ذلك إما غير كافية أو غير كافية تثبيت استخراج TBS-تريتون. ضمان أن الأجنة قد تم علاجها في PFA / MEMFA لمدة 2-3 على الأقل ساعة أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا استمرت المشكلة، وزيادة وقت غسل TBS-تريتون إلى 3 لمدة 1 ساعة. أثناء البرد التقطيعةنينغ، جمود كتلة عينة قد تختلف دفعات مختلفة اعتبارا من الجيلاتين الأسماك لها خصائص مختلفة. هذه المشكلة يمكن تعويضه جزئيا عن طريق ضبط درجة حرارة مشراح. وهناك انخفاض درجة الحرارة يؤدي إلى &quot;صعوبة&quot; كتلة عينة لكن تحت درجة حرارة منخفضة المفرطة يصبح كتلة العينة هش ويصعب القسم. بعض صقل أو ممارسة (باستخدام كتل عينة وهمية دون الأجنة) قبل كل باجتزاء قد يكون من المفيد قبل استخدامها على عينات قيمة خاصة. وهناك مشكلة تصادفها أثناء باجتزاء هي الشرائح الرقيقة تميل أحيانا إلى عصا على لوحة زجاجية سميكة بدلا من البقاء شقة في مرحلة الصلب. هذا يمكن أن يكون لا سيما تعطيل لأنه يقطع باستمرار عملية باجتزاء مستمرة. وعادة ما تسبب هذه الحالات من جانب واحد من سببين: غرفة الباب و (خصوصا) لوحة زجاجية سميكة لا يجري الباردة بما فيه الكفاية، أو الإفراط في تهمة ثابتة على الجهاز وسperator، خصوصا في الطقس الجاف. الأول يمكن حلها من خلال رفض درجة حرارة الجزء الغرفة وترك لوحة من الزجاج داخل لوقت اضافي (ربما بين عشية وضحاها). وهذا الأخير من خلال زرع جذور ناظم البرد بشكل صحيح. يمكن ربط السطح المعدني للناظم البرد إلى الاستفادة من المعدن أو نظام أنابيب المياه مماثلة مصنوعة من المعدن يكون وسيلة بديلة للافراج عن رسوم ثابتة. بعد كل استخدام، يجب غسلها لوحة زجاجية سميكة بشكل جيد مع المنظفات غير قابلة للتآكل (مثل سوائل غسل الاطباق)، تشطف بماء عالى النقاء، رش مع الإيثانول النقي، وملفوفة في منشفة ورقية لحماية سطح وحواف من الاضرار. الأجسام المضادة المدرجة في بروتوكول محددة عموما، ونحن نادرا ما تصادف الامتزاز غير محددة أو عالية إشارة الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حالة استخدام الحرارة المعطل الماعز / لحم الضأن مصل كما منع وكيل، والإفراط في الحرارة تعطيل (كما تصور من قبل تشكيل مرسب رقيق في المصل) يجبينبغي تجنبها لأن هذا مرسب جذابة للغاية لالأجسام المضادة الثانوية ويمكن أن تسهم في مصدر خلفية عالية. ومن الممكن، والمطلوب في بعض الأحيان، لأداء مزدوج تلطيخ لتصور مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في وقت واحد. هذا المزدوج تلطيخ هو ممكن، ويعطي نتائج مرضية مع المجموعات التالية بشكل عام: Sox3 / N-الحوض أو / N-حوض Myt1. ومع ذلك، معقد المزدوج تلطيخ Sox3 وMyt1 من حقيقة أن الأجسام المضادة هما كلا من أصل أرنب. اختبرناها عدة مجموعات العلامات المباشرة الأجسام المضادة، ولكن لم يلاحظ أي نتائج مرضية (مستوى منخفض إشارة إلى الضوضاء)، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود تضخيم إشارة من الأجسام المضادة الثانوية. كان أحد النهج الممكنة للتحايل على هذه المشكلة يكون لرفع خطوط المعدلة وراثيا في القيطم، كما هو مبين أدناه. واحدة من القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه، في حين أن هذا البروتوكول يمكن فيه الكفاية ديstinguish حوضين رئيسيين من الخلايا العصبية، وهي تجمع الخلايا الجذعية العصبية، معربا عن Sox3 وMyt1، معربا عن الخلايا العصبية متباينة، إلا أنها تفتقر إلى القدرة على الكشف عن مختلف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة. هؤلاء السكان من الباطن، والتي بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، الخلايا العصبية الحركية الأساسية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية، وعادة ما تتميز الجينات علامة، وأعرب تفاضلي من 28-30. وكما ذكر أعلاه، التطورات الحديثة في تطوير متعدد الألوان في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع طريقة كشف المناعي القائم على الأجسام المضادة في الأجنة القيطم قد ملء الفجوة لكشف هؤلاء السكان من الباطن من الخلايا العصبية متباينة للتحقيق المحتملين 31. بدلا من ذلك، كما ثبت في نموذج الفئران، كما سيتم المطلوبة لرفع مجموعة أشمل من خلايا الأجسام المضادة من نوع معين لتمييز هؤلاء السكان خلية مختلفة في القيطم. أنهكما تجدر الإشارة إلى أن، كإضافة إلى هذا الأسلوب، التطورات الحديثة في التصوير الضوئي وتحليل الصور، مثل المجهر multiphoton والتعمير 3D، وتجزئة، ويمكن أيضا أن تطبق بعد التقديرات الأولية لتحقيق الملاحظات أشمل من البويضات القيطم وكذلك الأجنة المبكرة، لا سيما في ظل يعيش وضع 32،33. لذلك، لتتبع انتشار، والتمايز، وحركة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية، فإن المستوى المطلوب لإنشاء واحد أو أكثر من خطوط المعدلة وراثيا التي تأوي البروتينات الفلورية يقودها نوع محدد خلية المروج للسماح للمراقبة حية لهؤلاء السكان الخلية في وقت مبكر القيطم الأجنة. إنشاء اكس. وقد وفرت خط المورق مع العصبية محدد β تويولين المروج القيادة tauGFP وتطبيقاته على سبيل المثال لطيفة 23،34. مع تسلسل المروج الكاملة للsox3 وmyt1 تتميز في الفقاريات 35-37، فمن شولد يكون من السهل نسبيا لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا إضافية في القيطم التي ينبغي أن تساهم على نطاق واسع في كل من المجتمع القيطم ومجال أكثر العام للبحوث الخلايا العصبية الابتدائية.

في الفقاريات، وتطوير الجهاز العصبي المركزي وتشمل عدة مراحل مميزة بعد التوالي. الخطوة الأولى هي الحث العصبي، وعندما يتم تحديد خلايا الأدمة ساذجة نحو مصير العصبي بدلا من مصير البشرة. وتشارك عدة آليات تنظيمية مترابطة خلال هذه المرحلة في القيطم وأنظمة نموذج الأخرى 1،2. ويتم تنسيق هذه العملية في المقام الأول بسبب عوامل يفرز التي تنتجها الأديم المتوسط ​​الكامنة، مثل chordin، رأس، وفوليستاتين 3-7. بعد تحريض العصبي، مجموعة فرعية من الأسلاف العصبية الخروج من دورة الخلية وتبدأ في التفريق في العملية المشار إليها الخلايا العصبية كما الابتدائي. ليس كل السلائف العصبية تفرق في هذا الوقت. تستمر الخلايا العصبية السلائف المتبقية على التكاثر، وبالتالي الحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لاستمرار نمو الجهاز العصبي المركزي في جميع أنحاء التنمية وفي مرحلة البلوغ. هذه العلاقات العامةoliferating الخلايا العصبية السلائف تتميز التعبير عنها من SRY (الجنس تحديد المنطقة Y) -box 3 (sox3) الجين 8-11. يتم تحديد سكانية أخرى من الخلايا، التي الخروج من دورة الخلية والالتزام مصير متباينة، من خلال التعبير عن علامات التمايز الجيني، تويولين، بيتا 2B الدرجة بنك الاستثمار الدولي (tubb2b، N-الحوض) والمايلين عامل النسخ 1 (myt1) 12-14. هذه الخلايا العصبية متباينة في نهاية المطاف تؤدي إلى فئات مختلفة من الخلايا العصبية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، والسيارات، المشترك بين، والخلايا العصبية الحسية المتمركزة في مناطق متميزة داخل الأنبوب العصبي 15-17. في حين تم بذل جهود كبيرة لكشف الآليات التنظيمية التي تحكم الزخرفة ومصير تحديد الأحداث في الأديم الظاهر العصبي الأمامي، أحرز اهتماما أقل على التحقيق في الأحداث العصبية التي تحدث بعدمرحلة الزخرفة الأولية. في الواقع، نقل الإشارة واللوائح النسخي، وكذلك التعديلات بعد متعدية وجميع المشاركين في هذه المرحلة في وقت لاحق، والسيطرة على كل من توقيت والنسب مواصفات خلال تكوين الخلايا العصبية 18-20. وتتطلب المزيد من التحقيقات في هذه الآليات وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتصور بسهولة وتميز مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية. N-الحوض المذكور أعلاه علامات العصبية، بما في ذلك، Sox3، Myt1، و، يمكن أن توفر وسيلة للتعرف على هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا، وبالتالي توفير الأسس اللازمة للكشف عن الآليات الكامنة وراء تمايز الخلايا العصبية 21-23. وعلى الرغم من تظاهر العلامات التفاضلية للسكان الخلية العصبية في الكائنات نموذج أخرى، استغل عدد قليل نسبيا من الدراسات النظام القيطم على أكمل وجه في هذا الصدد. ويرجع ذلك أساسا إلى قلة من الأجسام المضادة متوافقة التي تحدد موثوق neur مختلفالسكان الخلية اونال في الأنبوب العصبي. هنا، نحن تصف طريقة لتصور تمايز الخلايا العصبية في الأجنة القيطم في وقت مبكر عن طريق المناعية، التي توفر نهجا قويا ومريحة للتحقيق في تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم. هذا البروتوكول يجب أن تعطي توجيهات كافية للباحثين المهتمين في التنمية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي القيطم بين مرحلة ومرحلة 26 45.

<table><tbody><tr><td>gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium (OCT)</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;85-90 &amp;deg;C Heat block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Acetone, analytical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staining jar with slide racks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-acetylated tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;488 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;555 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 Phalloidin</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

وتظهر نتائج ممثلة المقاطع العرضية من المرحلة 30 الأجنة القيطم على مختلف المستويات، وهي مقدمة الدماغ، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي، ملطخة الأجسام المضادة المختلفة (الشكل 4). كما ذكرنا، Sox3 المسمى يقع العصبية السكان خلية سلفية في المناطق القريبة من تجويف الأنبوب العصبي، في حين MyT1 المسمى الخلايا العصبية الأولية متباينة تهاجر إلى الخارج وتحديد موقع بالقرب من طبقة هامشية (الصفيحة القاعدية) في الأنبوب العصبي. مكافحة أسيتيل تويولين تسميات المحاور في الخلايا العصبية متباينة، والتي يمكن ملاحظتها داخل الأنبوب العصبي بأكمله. الجانب محددة إسقاط الموروثة أو overexpression هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في علم الأعصاب لتقييم ما إذا تحوير التعبير عن جين معين (ق) يعطل نمو وتمايز الخلايا العصبية. في مثل هذه الحالات، إما Morpholinos (موس) أو بناء الحمض النووي (ق) يحمل الموالية<html> يتم حقن الجينات يحركها moter (ق) في واحدة من اثنين عن Blastomeres في مرحلة الخلية اثنين 23. بدلا من ذلك، فإنها يمكن حقنها في البطين الدماغ تليها Electroporation لل، الأمر الذي سيؤدي إلى ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن الجين المطلوب (ق) 27. في كلتا الحالتين، سوف تقتصر آثار على جانب واحد من الجنين، مما يجعل الجانب الآخر من الجنين كما الرقابة الداخلية غير المعالجة. بعد التثبيت، باجتزاء، والمناعية، وكميا آثار ضربة قاضية الجينات / الإفراط في التعبير عن طريق العد ومقارنة أعداد الخلايا من مختلف قطاعات السكان في كلا الجانبين من الجنين. من خلال تجميع هذه البيانات من عدة أجنة، لا يمكن أن يؤديها التحليل الإحصائي. في نتائج تمثيلية لدينا، لم يحرز أي اضطراب في الأجنة. أمثلة من اضطراب الجينات وتأثيراتها على مختلف السكان الخلية العصبية ويمكن الاطلاع في المراجع 20،23. ر &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> الشكل 1: ترتيب الأجنة وتوجيهه في قسم العفن (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية متزايدة، لاحظ وقد وصفت علبة مع التاريخ، والمسرح، والتوجه للأجنة. (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي للجمعية المتزايدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> الشكل 2: توجه وموقف كتلة الجيلاتين على القرص عينة عقد (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية قسم كتلة، لاحظ أن الأجنة في موقف &quot;يرأس&quot; وكتلة الجيلاتين ورسخت سn لقرص عقد عينة من متوسطة تجميد الأنسجة في القاعدة (انظر الشكل 2B). (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي من كتلة التجمع القسم، لاحظ تراكم المتوسطة تجميد الأنسجة بين كتلة الجيلاتين والقرص عينة القابضة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> الرقم 3: باجتزاء المستمر (A) نموذج لقسم الدائرة. يجب أن تكون استدارة القرص عقد العينة وثابتة على موقف الجانب الجنين يكون مواجها لها. بعد بضع (6-10) أقسام، يتم فصل شريط طويل من البلاط قسم المستمرة بلطف من شفرة (الأزرق) باستخدام فرشاة دقيقة، ثم تحول 90 درجة على لوحة القابضة. ثم اتهم غرفة درجة الحرارة بشكل إيجابي الشريحةضغطت بقوة على الباب شريط أسفل ورفعت فورا إلى شرائح النهائية التي تم جمعها. (ب) عادة، كل شريحة يمكن أن تستوعب 2 خطوط متوازية من الشرائط، كما هو مبين. تذكر لجعل سجل مفصل على التسمية الشريحة باستخدام قلم رصاص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> الشكل 4: المقطع العرضي للمرحلة 30 اكس. المورق الضفادع الصغيرة وتلطيخ في الأنسجة العصبية، 20X. (A) الخطط التي تشير إلى مناصب النسبية (الدماغ الأمامي، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي) من قسم الطائرات على الضفادع الصغيرة القيطم. (ب) المقابلة المقاطع العرضية ملطخة مكافحة Sox3 (الأحمر)، ومكافحة الأسيتيل تويولين (GREEn)، ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية للحمامات الخلايا الجذعية العصبية وكذلك neurofilaments داخل الأنبوب العصبي. (C) الموافق المقاطع العرضية ملطخة مكافحة MyT1 (الأحمر) ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية من الخلايا العصبية الأولية المتباينة داخل الأنبوب العصبي. شريط النطاق = 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام.

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق المناعية

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K Views.  University of Manchester.  تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام. 

Video: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

يزدرع الثقافات العصبية من<em&gt; القيطم المورق</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

في وقت واحد قبل وبعد متشابك تسجيل الكهربية من<em&gt; القيطم</em&gt; العصبي العضلي المشارك الثقافات

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biology

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في

Summary

Explore More Videos

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة

الخلايا الجذعية مثل

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في

يزدرع الثقافات العصبية من

في وقت واحد قبل وبعد متشابك تسجيل الكهربية من

الحقن المجهري للحمض النووي في براعم العيون في أجنة Xenopus laevis والتصوير من GFP التعبير عن الأشجار Axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus Tadpoles

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق

المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية