Wir danken Prof. Michael Klymkowsky an der Universität von Colorado in Boulder und Prof. Nancy Papalopulu in der Universität Manchester für die freundliche anti-SOX3 und anti-Myt1 Antikörper bietet, beziehungsweise. Wir danken den Mitgliedern des Papalopulu Labor für ihre interessante Vorschläge in diesem Protokoll zu entwickeln. Diese Arbeit wurde von zwei Healing Foundation studentships zu SZ und JL unterstützt, zwei Projektförderung von der Healing Foundation SZ / EA und JL / EA jeweils ein Programm Zuschuss aus dem Wellcome Trust zu EA (WT082450MA) und eine institutionelle strategische Unterstützung Zuschuss aus dem Wellcome Trust [097820 / Z / 11 / Z].

Alle Tierversuche wurden von der University of Manchester Animal Welfare Center genehmigt und wurden von einem britischen Home Office Projektlizenz abgedeckt. 1. Erhebung und Fixierung von Xenopus Embryonen <ol><li> Bereiten Sie Reagenzien und Materialien für Experimente. <ol><li> Bereiten 10x Marc-modifiziertem Ringers (MMR) , indem in etwa 800 ml Reinstwasser 56,5 g NaCl gelöst und Zugabe Stammlösungen von 1 M KCl, 1 M MgSO 4, 1 M CaCl 2 und 1 M HEPES , pH 7,4 , um eine Endkonzentration zu erreichen , von 20 mM KCl, 10 mM MgSO 4, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES. PH-Wert auf 7,4 mit 10 M NaOH und dann um das Endvolumen auf 1 l einzustellen </li><li> Sterilisieren der 10x MMR Lösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 min auf einem Flüssigkeitskreislauf. Bei der Verwendung, verdünnt mit ddH 2 O auf 0,1 × Endkonzentration und fügen 20 mg / L Gentamycin mikrobielles Wachstum zu hemmen. </li><li> Machen 10x TBS-Lösung durch Mischen von 24 g Tris-HCl, 5,6 g Tris-base, 88 g NaCl und in etwa 900 ml Reinstwasser gelöst wird. Die endgültige Lösung einen pH-Wert von etwa 7,6 haben. Passen Sie entweder mit 10 M NaOH oder konzentrierter HCl einen endgültigen pH-Wert von 7,6 und endgültige Volumen auf 1 L. zu erreichen </li><li> verwenden, stellen Sie 1x TBS Nach durch Verdünnen von 1 Teil 10x TBS-Lösung mit 9 Teilen Reinstwasser. </li><li> Machen 10x MEM Salz durch Lösen von 209,2 g MOPS in ca. 800 ml Reinstwasser und Zugabe von Stammlösungen von 0,5 M EGTA und 1 M MgSO 4 in einer Endkonzentration von 20 mM EGTA, 10 mM MgSO 4 zu erreichen. PH-Wert auf 7,4 mit 10 M NaOH und dann um das Endvolumen auf 1 l einzustellen </li><li> Sterilisieren des MEM-Salzlösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 min auf einem Flüssigkeitskreislauf (die Lösung von einigen Monaten Lagerung bei Raumtemperatur vergilben kann oder nachdem sie autoklaviert wurde, aber diese Änderung in der Farbe beeinflußt nicht ihre Verwendung ). Verwenden Sie jedoch nicht die Lösung nach längerer Lagerung (mehr als 6 Monate). </li><li> Machen Sie 1x MEMFA-Lösung durch Verdünnen von 1 Teil MEM Salze, 1 Teil 37% Formaldehyd mit 8 Teilen Reinstwasser (v / v, stabil bei 4 ° C für mindestens 1-2 Wochen). </li><li> Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd in TBS (für nachfolgende Färbung beteiligt phalloidin) durch Auflösen von 4 g Paraformaldehyd Pulver in 100 ml 1x TBS-Lösung Die Lösung wird auf 60 ° C und ein paar Tropfen von 10 M NaOH Auflösung zu unterstützen. Aliquotieren in 5-10 ml Volumen und Frost in -20 ° C. wieder einfrieren nicht einmal aufgetaut. ACHTUNG: Paraformaldehyd Pulver ist ein Reizmittel und ist giftig beim Einatmen, wodurch die Wiegeschritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden. </li><li> Beschriften Sie so viele 4 ml Glasfläschchen mit Schraubverschluss vor der Probenahme. </li><li> Vorbereitung 15% Gelatine / 15% Saccharose durch Eingießen 20 ml 40% Fischgelatine (pre-Wärme in einem 50 ° C Wasserbad) in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. In 8 g Saccharose und füllen Sie das Rohr in die 50 ml Linie mit 1x TBS. </li><li> Legen Sie die Gelatine Rohr auf einem Rotationsmischer oder RollbettNacht bei Raumtemperatur zu mischen. Diese Gelatinelösung ist stabil bei 4 ° C für 1 Woche. Keine abgelaufenen Lösung verwenden und Frost-Tau. </li></ol></li><li> Vorbereiten und Fix X. laevis oder X. tropicalis Embryos zu kultiWunsch Stages. <ol><li> Kultur die befruchtete X. laevis oder X. tropicalis Embryonen in 0.1x MMR mit Gentamicin , bis die gewünschten Stufen. HINWEIS: Im Allgemeinen sammeln Embryonen zwischen den Stufen 23 und 40. Später Sammlung von Embryonen nach der Stufe 40 ist möglich, vor allem, wenn axonalen Wachstum aus dem Rückenmark zu beobachten, aber bedenken Sie, dass zusätzliche Gelatine Penetrationszeit erforderlich. Die Embryonen werden können Wildtyp, transgenen, mutant, Inhibitor behandelten, Morpholino (MO) -injected oder durch Elektroporation 23,24. </li><li> Sammeln Sie 20-50 Embryonen in jedem 4 ml-Glasfläschchen, entfernen Sie so viel Medium wie möglich und ersetzen mit MEMFA. HINWEIS: Bei anschließender Färbung phalloidin beinhaltet, verwenden Sie 4% Paraformaldehydanstelle von MEMFA da kommerziellen geliefert Formaldehyd-Lösungen enthalten in der Regel bis zu 10% Methanol als Stabilisator, der mit Phalloidin-Färbung stören. </li><li> Fix über Nacht bei 4 ° C, oder, wenn in einer Dringlichkeit, bei Raumtemperatur für 2 Stunden auf einem Rotationsmischer. Die Embryonen werden in Fixierungslösung für mindestens 1 Woche bei 4 ° C stabil sein. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie die Embryonen 3 mal 20 min mit 1x TBS mit 0,05% Triton X-100. Nach dem letzten Waschen entfernen, so viel TBS-Triton wie möglich und 3 ml 15% Gelatine / 15% Saccharose in jedem Fläschchen. </li><li> Legen Sie die Fläschchen auf einer Walze über Nacht bei Raumtemperatur Bett. Für Embryonen älter als Stufe 40, verwenden Sie mindestens 24 Stunden von Penetrationszeit. Nach dem Eindringen, gehen Sie sofort zum Abschnitt 2.2 auf den nächsten Tag. </li></ol></li></ol> 2. Montage und Kryoschneiden von Xenopus Embryonen <ol><li> Bereiten Sie Reagenzien und Materialien für Experimente. <ol><li> Nehmen Sie eine Schachtel positiv charged gleitet, idealerweise ungeöffnet. HINWEIS: Wenn geöffnet, halten Sie die Folien in einem trockenen Zustand (wie einem trockenen Box) und innerhalb von 1 Monat verwenden die statische Ladung auf den Folien eingehalten wird, um sicherzustellen. Verwenden Sie keine abgelaufenen Dias da Proben während der Immunfärbung fallen wird. </li><li> Pre-Kühlen der Kryostatkammer bis -30 ° C. Stellen Sie die Geräteparameter als -35 ° C für Mikrotom und 12 &amp; mgr; m Schnittdicke. Installieren Sie das dicke Deckglasplatte auf die Bühne und lassen Sie den Kryostaten für mindestens 30 min äquilibrieren, bevor Abschnitt beginnt. </li><li> Bereiten Sie Malerei Pinsel für Profilleisten bewegen, halten im Inneren der Kryostatkammer. </li><li> Bereiten Sie Bleistifte auf Folien für das Schreiben, legte sie bei Raumtemperatur. </li><li> Tragen Sie Handschuhe während Kryoschnittes. Verwenden Sie keine bloßen Händen. </li></ol></li><li> Montage Xenopus Embry <ol><li> Vorsichtig absaugen 5-10 Embryonen aus dem Fläschchen Glas mit einem Kunststoff- oder Glaspipette ohne die Einführung von Luftblasen verwendet wird. Übertragen Sie die Embryonen inan der Montagekammer und unter einem Stereoskop beobachten. Füllen Sie die Montagekammer mit Gelatine-Lösung, um die Steifigkeit des Abschnitts Blocks gewährleisten. </li><li> Ordnen Sie die Embryonen gemäß Abbildung 1 ein Paar von Fein Spitze einer Pinzette. Markieren Sie die Ausrichtung der Köpfe durch einen Pfeil auf dem Rand der Kammer Zeichnung eines kryogenen-kompatiblen Marker. Bei mehreren Gruppen von Embryonen, schreibe bitte die Beschreibung der einzelnen Gruppen auf den Rand der entsprechenden Kammer als auch nach unten. </li><li> Vorsichtig die Kammer horizontal in einem Schaumkasten mit Trockeneis zur Hälfte gefüllt und den Deckel schließen. Beachten Sie die Montagekammer freeze in 5-10 min. An jeder Kammer seriell (dh legen Sie die vorherige Kammer auf Trockeneis , bevor mit dem nächsten fortfahren) , da dies für jede Kammer ausreichend Zeit lassen wird, einzufrieren und die verhindern , dass das Trockeneis - Box überfüllt zu werden. HINWEIS: Gefrorene Montagekammern müssen nicht horizontal zu stehen und in der Box werden können gestapelt. </li><li>Fahren Sie mit Kryoschneiden oder, falls erforderlich, bei -80 gefrorenen Proben halten ° C für mindestens 1-2 Wochen ohne Immunogenität zu verlieren. </li></ol></li><li> Kryoschnittes von Xenopus Embryonen Mounted <ol><li> Entfernen einer gefrorenen Probenblocks aus der Kammer durch den Boden der Kammer gedrückt ein stumpfes Stock (wie ein Stift) verwendet wird. </li><li> Fügen Sie einige Tropfen Gewebe-Gefriermedium, (ein Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol enthaltenden Medium) auf die Probenhaltescheibe und montieren Sie den Probenblock mit dem vorderen Ende der Embryonen nach oben zeigt (Abbildung 2). Lassen Sie den mounted- Block für ca. 1 min innerhalb der Kryostatkammer stehen oder bis das Gewebe-Gefriermedium wird undurchsichtig. </li><li> Unmittelbar nach der Scheibe Probenhalterung installieren auf dem Mikrotom mit der unteren Seite des Blocks Probe nach oben zeigt. Schneiden Sie einen Teil des Probenblocks unter Verwendung einer Klinge, wenn der Probenblock noch relativ &quot;weiche&quot; ist die Länge eines jeden Abschnitts zu reduzieren(wenn gewünscht). Verlassen die Probenhaltescheibe am Mikrotom für mindestens 5 min um seine Temperatur zu ermöglichen, das Gleichgewicht zu erreichen. </li><li> Allmählich schneiden Sie den Probenblock nach unten, bis die Köpfe der Kaulquappen sichtbar durch die transluzente Gelatine sind. Zur Erhöhung der Geschwindigkeit Trimmen, der höher (dicker) Einstellung der Schnittdicke (zB 20-25 uM) in dieser Phase (wie zB Aktivierung der &quot;Trimm&quot; Option) , aber nicht zu dick , weil Probenblock aus der Probenhaltescheibe fallen kann . Beachten Sie die Leistung des Kryostaten, wie die Schärfe und der Winkel der Klinge in dieser Stufe die Erzeugung eines langen Streifens von nachfolgenden Abschnitten zu gewährleisten. </li><li> Sobald die Kaulquappe Köpfe sichtbar werden, passen Sie die Einstellungen des Kryostaten wieder normal (zB 10-12 uM) und reinigen sowohl die Mikrotom und Bühne einen Pinsel verwenden. machen Sie vorsichtig 2-3 Abschnitte als Versuch das Handrad Einstellung mit (nicht die motorisierte Einstellung verwenden), um sicherzustellen, dass fertige Scheiben str bilden könnenips, nicht überlappenden oder an der Klinge haften. </li><li> Weiter Trimmen, bis die Köpfe von Kaulquappen fast ausgesetzt sind (dies einige Erfahrung benötigen, aber erreichbar). Bürsten Sie alle Überbleibsel Abschnitte auf der Bühne aus, und die Sammlung von Beispiel Abschnitte beginnen wird. </li><li> Machen Sie ca. 10-15 Abschnitte und lassen sie einen langen Streifen bilden. </li><li> Flip über die dicke Deckglasplatte zur Seite und entfernen Sie vorsichtig den Streifen von der Klinge mit einer feinen Spitze Pinsel und ordnen sie auf der Bühne mit langen Achse parallel zur Klinge. </li><li> Wählen Sie eine positiv geladene Objektträger bei Raumtemperatur, beschriften Sie sie mit einem Bleistift (die bei der anschließenden Färbung Behandlungen abgewaschen werden nicht), drücken Sie es schnell, aber fest auf den Streifen mit der beschrifteten Seite nach unten und entfernen Sie die Folie aus der Kryostatkammer. Wenn es richtig gemacht, kleben die Streifen sofort in den positiv geladenen Schieber (3A). </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt 20-30 Scheiben auf jeder geschoben zu haben,e und parallel (3B) angeordnet sind . Dies ist ausreichend , um die gesamte Region des Gehirns von X. zu decken tropicalis Embryonen und die meisten Vorderhirns und des Mittelhirns Regionen X. laevis Embryonen. </li><li> Der Luft trocknen die Folien für 10 Minuten, gehen Sie sofort oder, speichern Sie die Folien in einer Dia-Box bei -80 ° C für mindestens 3-6 Monate ohne Immunogenität zu verlieren. </li></ol></li></ol> 3. Immunfärbung von Sectioned Xenopus Embryonen <ol><li> Bereiten Sie Reagenzien und Materialien für Experimente. <ol><li> Bereiten 0,05% TBS-Triton X-100 von Triton X-100 in TBS 1x Zugabe einer Endkonzentration von 0,05% zu erreichen. Diese Lösung ist stabil bei Raumtemperatur für 3-4 Tage. Keine abgelaufenen Lösung verwenden. </li><li> Bereiten 5% hitzeinaktiviertes Ziegenserum oder 5% BSA in TBST als Blocking-Puffer. Erstens wärme inaktivieren die Ziege / Lammserum von ca. 20-30 ml Serum in einem 65 ° C Wasserbad für 30-60 min setzt. Aliquots in 1,5-ml-ZentrifugenRohre und gefrier in -20 ° C. Eine erneute Inaktivierung ist erforderlich bei der Verwendung. </li><li> Verdünne das hitzeinaktiviertes Serum oder BSA in TBST eine Endkonzentration von 5% vor der Verwendung zu erzielen. </li><li> Bereiten geeigneten primären Antikörper gemäß Verdünnungen in Blocking - Puffer (beispielsweise 1: 500 Anti-SOX3 10,25 / 1: 250 Anti-Myt1 26 / anti-acetyliertes Tubulin). Verwenden Sie ca. 100 &amp; mgr; l Antikörperlösung auf jeder Folie. </li><li> Bereiten geeignete fluoreszierende Antikörper (zB Anti-Maus / Kaninchen roten Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Antikörper) in Blockierungspuffer ( in der Regel 1: 500). </li><li> (Optional) In rot fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten Phalloidin (1: 500) in sekundären Antikörper-Mix Aktinnetzwerk zu offenbaren. </li><li> (Optional) In DAPI (0,5 ug / ml Endkonzentration) in sekundären Antikörper-Mix Kernlokalisierung zu visualisieren. </li><li> Nehmen Sie die anti-fade Befestigungsmittel aus dem Gefrierschrank und tauen im Raumtemperaturwasserbad. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Entfernen Sie die gefrorenen Dias von -80 ° C und legen sie auf einem Stück Tuch Papier in einer Abzugshaube für mindestens 1 Stunde keine kondensierte Wassertröpfchen zu beseitigen, dann backen die getrockneten Folien auf einem 85-90 ° C Wärmeblock mit der Scheiben für 15 min nach oben den Haftmechanismus zu aktivieren. Schließlich erlauben die Objektträger abkühlen auf Raumtemperatur (mindestens 10 min). </li><li> Füllen Sie das Färbeküvette mit reinem Aceton und Inkubation der Objektträger in Aceton für 10 min Fischgelatine zu entfernen. Wenn mehrere Folien zu behandeln sind, ordnen sie auf einem Färbebank. Der Luft trocknen die behandelten-Folien für 15 min in einer Abzugshaube. Sie nicht das Aceton wiederverwenden. </li><li> ziehen Sie vorsichtig einen Ring um die Proben auf der Folie ein PAP Stift ohne die Proben zu berühren. Stellen Sie sicher, dass der Ring in sich geschlossene, sonst Antikörperlösung fließt aus während der Färbung. Vollständig trocknen die PAP Stift Ring. </li><li> Füllen Sie ein weiteres Färbeküvette mit 1x TBS ohne Triton X-100. InserT die ausgetrockneten Dias in den Färbeküvette und erlauben Rehydrierung für mindestens 1 Stunde. In der Zwischenzeit, bereiten durch Verdünnen entweder hitzeinaktiviertem Ziegenserum oder BSA zu 5% Endkonzentration unter Verwendung von 1x TBS mit 0,05% Triton X-100 den Blockierungspuffer. </li><li> Machen Sie ein nasses Feld um 1-2 6-Well-Platten in einem Klick-Verschluss Lebensmittel-Box platzieren und füllen die Vertiefungen zur Hälfte mit Reinstwasser. Entfernen Sie rehydrierter Dias aus dem Färbeküvette und legen Sie sie horizontal auf den 6-Well-Platten (ohne Platten Deckel). </li><li> Vorsichtig 300-600 ul Puffer innerhalb des PAP Ring blockiert. Verschließen Sie den nassen Feld durch den Deckel in Position zu verriegeln und bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde. </li><li> Verdünnen Sie die entsprechenden primären Antikörper in Blocking-Puffer. Im Allgemeinen verwenden 100-150 ul verdünnten Antikörperlösung pro Folie. Wenn mehrere Folien verarbeitet werden, skaliert das Volumen proportional nach oben. </li><li> Nach dem Blockieren vorsichtig den Blockierungspuffer von Dias durch Absaugen entfernen und schnell p hinzufügenrimary Antikörperlösung trocken-out zu verhindern, dann das nasse Feld versiegeln und über Nacht bei 4 ° C inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus den Folien durch Aspiration. mit 1x TBS gefüllt mit 0,05% Triton X-100, 3-mal, jeweils 15 min Waschen Sie die Folien durch in Färbeschalen einlegen. Inzwischen verdünnen die geeigneten Fluoreszenz sekundären Antikörper mit Blocking-Puffer (mit oder ohne DAPI oder Phalloidin). </li><li> Sorgfältig 100-150 ul sekundären Antikörper-Lösung auf die Folien hinzufügen. Legen Sie die Folien in der nassen Kasten und versiegeln Sie den Deckel. Inkubieren der Objektträger für 1-2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Folien in Färbeschalen gefüllt mit 1x TBS mit 0,05% Triton X-100, 3-mal, jeweils 15 min. Bei der letzten Wäsche, tauen die anti-fade Eindeckmediums in einem 50 ° C Wasserbad für 10 Minuten, wenn bei -20 ° C gelagert. Kühlen Sie den Eindeckmedium auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch. </li><li> In etwa 20 &amp; mgr; l (ein Tropfen) Eindeckmedium aufder Schieber und tragen Sie eine große Deckglas (mindestens 22 mm x 64 mm) über die Proben. Beobachten Sie unter Verwendung von fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop innerhalb von 6 Stunden nach der Montage. <ol><li> Wenn Bildgebung kann nicht am selben Tag erfolgen, versiegeln Dias Nagellack verwenden und legen Sie sie in den nassen Box bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Die anti-fade Eindeckmediums allmählich nach einigen Tagen oxidiert wird erhalten (und drehen bräunlich), so empfiehlt es sich, so schnell wie möglich die Bilder zu nehmen. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain.">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise.">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus.">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li><li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4.">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li><li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsoventral+patterning+in+Xenopus:+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4.">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li><li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4.">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li><li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages.">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li><li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives.">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li><li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/VegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation.">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li><li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis.">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li><li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors.">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li><li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop.">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt/beta-catenin+signalling+during+forebrain+development.">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469 (2013).</li><li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+(FISH)+on+whole+mounts+and+sections.">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li><li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+in+living+embryos.">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo.">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir für die Visualisierung primären Neurogenese in Xenopus - Embryonen eine bequeme und effiziente Methode zu demonstrieren. Dieses Verfahren erlaubt die Bewertung der verschiedenen Arten von neuronalen Zellen, einschließlich der neuronalen Stammzellen und differenzierten primären Neuronen unter Verwendung von zelltypspezifischen Markern. Das Protokoll ist in der Regel robust mit sehr hoher Reproduzierbarkeit. Für Embryonen , die in vordefinierten Schraffur Stufen sind (dh bis 28 zu Stufe), empfehlen wir manuell die Vitellinmembran vor der Fixierung zu entfernen , da diese Embryonen erlaubt vor der Fixierung vollständig zu entrollen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Embryonen in relativ frühen Stadien (vor dem Schlüpfen) Sammeln, da gebogenen Embryonen extrem schwierig in der gewünschten Orientierung innerhalb des Montagekammer anzuordnen. Wir haben keinen Verlust an Immunogenität nach MEMFA oder PFA Fixation somit zusätzliches Antigen Retrieval Schritt ist nicht notwendig für dieses Protokoll erfahren. Darüber hinaus ist dieseimmunostaining Verfahren kann in Proben werden von chromogenen / Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung durchgeführt. In einem solchen Szenario wird empfohlen, die Protease K Behandlungsschritt während der in situ-Hybridisierungsprotokoll zu überspringen. Nach chromogenen / fluoreszierendes Substrat Reaktion können Proben mit TBS gewaschen und in Fischgelatinelösung in ähnlicher Weise eingebettet MEMFA / PFA festen Proben. Probenfläschchen kann durch Umwickeln der Phiolen in Aluminiumfolie vor Licht geschützt werden, wenn Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung wird später zusammen mit Immunofluoreszenzfärbung abgebildet werden. In einigen Fällen kann Embryonen schrumpfen übermäßig nach Gelatine Penetration. Dies wird höchstwahrscheinlich entweder durch unzureichende Fixierung oder unzureichende TBS-Triton Extraktion verursacht. Stellen Sie sicher, dass Embryonen für mindestens 2-3 Stunden oder vorzugsweise über Nacht bei 4 ° C in PFA / MEMFA wurden behoben. Wenn das Problem weiterhin besteht, erhöhen Sie die Waschzeit von TBS-Triton bis 3 für 1 Stunde. Während Kryo-Sectioning, variieren unterschiedliche Eigenschaften aufweisen kann die Steifigkeit des Probenblocks als verschiedene Chargen von Fischgelatine. Dieses Problem kann teilweise durch Einstellen der Temperatur des Mikrotom kompensiert werden. Eine niedrigere Temperatur wird in einem &quot;härteren&quot; Probenblock führen jedoch unter übermäßiger niedriger Temperatur Abschnitt der Probenblock wird knackig und schwierig. Einige Feinabstimmung oder Praxis (unter Verwendung von Mock Probenblöcke ohne Embryonen) vor jeder Schnitte kann vor von Vorteil sein, zu verwenden, um auf besonders wertvollen Proben. Ein häufig auftretendes Problem während des Schneidens ist die dünnen Abschnitte manchmal auf die dicke Glasplatte zu kleben neigen, anstatt bleiben flach auf dem Stahl Bühne. Dies kann insbesondere dann sein, zu stören, da sie ständig den kontinuierlichen Schneidens unterbricht. Solche Fälle sind in der Regel durch eine von zwei Ursachen haben: die Profilkammer und (vor allem) die dicke Glasplatte nicht kalt genug sein, oder übermäßige statische Ladung auf der Maschine und die operator, vor allem bei trockenem Wetter. Ersteres kann durch Umklappen der Temperatur des Abschnitts Kammer und dem Verlassen der Glasplatte innerhalb extra Zeit (möglicherweise über Nacht) gelöst werden; und die letztere durch den Kryostaten richtig geerdet. Verbinden der Metalloberfläche des Kryostaten mit einem Metallhahn oder eine ähnliche Wasserrohrsystem aus Metall kann eine alternative Möglichkeit, die statische Aufladung zu lösen. Nach jedem Gebrauch sollte die dicke Glasplatte gut mit nicht-korrosive Reinigungsmittel (wie zB Geschirrspülmittel), von Reinstwasser, besprüht mit reinem Ethanol und eingewickelt im Tuch Papier gespült gewaschen werden, um die Oberfläche und Kanten vor Beschädigung zu schützen. Die Antikörper im Protokoll aufgelistet sind in der Regel spezifisch und wir begegnen selten unspezifische Adsorption oder hohen Hintergrundsignal. Es sollte beachtet werden, dass bei Verwendung von hitzeinaktiviertem Ziege / Lammserum als Blockierungsmittel, übermäßige Hitze-Inaktivierung (wie durch die Bildung von fluffy Fällmittel im Serum sichtbar) solltenwerden, da diese Fällmittel vermieden sind sekundäre Antikörper sehr attraktiv und kann an eine Quelle hohen Hintergrund bei. Es ist möglich und manchmal erwünscht, Doppelfärbung durchzuführen verschiedenen Populationen neuronaler Zellen gleichzeitig zu visualisieren. Solche Doppelfärbung ist möglich und führt in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse mit den folgenden Kombinationen: SOX3 / N-Wanne oder Myt1 / N-Wanne. Jedoch Doppelfärbung von SOX3 und Myt1 wird durch die Tatsache erschwert, daß die beiden Antikörper sind sowohl aus Kaninchen Ursprungs. Wir haben mehrere Antikörper direkte Markierung Kits getestet, jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse wurden beobachtet (niedriges Signal-Rausch-Pegel), möglicherweise aufgrund des Fehlens von Signalverstärkung von sekundären Antikörpern. Ein möglicher Ansatz , um dieses Problem zu umgehen , wäre zu transgenen Linien in Xenopus erhöhen, wie weiter unten erläutert. Eine der Hauptbeschränkungen dieses Protokolls besteht darin, dass, während dieses Protokoll könnte ausreichend distinguish zwei Pools von neuronalen Zellen, nämlich die SOX3-exprimierenden neuralen Stammzellpool und die Myt1 exprimierenden differenzierten Neuronen, es fehlt die Fähigkeit, unterschiedliche Subpopulationen von differenzierten Neuronen zu offenbaren. Solche Subpopulationen, die einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, primäre Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen, werden in der Regel durch ihre differentiell exprimierten Markergene 28-30 charakterisiert. Wie oben erwähnt, in dem Spalt die jüngsten Fortschritte bei der Entwicklung von Multicolor - in situ - Hybridisierung kombiniert mit Antikörper-basierte Immundetektionsverfahren in Xenopus - Embryonen füllen kann 31 diese Subpopulationen von differenzierten Neuronen für mögliche Untersuchung zu offenbaren. Alternativ, wie in Mäuse - Modell gezeigt wurde, wäre es auch , eine umfassende Reihe von zelltypspezifischen Antikörper zu erzeugen gewünscht werden , um so unterschiedliche Zellpopulationen in Xenopus unterscheiden. Es istauch erwähnenswert , dass als Ergänzung zu dieser Methode, die jüngsten Fortschritte in der optischen Bildgebung und Bildanalyse, wie Multiphotonen - Mikroskopie, 3D - Rekonstruktion und Segmentierung kann auch nach ersten Einschätzungen angewendet werden , zu erwähnen , umfassendere Beobachtungen von Xenopus - Oozyten zu erreichen sowie frühen Embryonen, insbesondere unter einer Live - Einstellung 32,33. Daher Proliferation, Differenzierung und Bewegung von neuronalen Zellen in lebenden Tieren zu verfolgen, würde es wünschenswert sein , eine oder mehrere transgene Linien zu schaffen, die von zelltypspezifischen Promotor angetrieben fluoreszierende Proteine ​​beherbergen Live Beobachtung solcher Zellpopulationen in der frühen Xenopus zu ermöglichen Embryonen. Die Einrichtung eines X. laevis Linie mit β-Tubulin - Promotor neurospezifische tauGFP und ihre Anwendungen fahren haben ein schönes Beispiel 23,34 zur Verfügung gestellt. Mit den vollständigen Promotor - Sequenzen von sowohl SOX3 und Myt1 in Wirbeltiere gekennzeichnet 35-37, ist es shOuld relativ leicht zusätzliche transgenen Linien in Xenopus zu etablieren , die sowohl umfassend die Xenopus - Community und einer allgemeineren Bereich der primären Neurogenese Forschung beitragen soll.

In Vertebraten umfaßt die Entwicklung des zentralen Nervensystems mehrere ausgeprägteres aufeinanderfolgenden Stufen. Der erste Schritt ist neurale Induktion, wenn naive ektodermalen Zellen zu einem neuronalen Schicksals angegeben sind und nicht als epidermal Schicksal. Mehrere miteinander verbundene Regulationsmechanismen sind 1,2 in dieser Phase in Xenopus und anderen Modellsystemen beteiligt. Dieser Prozess wird in erster Linie koordiniert von sezernierten Faktoren , die von der zugrunde liegenden Mesoderm erzeugt, wie chordin, Noggin und Follistatin 3-7. Nach neurale Induktion Beenden einer Untergruppe von neuralen Vorläuferzellen in den Zellzyklus und beginnen, in einem Verfahren, das als primäre Neurogenese bezeichnet unterscheiden. Nicht alle neuronalen Vorläufern unterscheiden zu diesem Zeitpunkt. Die verbleibenden neuralen Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wodurch die Stammzellpools Aufrechterhaltung für das weitere Wachstum des zentralen Nervensystems während der Entwicklung benötigt und bis ins Erwachsenenalter. Diese prneurale Vorläuferzellen oliferating zeichnen sich durch die Expression des SRY (Geschlecht bestimmende Region Y) -Box 3 (SOX3) Gen 8-11 aus. Die andere Population von Zellen, die Ausfahrt des Zellzyklus und zu einem differenzierten Schicksal begehen, werden durch die Expression des Differenzierungs Genmarker, Tubulin Beta 2B Klasse IIb identifiziert (tubb2b, N-Wanne) und Myelintranskriptionsfaktor 1 (Myt1) 14.12. Solche differenzierte neuronale Zellen schließlich zu unterschiedlichen Gruppen von Neuronen geben , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Motor, inter- und sensorisch in verschiedenen Bereichen innerhalb des Neuralrohrs 15-17 positioniert Neuronen. Während erhebliche Anstrengungen zur Aufdeckung der Regulierungsmechanismen gewidmet wurden, die die Strukturierung und das Schicksal das Bestimmen von Ereignissen in der vorderen Neuroektoderms regeln, weniger Aufmerksamkeit wurde auf die Untersuchung der neurogenen Ereignisse, die folgenden Voraussetzungen erfüllt sind dieAnfangsmusterstadium. Tatsächlich, Signaltransduktion, Transkriptions Vorschriften sowie post-translationale Modifikationen sind alle in diesem späteren Zeitpunkt beteiligt, sowohl zeitlich als auch Abstammungslinie Spezifikation während der Neurogenese 18-20 steuern. Weitere Untersuchungen in dieser Mechanismen erfordert eine zuverlässige Methode, um leicht zu visualisieren und verschiedene Populationen von neuronalen Zellen zu unterscheiden. Die oben erwähnte neurale Marker, einschließlich, SOX3, Myt1 und N-Wanne, kann ein Mittel bereitstellen , um diese verschiedenen Zellpopulationen zu identifizieren und so die notwendigen Grundlagen für die Bereitstellung 21-23 die zugrunde liegenden Mechanismen der neuronalen Differenzierung offenbaren. Obwohl differentielle Markierung von neuronalen Zellpopulationen in anderen Modellorganismen, relativ wenige Studien , die die Xenopus - System in ihrem vollsten in dieser Hinsicht ausgenutzt nachgewiesen. Dies ist vor allem auf eine geringe Zahl kompatibler Antikörper, die zuverlässig die verschiedenen neur identifizierenonal Zellpopulationen im Neuralrohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der neuronalen Differenzierung in frühen Xenopus - Embryonen über Immunfärbung, die für die Untersuchung von primären Neurogenese in Xenopus eine robuste und bequeme Ansatz bietet. Dieses Protokoll sollte eine ausreichende Führung für die Forscher in der frühen Entwicklung von Xenopus zentralen Nervensystems zwischen Stufe 26 und Stufe 45 interessierte geben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1397</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NaCl&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">746452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">793639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MOPS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">RDD003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37% formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>EMB-200-010K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Freezing Medium (OCT)</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td align="right">14020108926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gloves</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry Ice</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;85-90&#176;C Heat block</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PAP pen</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone, analytical grade</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining jar with slide racks</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">anti-acetylated tubulin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;488 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#39;)2&#160;Fragment (Alexa Fluor&#174;&#160;555 Conjugate)</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor&#174; 647 Phalloidin</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Cell Signaling</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen Querschnitte der Stufe 30 Xenopus - Embryonen auf verschiedenen Ebenen, nämlich die Vorderhirns, des Mittelhirns, Rautenhirns und des Rückenmarks, gefärbt mit verschiedenen Antikörpern (Abbildung 4). Wie bereits erwähnt, neuronale Vorläuferzellpopulation findet in der Nähe des Lumens des Neuralrohrs, während Myt1 markierte differenzierte primäre Neuronen nach außen wandern-SOX3 markiert und in der Nähe der Grenzschicht (Basallamina) des Neuralrohr lokalisieren. Anti-acetyl-Tubulin-Etiketten Axone in differenzierten Neuronen, die innerhalb des gesamten Neuralrohrs zu beobachten ist. Side-spezifischen Knock-Down oder Überexpression ist ein breit verwendetes Verfahren in der Neurobiologie zu bewerten, ob die Expression des bestimmten Gens modulieren (e) das Wachstum und die Differenzierung von neuronalen Zellen stört. In solchen Fällen entweder Morpholinos (MOs) oder DNA-Konstrukt (e) tragenden pro<html> Moter-driven - Gen (s) in einer der 23 in Zweizellstadium zwei Blastomeren injiziert. Alternativ können sie in die Hirnventrikel durch Elektroporation gefolgt injiziert werden, die in Zuschlags oder Überexpression des gewünschten Gens (s) 27 führt. In beiden Fällen werden die Effekte auf eine Seite des Embryos beschränkt, die gegenüberliegende Seite des Embryos als unbehandelte interne Kontrolle zu machen. Nach der Fixierung sectioning und Immunfärbung werden die Auswirkungen des Knock-Down / Überexpression durch Zählen und Vergleichen der Zellzahlen von verschiedenen Populationen an beiden Seiten des Embryos quantifiziert. Durch Akkumulieren diese Daten aus verschiedenen Embryonen können statistische Analyse durchgeführt werden. In unserer repräsentativen Ergebnissen wurde keine Störung in den Embryonen hergestellt. Beispiele für Gen Perturbation und deren Auswirkungen auf verschiedenen neuronalen Zellpopulationen in den Referenzen 20,23 gefunden werden. t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> Abb . 1: Embryo Anordnung und Ausrichtung im Abschnitt Form (A) Eine Karikatur Darstellung der Montageanordnung zeigt, beachten Sie die Schale mit dem Datum, Zeitpunkt und die Orientierung von Embryonen markiert wurde. (B) Ein Bild , das natürliche Aussehen der Montageanordnung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> Abb . 2: Die Orientierung und Position des Gelatineblock auf der Probenhaltescheibe (A) Eine Darstellung Cartoon Abschnitt Blockanordnung zeigt, beachten Sie, dass Embryonen in einem &quot;Heads - up&quot; Position sind und die Gelatineblock o fest fixiert istnin der Probenhaltescheibe durch das Gewebe-Gefriermedium an der Basis (siehe 2B). (B) Ein Bild , das natürliche Aussehen des Abschnitts Blockanordnung zeigt, notieren Sie die Ansammlung des Gewebes-Gefriermedium zwischen dem Gelatineblock und der Probenhaltescheibe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Kontinuierliche Schnitte (A) Modell eines Abschnitts Kammer. Die Probenhaltescheibe sollte in die Position gedreht und fixiert werden, dass der Embryo Seite nach oben zeigt. Nach ein paar (6-10) Abschnitte sind die langen Streifen kontinuierlichen Abschnitt Fliesen vorsichtig von der Klinge (blau) getrennt, um einen feinen Pinsel und drehte sich dann um 90 ° an der Halteplatte. Dann wird eine Raumtemperatur-positiv geladene Objektträger istfest auf die Profilleiste nach unten gedrückt und sofort gesammelt fertige Streifen angehoben. (B) Normalerweise kann jeder Schlitten zwei parallele Linien von Streifen aufnehmen, wie dargestellt. Denken Sie daran, detaillierte Aufzeichnung auf der Folie Etikett mit Bleistift machen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> Abbildung 4: Querschnitt der Stufe 30 X. laevis Kaulquappen und Färbung im Nervengewebe, 20X. (A) Schema der relativen Positionen angibt (Vorderhirns, des Mittelhirns, Rautenhirns und Rückenmark) von Schnittebenen auf Xenopus Kaulquappen. (B) entsprechende Querschnitte gefärbt mit Anti-SOX3 (Rot), anti-acetylierten-Tubulin (grünn) und DAPI (blau), um die relativen Positionen der neuralen Stammzellpools sowie neurofilaments im Neuralrohr zeigt. (C) entsprechende Querschnitte mit anti-Myt1 (rot) und DAPI (blau), um die relativen Positionen der differenzierten primären Neuronen im Neuralrohr zeigt. Maßstabsbalken = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus - Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K Aufrufe.  University of Manchester.  Dieser Artikel stellt eine bequeme und schnelle Methode für die verschiedenen neuronalen Zellpopulationen im zentralen Nervensystem von Xenopus - Embryonen zu visualisieren mit Immunfluoreszenzanfärbung auf Abschnitte. 

Serie: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.