We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

ويدعم نشر هذا الفيديو المقال الذي زايس.

التشكل هو عملية التي تشكل الجنين وجنبا إلى جنب مع نمو وتمايز يدفع تطور الجنين من بويضة مخصبة إلى متعددة الخلايا الناضجة. عمليات التخلق خلال تطوير حيوان يمكن تحليلها بشكل أفضل من خلال التصوير عينات حية سالمة 1-3. وذلك لأن مثل هذا التصوير الجنين كله يحافظ على جميع العناصر التي تدفع وتنظيم التنمية بما في ذلك التدرجات من جزيئات الإشارة، المصفوفة خارج الخلية، الأوعية الدموية، الغدد العرقية وكذلك الخواص الميكانيكية للأنسجة المحيطة بها. لسد المقاييس، والذي يحدث التشكل، لديها الأحداث التحت خلوية سريعة ليتم القبض على فترة زمنية دقيقة في سياق تطوير النسيج كله على مدى ساعات أو أيام. لتلبية جميع هذه المتطلبات، وقد تم تطوير تطبيق الحديث 4 من متعامد إضاءة الطائرة المجهر 5. في الأصل، كان اسمه والانتقائية طائرة الإضاءة المجهري (SPIM) 4؛ الآن يستخدم عادة مصطلح شاملة لجميع ورقة ضوء مضان المجهر (LSFM). LSFM تمكن التصوير في قرار الأوان، في حين حمل الضيائية أقل من المسح بالليزر أو الغزل قرص المجاهر مبائر 6،7. في الوقت الحاضر، وهناك بالفعل العديد من تطبيقات مبدأ رقة ضوء الإضاءة الأساسية وتم استخدامه لصورة مجموعة كبيرة ومتنوعة من النماذج والعمليات التي يتعذر الوصول إليها من قبل الباحثين 8-11. نود أولا لتسليط الضوء على العديد من المزايا الرئيسية لLSFM على نهج متحد البؤر المجهري التقليدية: للحصول على نتائج ذات مغزى من التجارب المجهرية التصوير الحي، من المهم أن الملاحظة يؤثر فقط على الحد الأدنى من العينة. ومع ذلك، فإن العديد من الكائنات الحية بما فيها الزرد معرضة جدا للتعرض للضوء الليزر، مما يجعل من الصعب على صورة لهم في المجهر متحد البؤر لقرار الأوان دون EF الضيائيةتأثيرات سلبية مثل 6،7 تطوير المتعثرة أو المتأخرة. LSFM حاليا تقنية التصوير مضان بأقل الآثار المدمرة على العينة 7. منذ ورقة رقيقة من ضوء الليزر تضيء فقط جزء من العينة التي تم تصويرها في نقطة زمنية معينة، ورقة المجهر الضوئي هو استخدام الفوتونات بكفاءة عالية. وبالتالي، فإن التعرض للضوء المنخفض يسمح للملاحظات مرور الزمن أطول من العينات صحية، على سبيل المثال 12-17. وعلاوة على ذلك، وذلك بفضل الغازية الحد الأدنى من LSFM، لم يعد يملي عدد من الصور التي حصل عليها كمية الضوء العينة يمكن أن يتسامح، ولكن بدلا من مقدار البيانات يمكن معالجتها وتخزينها. وعلى نفس المنوال من الحفاظ على العينة في الظروف الفسيولوجية القريب، LSFM يأتي مع استراتيجيات عينة تصاعد بديلة مناسبة تماما لأجنة حية. في تقنيات LSFM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من الأجنة داخل عمود رقيقة من انخفاض نسبة الاغاروز. ومونتينز في اسطوانات الأغاروس يسمح للحرية كاملة للدوران، وبالتالي فإن عينة يمكن ملاحظتها من زاوية مثالية (في LSFM يشار إلى رأي) ومن عدة جهات في وقت واحد. التصوير بطرق عرض متعددة والانصهار بطرق عرض متعددة لاحق هو مفيد بشكل خاص للالكبيرة، عينات نثر ويسمح القبض عليهم مع ارتفاع، القرار الخواص. ملخص استراتيجيات تصاعد LSFM أخرى محتملة يمكن العثور عليها في دليل المجهر التشغيل الرسمي، في الفصل المتعلق إعداد العينات كتبه المختبر من E. رينو. ومن قراءة الموصى بها، وخاصة إذا كان الهدف هو صورة عينات مختلفة من وصفها هنا. الحصول على الصور في LSFM هو مجال واسع، تقوم الكاميرا، بدلا من المسح الضوئي ليزر المجهر متحد البؤر. وهذا يؤدي إلى ارتفاع إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) للصور المكتسبة، ويمكن أن تكون سريعة جدا (عشرات ومئات من لقطة في الثانية). حساسية عالية من LSFM يتيح المزيد من التصوير من عصيدة الفلورسنت ضعيفليه، مثل عوامل النسخ التي أعرب عنها في المستويات المحلية 18 أو، في المستقبل القريب، البروتينات الذاتية الموسومة باستخدام كريسبر / Cas9. وSNR عالية المهم لنجاح تحليل الصور المصب أيضا. مطلوب سرعة عالية ليس فقط للقبض على العمليات داخل الخلايا السريعة، ولكن أيضا لصورة الجنين كله من وجهات نظر متعددة بسرعة كافية. والانصهار السلس من وجهات نظر متعددة لا يمكن أن يتحقق إلا إذا لم تتغير هذه الظاهرة لوحظت خلال الاستحواذ على هذه عدة أكوام ض القادمة من جهات مستقلة. لا تأتي مزايا LSFM عادة على حساب جودة الصورة. القرار الوحشي LSFM هو أسوأ قليلا من دقة المجهر متحد البؤر. وذلك لأن أهداف الكشف المستخدمة في LSFM لها أقل الفتحة العددية (عادة 1.0 أو أقل) مقارنة مع 1،2-1،3 الأهداف المياه أو الغمر السيليكون على الاجهزة متحد البؤر القياسية. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى الكشف عن حقل واسع في LSFM (أبسينم من الثقب)، وهناك المزيد من الضوء خارج نطاق التركيز مقارنة مع المجهر متحد البؤر. يتم تحديد كمية من خارج تركيز الضوء من قبل ورقة سماكة خفيفة. ومع ذلك، يتم تعويض هذه العيوب من قبل SNR العالي في LSFM. في الممارسة العملية، وهذا يؤدي في صور ذات جودة مماثلة مقارنة على سبيل المثال الغزل القرص مبائر اقتناء 15. ونتيجة لذلك، وهذا يتيح استخراج موثوق من الميزات مثل أغشية الخلايا أو نوى، على سبيل المثال، عن نسب خلية تتبع 15،19. يتم تحديد القرار المحوري LSFM، بالإضافة إلى هدف الكشف، من قبل ورقة سماكة خفيفة. القرار المحوري يمكن LSFM في بعض الحالات تجاوز القرار المجاهر مبائر. أولا، التحسن في قرار يأتي عندما ورقة الخفيفة هو أرق من القرار المحوري للهدف الكشف، والذي يحدث عادة لعينات كبيرة المصورة مع هدف تضخم منخفض. والطريقة الثانية، كيف يمكن للLSFM منظمة العمل ضد الجوعieve قرار المحوري أفضل، هو الانصهار بطرق عرض متعددة، يتم فيه الجمع بين قرار المعلومات عالية س ص من وجهات نظر مختلفة في كومة صورة واحدة. كومة اندمجت مما أدى لديه قرار موحد الخواص يقترب من قيم قرار في الاتجاه الجانبي 20،21. وتقوم استراتيجية لتسجيل وجهات نظر متعددة على بعضها البعض وصفها في هذه المقالة على استخدام الخرز البوليسترين الفلورسنت كعلامات الائتمانية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز حول العينة 20،21. ونتيجة لتسويق LSFM، هذه التقنية متاحة الآن لشريحة واسعة من العلماء 22. ولذلك، فإن الدافع لكتابة هذا البروتوكول هو لجعل هذه التكنولوجيا في متناول علماء البيولوجيا التطورية التي تفتقر إلى الخبرة العملية في LSFM والحصول بدأ هؤلاء العلماء استخدام هذه التكنولوجيا مع تلك العينات. يستخدم بروتوكول لدينا والتجاري ضوء المجهر ورقة، وهو ما يشكل المجهر ر بسيط من الناحية النظريةقبعة من السهل أن تعمل. ونود أن نذكر بالإضافة إلى غيرها من البروتوكولات الأخيرة لتصوير الزرد مع الاجهزة LSFM محلي الصنع، والتي قد تكون مناسبة للإجابة على الأسئلة معينة 23-25. خيار إدخال آخر لLSFM هي منصات مفتوحة 26،27، والتي تستخدم مبادئ النفاذ المفتوح لجلب ضوء المجهر ورقة إلى المجتمع الأوسع. يمكن العثور على وثائق في كل من الأجهزة والبرمجيات الجوانب في http://openspim.org وhttps://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم الزرد مكتملة العظام كنظام نموذج لدراسة العمليات التنموية مع LSFM. التشكل من العين الزرد هو مثال يؤكد العديد من الفوائد من LSFM. وقد تم بالفعل استخدام LSFM في الماضي لتحقيق تنمية العين في الميداكا 28 وفي الزرد 29،30. في مرحلة مبكرة من التنمية العين ومعقدة لتوجيه الجنين بشكل صحيح للفحص المجهري التقليدي،كما صفار ضخمة لا يسمح للجنين أن يكذب على الجانب مع مركزه تواجه الهدف. ومع ذلك، مع LSFM تصاعد في عمود الاغاروز، وعينة يمكن وضعه بتكاثر. بالإضافة إلى ذلك، خلال فترة الانتقال من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية، والعين تخضع إعادة ترتيب تخلقية الرئيسية يرافقه نمو، والتي تتطلب تسجيل ض كومة كبيرة وحقل كبير من الرأي. أيضا لمواجهة هذه التحديات LSFM متفوقة على التصوير متحد البؤر التقليدية. عملية تشكيل كوب الضوئية هي ثلاثية الأبعاد، وبالتالي فإنه من الصعب فهم وتصور فقط عن طريق التصوير من رأي واحد. وهذا يجعل التصوير بطرق عرض متعددة لقرار موحد الخواص مفيدة. بعد تشكيل كوب البصري والشبكية تصبح حساسة على نحو متزايد للتعرض ليزر. وهكذا، فإن الضيائية المنخفضة المصاحبة LSFM هي الميزة الرئيسية للتصوير على المدى الطويل. هنا نقدم بروتوكول الأمثل للتصوير من 1-3 أيام الزرد القديم الأجنة لالثانية اليرقات مع التركيز على تطوير العين. يسمح أسلوبنا تسجيل الوقت الفاصل بين الأفلام تغطي ما يصل إلى 12-14 ساعة مع القرار المكانية والزمانية عالية. الأهم من ذلك، وتبين لنا أيضا خط أنابيب لمعالجة البيانات، وهي خطوة أساسية في LSFM، وهذا الأسلوب يولد دائما مجموعات البيانات الكبيرة، وغالبا في نطاق تيرابايت.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A4018 or A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;mm inner diameter, marked black) capilllaries</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip plungers for 20&amp;nbsp;&amp;mu;l capillaries</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings for chamber windows 17&amp;times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Links&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstruction application</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFM هو الأسلوب الأمثل لتصوير العمليات التنموية عبر المقاييس. يتم تجميع العديد من التطبيقات هنا يظهر التصوير على المدى الطويل على المديين القصير وهياكل داخل الخلايا، وكذلك الخلايا والأنسجة بأكملها. وتبين هذه الأمثلة أيضا أن LSFM هو أداة مفيدة في مراحل مختلفة من تطور العين من تشكيل كوب البصري إلى تكوين الخلايا العصبية في شبكية العين. الفيلم 1 بمثابة مثال على النهج LSFM العام، لأول مرة يظهر عرض التصغير للجنين سليمة في دمج اسطوانة الأغاروس في brightfield وتبين في وقت لاحق على عرض تفصيلي لشبكية العين في القناة مضان. <img alt="فيلم 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> فيلم 1: LSFM من شبكية العين الزرد لتوضيح نهج LSFM، هذا الفيلم يظهر لأول مرة في brightfield الذي تصوير الجنين سليما داخل لgarose اسطوانة قبل ان ينتقل الى مضان. في وقت لاحق وتبين أن حقل كبير من الرأي يتيح مراقبة شبكية العين بأكملها. بعد ذلك، يظهر الفيلم منطقة صغيرة تضخيم الشبكية لتسليط الضوء على قرار التحت خلوية جيد. وقد استخدم الفجوة GFP 37 المعدلة وراثيا الجنين الزرد للتصوير: لAth5. هذا التحوير التسميات الخلايا العصبية المختلفة في شبكية العين (أساسا خلايا العقدة والسلائف مبصرة). تم القبض على جزء مضان من الفيلم كما عرض واحد مع تسجيل إضاءة جانب ومزدوجة باستخدام الهدف W 40X / 1.0 مع 5 فترات دقيقة. يظهر أقصى الإسقاط كثافة حجم سميكة 30 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> فيلم 2 يوضح كيف يمكن التقاط الأحداث داخل الخلية وسريعة جدا مع ارتفاع القرار. في هذه الحالة نمو الأنابيب الدقيقة فيبالإضافة إلى نهايتهما في الخلايا الاولية العصبية في شبكية العين. المعلومات الواردة في الفيلم تسمح لتتبع وتقدير من أنيبيب بالإضافة إلى نهاية النمو. <img alt="فيلم 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> فيلم 2: ديناميات أنيبيب في خلية واحدة هذا الفيلم يلتقط ينمو نصائح زائد من الأنابيب الدقيقة وصفت من قبل بالإضافة إلى معلومات سرية البروتين علامة EB3-GFP 38. يتم التعبير عن البروتين في خلية سلفية الشبكية واحدة. ميكروتثبول تنمو غالبا في الاتجاه من قمية لالقاعدية (الأعلى إلى الأسفل). وقد تم قياس متوسط ​​سرعة المذنبات EB3 كما 0.28 ± 0.05 ميكرون / ثانية. نقطة مضيئة في الجانب قمية من الخلايا العارضة النشاط التنوي عالية أنيبيب هي الجسيم المركزي. تم حقن نوع الجنين البرية مع HSP70: EB3-GFP DNA البلازميد. وقد اكتسب الفيلم 4 ساعات بعد الصدمة الحرارية (15 دقيقة عند 37 درجة مئوية) في حوالي 28 hrpost الاسمدةأوجه (HPF) كما عرض واحد مع تسجيل إضاءة جانب واحد باستخدام 63X / 1.0 فترات موضوعي و1 ثانية الوقت W. تم اقتصاص خلية واحدة من مجال الرؤية تغطي غالبية شبكية العين. الحد الأقصى لكثافة يرد إسقاط شريحتين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> 3 يبين الشكل، كيف هياكل داخل الخلايا يمكن اتباعها على مدى عدة ساعات. هنا، يتم التقاط الجسيم المركزي في translocating خلايا الشبكية العقدة (RGCs). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> الرقم 3: توطين الجسيم المركزي خلال شبكية العين النبات الخلايا العقدية هذا المونتاج من تجربة مرور الزمن يبين موقف الجسيم المركزي في جميع أنحاء نضوج خلايا الشبكية العقدة (RGC).في الأسلاف العصبية ومترجمة الجسيم المركزي في الطرف جدا من عملية قمي (01:00). خلال الانقسام الخلوي، وجسيم مركزي اثنين بمثابة أقطاب لمغزل الإنقسامية (02:25). وقد أدى هذا الانقسام في الخلية ابنة واحدة الذي يميز إلى RGC وخلية ابنة الثانية التي يصبح السلائف خلية مستقبلة للضوء. بعد الانقسام، وخلايا الجسم من RGC translocates إلى الجانب القاعدي من شبكية العين، في حين تراوح عملية قمي تعلق في الجانب قمي. مرة واحدة تصل إلى RGC الجانب القاعدي، يفصل عملية قمية لها والجسيم المركزي يسافر معها (06:15). يمكن أن يتبع الجسيم المركزي في حين يتراجع تدريجيا جنبا إلى جنب مع عملية قمي (06:50، 07:20، 08:10). في الإطار الأخير (08:55) من الخلايا العقدية ينمو محور عصبي من جانبها القاعدية، في حين لا يزال المترجمة الجسيم المركزي apically. وقد تحقق هذا التعبير الفسيفساء عن طريق الحقن DNA البلازميد في نوع الجنين البرية في مرحلة خلية واحدة. وتصور الخلايا التي Ath5: GFP-caax (الأخضر) CONSTruct، التي تصف RGCs والخلايا العصبية الأخرى. وصفت جسيم مركزي (السهام) من خلال Centrin-tdTomato 29 التعبير (أرجواني). الجانب قمية من شبكية العين في الجزء العلوي من الصورة والجانب القاعدي في القاع. يظهر أقصى الإسقاط كثافة حجم سميكة 30 ميكرون. تم اقتصاص الصور من فيلم تغطية شبكية العين بأكملها. يبدأ الفيلم في حوالي 34 ساعة بعد الإخصاب (HPF). تم اقتناء ض كومة كل 5 دقائق بهدف W 40X / 1.0. ويظهر مرة في HH: MM. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> في الشكل (4) يتم عرضها، وكيفية سلوك الخلية احد يمكن استخلاصها من بيانات الاستيلاء على النسيج كله مثل في الفيلم 1. يمكن تتبع إزفاء من RGC بسهولة وعملية قمي والقاعدية لوجاءت العناوين. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> الرقم 4: إزفاء من الخلايا العقدية للشبكية واحدة يحدث النبات RGC من قمي إلى الجانب القاعدي من شبكية العين بعد الانقسام الطرفي كما هو موضح في الشكل (3) هو المسمى RGC من التعبير عن Ath5: الفجوة GFP 37 التحوير. يظهر أقصى الإسقاط كثافة حجم سميكة 30 ميكرون. تم اقتصاص الصور من فيلم تغطية شبكية العين بأكملها. يبدأ الفيلم في حوالي 34 HPF. تم اقتناء ض كومة كل 5 دقائق بهدف W 40X / 1.0. ويظهر مرة في HH: MM. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> يوضح الشكل (5) قدرة LSFM بطرق عرض متعددة لالتقاط الشوري الأنسجةعمليات التخلق البيرة مع قرار الخلوي على سبيل المثال من التشكل كوب البصري خلالها الحويصلة البصرية يتحول إلى كوب البصري. جودة الصورة يمكن تحسينها بشكل كبير عن طريق التصوير بطرق عرض متعددة، عندما يتم الجمع بين الصورة النهائية من المعلومات من 5 جهات نظر مختلفة (في هذه الحالة) إلى كومة ض واحد مع قرار موحد الخواص. يوضح هذا الرقم تحسنا في جودة الصورة بعد الانصهار المتوسط ​​المرجح لومزيد من المكاسب في المقابل صورة وقرار بعد deconvolution بطرق عرض متعددة. يوضح الشكل شريحتين البصرية في اتجاهات مختلفة من خلال ورقة العمل. بالإضافة إلى ذلك، المونتاج من مجموعة البيانات deconvolved يظهر التشكل كوب البصري مع مرور الوقت. ثم يتم عرض جميع النقاط مرة في فيلم 3. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> الرقم 5: مقارنة بين جودة الصورة بين عرض واحد واثنين من أساليب multiview الانصهار. (A) شريحة واحدة البصرية للعرض البيانات واحد هو مبين من جهة النظر الجانبي و (ب) عرض الظهرية. التحف شريط وتدهور إشارة أعمق داخل عينة واضحة. أيضا لم استولت على جزء من الصورة واضحة في البيانات تنصهر (CF) في هذا الرأي خاص. (ج) نفس شريحة البصرية، والآن كما هو مبين البيانات بطرق عرض متعددة تنصهر من جهة النظر الجانبي و (D) عرض الظهرية. لاحظ أن القطع الأثرية شريط يتم منعها والبنى العميقة في العينة هي حل أفضل. (E) نفس شريحة البصرية الآن كما بطرق عرض متعددة deconvolved البيانات الواردة من جهة النظر الجانبي و(F) عرض الظهرية. لاحظ زيادة التباين والدقة بحيث أغشية الخلايا الفردية ونوى يمكن تمييزها بشكل جيد. إن القرار لا تتدهور ولا سيما أعمق داخل العينة. تم الحصول على بيانات مع إضاءة جانب ومزدوجة من 5 وجهات النظر ما يقرب من 20 درجة على حدة. مداخن ض أ بمن 100 ميكرون مع 1.5 ميكرومتر حجم الخطوة تم الحصول عليها في كل عرض في 10 دقيقة فترات لمدة 10 ساعة بهدف W 20X / 1.0. صور مدخلا للانصهار بطرق عرض متعددة وdeconvolution تم أخذ عينات بانخفاض 2 × لتسريع معالجة الصور. تم تشغيل 15 تكرارات من deconvolution بطرق عرض متعددة. (G) ويبين المونتاج والمساحة المزروعة من وجهة نظر الظهرية من البيانات deconvolved لتسليط الضوء على أحداث التخلق خلال تطوير العين في وقت مبكر من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية. طبقات اثنين من الحويصلة البصرية، والتي هي ظهائر عمودية مماثلة في البداية، تفرق في السكان خلية متميزة. الطبقة البعيدة قريبة من البشرة تصبح الظهارة العصبية في شبكية العين (RN) والطبقة القريبة القريبة من الأنبوب العصبي تصبح الظهارة الصبغية الشبكية (RP). الخلايا في استطال RN وينغلف لتشكيل الكأس البصري (1:40 حتي 05:00)؛ في الوقت نفسه الخلايا RP تتسطح. هو فعل الأديم الظاهر سطح لتشكيل عدسة (01:40)، ذوي الخوذات البيضاءفي وقت لاحق invaginates التراث الثقافي غير المادي (05:00). يبدأ الفيلم في 17 HPF. ويظهر مرة في HH: MM. وصفت كل الأغشية الخلوية من قبل β-الأكتين: التحوير رأس GFP ووصفت كل نواة من قبل HSP70: H2B-طلب تقديم العروض التحوير. يمثل مقياس شريط 30 ميكرون. FB الدماغ الأمامي، عدسة جنيه، OP اللوحاء حاسة الشم، RN الظهارة العصبية في شبكية العين، RP الشبكية الظهارة الصبغية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="فيلم 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> فيلم 3: البصري كوب التشكل أظهرت مع رأي واحد واثنين من طرق الاندماج بطرق عرض متعددة يوضح الفيلم الوقت الفاصل بين عملية كاملة من التشكل كوب البصري من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية. ويظهر شريحة ضوئية واحدة من وجهة النظر الجانبي (أعلى) وشريحة ضوئية واحدة من وجهة النظر ظهري (القاع). خلايا الحويصلة البصرية تطوير الخضوع لإعادة ترتيب معقدة لتشكيل أخيرا الكأس البصرية نصف كروية مع الظهارة العصبية في شبكية العين الداخلية والخارجية الشبكية الظهارة الصبغية. يتم تشكيل العدسة من الأديم الظاهر السطح. ومن invaginates جنبا إلى جنب مع الظهارة العصبية ويجلس في كوب البصري. وصفت كل الأغشية الخلوية من التعبير عن β-الأكتين: رأس GFP (الأخضر) التحوير ووصفت نوى مع HSP70: H2B-طلب تقديم العروض (أرجواني). يبدأ الفيلم في نحو 17 HPF. تم الحصول على بيانات مع إضاءة جانب ومزدوجة من 5 وجهات النظر ما يقرب من 20 درجة، وبصرف النظر من الألف إلى الياء أكوام من حوالي 100 ميكرون تم الحصول عليها كل 10 دقيقة بهدف W 20X / 1.0. ويظهر مرة في HH: MM. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development at JoVE.com

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Video: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biology

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

تصور التنشئة العينية بواسطة المجهر الضوئي باستخدام rx3: GFP الزرد المعدل وراثيا

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>بروتوكول الفحص المجهري للورقة الضوئية متعددة الرؤوس المكرر لأجنة أسماك الزرد

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: استراتيجيات تركيب أجنة الزرد للفحص المجهري عالي الدقة متعدد الرؤى - تقنيات التصوير وإعادة بناء الصور

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

تحليل انقباض قلب الزرد مع تفاعل الواقع الافتراضي

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

تسليط الضوء على المؤلف: عالية الدقة 4D ضوء ورقة التصوير والواقع الافتراضي في الزرد لتحليل خلية واحدة من وظائف القلب

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

تصور التنشئة العينية بواسطة المجهر الضوئي باستخدام rx3: GFP الزرد المعدل وراثيا

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد

4D ضوء ورقة التصوير من تقلص القلب الزرد