نشكر البروفيسور مايكل Klymkowsky في جامعة كولورادو في بولدر والبروفيسور نانسي Papalopulu في جامعة مانشستر لتوفير يرجى مكافحة Sox3 ومكافحة Myt1 الأجسام المضادة، على التوالي. نشكر أعضاء المختبر Papalopulu للحصول على اقتراحات الثاقبة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من شفاء دراسية مؤسسة لSZ وJL، منحتين المشروع من مؤسسة شفاء لSZ / EA وJL / EA على التوالي، منحة برنامج واحد من ويلكوم ترست لEA (WT082450MA)، واحد منحة الدعم المؤسسي الاستراتيجية من ويلكوم ترست [097820 / Z / 11 / Z].

<ol>
	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain.">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise.">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus.">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li><li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4.">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li><li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsoventral+patterning+in+Xenopus:+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4.">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li><li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4.">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li><li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages.">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li><li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives.">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li><li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/VegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation.">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li><li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis.">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li><li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors.">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li><li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop.">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt/beta-catenin+signalling+during+forebrain+development.">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469 (2013).</li><li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+(FISH)+on+whole+mounts+and+sections.">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li><li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+in+living+embryos.">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo.">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن هنا لشرح طريقة مريحة وفعالة لتصور الخلايا العصبية الأولية في أجنة القيطم. يسمح هذا الأسلوب تقييم أنواع مختلفة من الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية الأولية متباينة باستخدام خلية علامات نوع محدد. بروتوكول قوي عموما مع مستوى عال جدا من التكاثر. للأجنة التي هي في مراحل الفقس مسبقا (أي ما يصل لمرحلة 28)، ونحن نوصي إزالة الغشاء المحي قبل تثبيت يدويا كما يسمح هذا الأجنة إلى سدل بالكامل قبل التثبيت. هذا مهم بشكل خاص عند جمع الأجنة في مراحل مبكرة نسبيا (قبل الفقس)، منذ الأجنة عازمة صعبة للغاية لترتيب في الاتجاه المطلوب داخل غرفة في تصاعد مستمر. لم نشهد فقدان المناعة بعد MEMFA أو PFA تثبيت بالتالي إضافية خطوة استرجاع مستضد ليس من الضروري لهذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، وهذايمكن أن يتم إجراء المناعية في عينات من مولد اللون / الفلورية في الموقع التهجين. في هذا السيناريو، فمن المستحسن لتخطي البروتيني K خطوة العلاج خلال الموقع في بروتوكول التهجين. بعد مولد اللون / الفلورسنت رد فعل الركيزة، والعينات ويمكن غسلها مع TBS وجزءا لا يتجزأ من حل الجيلاتين الأسماك بطريقة مشابهة لMEMFA / PFA عينات ثابتة. قارورة العينة يمكن أن تكون محمية من الضوء من خلال التفاف قارورة في رقائق الألومنيوم إذا كان سيتم تصويرها الفلورية في الموقع التهجين مع تلوين مناعي في وقت لاحق. في بعض الحالات، قد الأجنة يتقلص بشكل مفرط بعد اختراق الجيلاتين. وعلى الأرجح سبب ذلك إما غير كافية أو غير كافية تثبيت استخراج TBS-تريتون. ضمان أن الأجنة قد تم علاجها في PFA / MEMFA لمدة 2-3 على الأقل ساعة أو يفضل أن يكون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا استمرت المشكلة، وزيادة وقت غسل TBS-تريتون إلى 3 لمدة 1 ساعة. أثناء البرد التقطيعةنينغ، جمود كتلة عينة قد تختلف دفعات مختلفة اعتبارا من الجيلاتين الأسماك لها خصائص مختلفة. هذه المشكلة يمكن تعويضه جزئيا عن طريق ضبط درجة حرارة مشراح. وهناك انخفاض درجة الحرارة يؤدي إلى &quot;صعوبة&quot; كتلة عينة لكن تحت درجة حرارة منخفضة المفرطة يصبح كتلة العينة هش ويصعب القسم. بعض صقل أو ممارسة (باستخدام كتل عينة وهمية دون الأجنة) قبل كل باجتزاء قد يكون من المفيد قبل استخدامها على عينات قيمة خاصة. وهناك مشكلة تصادفها أثناء باجتزاء هي الشرائح الرقيقة تميل أحيانا إلى عصا على لوحة زجاجية سميكة بدلا من البقاء شقة في مرحلة الصلب. هذا يمكن أن يكون لا سيما تعطيل لأنه يقطع باستمرار عملية باجتزاء مستمرة. وعادة ما تسبب هذه الحالات من جانب واحد من سببين: غرفة الباب و (خصوصا) لوحة زجاجية سميكة لا يجري الباردة بما فيه الكفاية، أو الإفراط في تهمة ثابتة على الجهاز وسperator، خصوصا في الطقس الجاف. الأول يمكن حلها من خلال رفض درجة حرارة الجزء الغرفة وترك لوحة من الزجاج داخل لوقت اضافي (ربما بين عشية وضحاها). وهذا الأخير من خلال زرع جذور ناظم البرد بشكل صحيح. يمكن ربط السطح المعدني للناظم البرد إلى الاستفادة من المعدن أو نظام أنابيب المياه مماثلة مصنوعة من المعدن يكون وسيلة بديلة للافراج عن رسوم ثابتة. بعد كل استخدام، يجب غسلها لوحة زجاجية سميكة بشكل جيد مع المنظفات غير قابلة للتآكل (مثل سوائل غسل الاطباق)، تشطف بماء عالى النقاء، رش مع الإيثانول النقي، وملفوفة في منشفة ورقية لحماية سطح وحواف من الاضرار. الأجسام المضادة المدرجة في بروتوكول محددة عموما، ونحن نادرا ما تصادف الامتزاز غير محددة أو عالية إشارة الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أنه في حالة استخدام الحرارة المعطل الماعز / لحم الضأن مصل كما منع وكيل، والإفراط في الحرارة تعطيل (كما تصور من قبل تشكيل مرسب رقيق في المصل) يجبينبغي تجنبها لأن هذا مرسب جذابة للغاية لالأجسام المضادة الثانوية ويمكن أن تسهم في مصدر خلفية عالية. ومن الممكن، والمطلوب في بعض الأحيان، لأداء مزدوج تلطيخ لتصور مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية في وقت واحد. هذا المزدوج تلطيخ هو ممكن، ويعطي نتائج مرضية مع المجموعات التالية بشكل عام: Sox3 / N-الحوض أو / N-حوض Myt1. ومع ذلك، معقد المزدوج تلطيخ Sox3 وMyt1 من حقيقة أن الأجسام المضادة هما كلا من أصل أرنب. اختبرناها عدة مجموعات العلامات المباشرة الأجسام المضادة، ولكن لم يلاحظ أي نتائج مرضية (مستوى منخفض إشارة إلى الضوضاء)، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود تضخيم إشارة من الأجسام المضادة الثانوية. كان أحد النهج الممكنة للتحايل على هذه المشكلة يكون لرفع خطوط المعدلة وراثيا في القيطم، كما هو مبين أدناه. واحدة من القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه، في حين أن هذا البروتوكول يمكن فيه الكفاية ديstinguish حوضين رئيسيين من الخلايا العصبية، وهي تجمع الخلايا الجذعية العصبية، معربا عن Sox3 وMyt1، معربا عن الخلايا العصبية متباينة، إلا أنها تفتقر إلى القدرة على الكشف عن مختلف مجموعات فرعية من الخلايا العصبية متباينة. هؤلاء السكان من الباطن، والتي بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، الخلايا العصبية الحركية الأساسية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية، وعادة ما تتميز الجينات علامة، وأعرب تفاضلي من 28-30. وكما ذكر أعلاه، التطورات الحديثة في تطوير متعدد الألوان في الموقع التهجين جنبا إلى جنب مع طريقة كشف المناعي القائم على الأجسام المضادة في الأجنة القيطم قد ملء الفجوة لكشف هؤلاء السكان من الباطن من الخلايا العصبية متباينة للتحقيق المحتملين 31. بدلا من ذلك، كما ثبت في نموذج الفئران، كما سيتم المطلوبة لرفع مجموعة أشمل من خلايا الأجسام المضادة من نوع معين لتمييز هؤلاء السكان خلية مختلفة في القيطم. أنهكما تجدر الإشارة إلى أن، كإضافة إلى هذا الأسلوب، التطورات الحديثة في التصوير الضوئي وتحليل الصور، مثل المجهر multiphoton والتعمير 3D، وتجزئة، ويمكن أيضا أن تطبق بعد التقديرات الأولية لتحقيق الملاحظات أشمل من البويضات القيطم وكذلك الأجنة المبكرة، لا سيما في ظل يعيش وضع 32،33. لذلك، لتتبع انتشار، والتمايز، وحركة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية، فإن المستوى المطلوب لإنشاء واحد أو أكثر من خطوط المعدلة وراثيا التي تأوي البروتينات الفلورية يقودها نوع محدد خلية المروج للسماح للمراقبة حية لهؤلاء السكان الخلية في وقت مبكر القيطم الأجنة. إنشاء اكس. وقد وفرت خط المورق مع العصبية محدد β تويولين المروج القيادة tauGFP وتطبيقاته على سبيل المثال لطيفة 23،34. مع تسلسل المروج الكاملة للsox3 وmyt1 تتميز في الفقاريات 35-37، فمن شولد يكون من السهل نسبيا لإنشاء خطوط المعدلة وراثيا إضافية في القيطم التي ينبغي أن تساهم على نطاق واسع في كل من المجتمع القيطم ومجال أكثر العام للبحوث الخلايا العصبية الابتدائية.

في الفقاريات، وتطوير الجهاز العصبي المركزي وتشمل عدة مراحل مميزة بعد التوالي. الخطوة الأولى هي الحث العصبي، وعندما يتم تحديد خلايا الأدمة ساذجة نحو مصير العصبي بدلا من مصير البشرة. وتشارك عدة آليات تنظيمية مترابطة خلال هذه المرحلة في القيطم وأنظمة نموذج الأخرى 1،2. ويتم تنسيق هذه العملية في المقام الأول بسبب عوامل يفرز التي تنتجها الأديم المتوسط ​​الكامنة، مثل chordin، رأس، وفوليستاتين 3-7. بعد تحريض العصبي، مجموعة فرعية من الأسلاف العصبية الخروج من دورة الخلية وتبدأ في التفريق في العملية المشار إليها الخلايا العصبية كما الابتدائي. ليس كل السلائف العصبية تفرق في هذا الوقت. تستمر الخلايا العصبية السلائف المتبقية على التكاثر، وبالتالي الحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لاستمرار نمو الجهاز العصبي المركزي في جميع أنحاء التنمية وفي مرحلة البلوغ. هذه العلاقات العامةoliferating الخلايا العصبية السلائف تتميز التعبير عنها من SRY (الجنس تحديد المنطقة Y) -box 3 (sox3) الجين 8-11. يتم تحديد سكانية أخرى من الخلايا، التي الخروج من دورة الخلية والالتزام مصير متباينة، من خلال التعبير عن علامات التمايز الجيني، تويولين، بيتا 2B الدرجة بنك الاستثمار الدولي (tubb2b، N-الحوض) والمايلين عامل النسخ 1 (myt1) 12-14. هذه الخلايا العصبية متباينة في نهاية المطاف تؤدي إلى فئات مختلفة من الخلايا العصبية بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، والسيارات، المشترك بين، والخلايا العصبية الحسية المتمركزة في مناطق متميزة داخل الأنبوب العصبي 15-17. في حين تم بذل جهود كبيرة لكشف الآليات التنظيمية التي تحكم الزخرفة ومصير تحديد الأحداث في الأديم الظاهر العصبي الأمامي، أحرز اهتماما أقل على التحقيق في الأحداث العصبية التي تحدث بعدمرحلة الزخرفة الأولية. في الواقع، نقل الإشارة واللوائح النسخي، وكذلك التعديلات بعد متعدية وجميع المشاركين في هذه المرحلة في وقت لاحق، والسيطرة على كل من توقيت والنسب مواصفات خلال تكوين الخلايا العصبية 18-20. وتتطلب المزيد من التحقيقات في هذه الآليات وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتصور بسهولة وتميز مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية. N-الحوض المذكور أعلاه علامات العصبية، بما في ذلك، Sox3، Myt1، و، يمكن أن توفر وسيلة للتعرف على هؤلاء السكان مختلفة من الخلايا، وبالتالي توفير الأسس اللازمة للكشف عن الآليات الكامنة وراء تمايز الخلايا العصبية 21-23. وعلى الرغم من تظاهر العلامات التفاضلية للسكان الخلية العصبية في الكائنات نموذج أخرى، استغل عدد قليل نسبيا من الدراسات النظام القيطم على أكمل وجه في هذا الصدد. ويرجع ذلك أساسا إلى قلة من الأجسام المضادة متوافقة التي تحدد موثوق neur مختلفالسكان الخلية اونال في الأنبوب العصبي. هنا، نحن تصف طريقة لتصور تمايز الخلايا العصبية في الأجنة القيطم في وقت مبكر عن طريق المناعية، التي توفر نهجا قويا ومريحة للتحقيق في تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في القيطم. هذا البروتوكول يجب أن تعطي توجيهات كافية للباحثين المهتمين في التنمية في وقت مبكر من الجهاز العصبي المركزي القيطم بين مرحلة ومرحلة 26 45.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1397</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MOPS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RDD003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-010K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Freezing Medium (OCT)</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td align="right">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gloves</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;85-90&#176;C Heat block</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PAP pen</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone, analytical grade</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining jar with slide racks</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">anti-acetylated tubulin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;488 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;555 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor&#174; 647 Phalloidin</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

وتظهر نتائج ممثلة المقاطع العرضية من المرحلة 30 الأجنة القيطم على مختلف المستويات، وهي مقدمة الدماغ، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي، ملطخة الأجسام المضادة المختلفة (الشكل 4). كما ذكرنا، Sox3 المسمى يقع العصبية السكان خلية سلفية في المناطق القريبة من تجويف الأنبوب العصبي، في حين MyT1 المسمى الخلايا العصبية الأولية متباينة تهاجر إلى الخارج وتحديد موقع بالقرب من طبقة هامشية (الصفيحة القاعدية) في الأنبوب العصبي. مكافحة أسيتيل تويولين تسميات المحاور في الخلايا العصبية متباينة، والتي يمكن ملاحظتها داخل الأنبوب العصبي بأكمله. الجانب محددة إسقاط الموروثة أو overexpression هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع في علم الأعصاب لتقييم ما إذا تحوير التعبير عن جين معين (ق) يعطل نمو وتمايز الخلايا العصبية. في مثل هذه الحالات، إما Morpholinos (موس) أو بناء الحمض النووي (ق) يحمل الموالية<html> يتم حقن الجينات يحركها moter (ق) في واحدة من اثنين عن Blastomeres في مرحلة الخلية اثنين 23. بدلا من ذلك، فإنها يمكن حقنها في البطين الدماغ تليها Electroporation لل، الأمر الذي سيؤدي إلى ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن الجين المطلوب (ق) 27. في كلتا الحالتين، سوف تقتصر آثار على جانب واحد من الجنين، مما يجعل الجانب الآخر من الجنين كما الرقابة الداخلية غير المعالجة. بعد التثبيت، باجتزاء، والمناعية، وكميا آثار ضربة قاضية الجينات / الإفراط في التعبير عن طريق العد ومقارنة أعداد الخلايا من مختلف قطاعات السكان في كلا الجانبين من الجنين. من خلال تجميع هذه البيانات من عدة أجنة، لا يمكن أن يؤديها التحليل الإحصائي. في نتائج تمثيلية لدينا، لم يحرز أي اضطراب في الأجنة. أمثلة من اضطراب الجينات وتأثيراتها على مختلف السكان الخلية العصبية ويمكن الاطلاع في المراجع 20،23. ر &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> الشكل 1: ترتيب الأجنة وتوجيهه في قسم العفن (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية متزايدة، لاحظ وقد وصفت علبة مع التاريخ، والمسرح، والتوجه للأجنة. (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي للجمعية المتزايدة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> الشكل 2: توجه وموقف كتلة الجيلاتين على القرص عينة عقد (A) وتصوير كاريكاتوريا يظهر الجمعية قسم كتلة، لاحظ أن الأجنة في موقف &quot;يرأس&quot; وكتلة الجيلاتين ورسخت سn لقرص عقد عينة من متوسطة تجميد الأنسجة في القاعدة (انظر الشكل 2B). (ب) صورة تظهر مظهر طبيعي من كتلة التجمع القسم، لاحظ تراكم المتوسطة تجميد الأنسجة بين كتلة الجيلاتين والقرص عينة القابضة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> الرقم 3: باجتزاء المستمر (A) نموذج لقسم الدائرة. يجب أن تكون استدارة القرص عقد العينة وثابتة على موقف الجانب الجنين يكون مواجها لها. بعد بضع (6-10) أقسام، يتم فصل شريط طويل من البلاط قسم المستمرة بلطف من شفرة (الأزرق) باستخدام فرشاة دقيقة، ثم تحول 90 درجة على لوحة القابضة. ثم اتهم غرفة درجة الحرارة بشكل إيجابي الشريحةضغطت بقوة على الباب شريط أسفل ورفعت فورا إلى شرائح النهائية التي تم جمعها. (ب) عادة، كل شريحة يمكن أن تستوعب 2 خطوط متوازية من الشرائط، كما هو مبين. تذكر لجعل سجل مفصل على التسمية الشريحة باستخدام قلم رصاص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> الشكل 4: المقطع العرضي للمرحلة 30 اكس. المورق الضفادع الصغيرة وتلطيخ في الأنسجة العصبية، 20X. (A) الخطط التي تشير إلى مناصب النسبية (الدماغ الأمامي، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر، والحبل الشوكي) من قسم الطائرات على الضفادع الصغيرة القيطم. (ب) المقابلة المقاطع العرضية ملطخة مكافحة Sox3 (الأحمر)، ومكافحة الأسيتيل تويولين (GREEn)، ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية للحمامات الخلايا الجذعية العصبية وكذلك neurofilaments داخل الأنبوب العصبي. (C) الموافق المقاطع العرضية ملطخة مكافحة MyT1 (الأحمر) ودابي (الأزرق)، والتي تبين مواقع النسبية من الخلايا العصبية الأولية المتباينة داخل الأنبوب العصبي. شريط النطاق = 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام.

تقييم تكوين الخلايا العصبية الابتدائية في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق المناعية

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K Views.  University of Manchester.  تقدم هذه المقالة طريقة مريحة وسريعة لتصور مختلف السكان الخلية العصبية في الجهاز العصبي المركزي للأجنة القيطم باستخدام مناعي تلطيخ على أقسام. 

Video: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

يزدرع الثقافات العصبية من<em&gt; القيطم المورق</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

تقييم الظواهر الاعصاب في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

والفحص السلوكية بسيطة لاختبار وظيفة البصرية في<em&gt; القيطم المورق</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.