We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

La pubblicazione di questo video-articolo è supportato da Zeiss.

Morfogenesi è il processo che dà forma l&#39;embrione e, insieme con la crescita e la differenziazione guida la ontogenesi da un ovulo fecondato in un organismo multicellulare maturo. I processi morfogenetici durante lo sviluppo degli animali possono essere analizzati meglio da immagini di esemplari viventi intatti 1-3. Ciò perché tale l&#39;imaging intero embrione conserva tutti i componenti che guidano e regolano lo sviluppo compreso gradienti di molecole di segnalazione, matrice extracellulare, vascolarizzazione, innervazione così come le proprietà meccaniche del tessuto circostante. Per colmare le scale, in cui si verifica la morfogenesi, gli eventi subcellulare veloci devono essere catturato su una scala temporale minuto nel contesto dello sviluppo di tutto il tessuto sopra ore o giorni. Per soddisfare tutte queste esigenze, una moderna implementazione 4 del ortogonali illuminazione piano microscopio 5 è stato sviluppato. In origine, è stato chiamato il piano di illuminazione selettiva Microscopia (SPIM) 4; ora un Term Sheet chiaro che tutto abbraccia microscopia a fluorescenza (LSFM) viene utilizzato in genere. LSFM permette l&#39;imaging ad elevata risoluzione temporale, mentre induce meno fototossicità di scansione laser o disco rotante microscopi confocale 6,7. Al giorno d&#39;oggi, ci sono già molte implementazioni del principio di base foglio di luce di illuminazione ed è stato utilizzato per l&#39;immagine di una grande varietà di esemplari e dei processi precedentemente inaccessibili ai ricercatori 8-11. Per prima cosa vorremmo sottolineare alcuni vantaggi chiave di LSFM rispetto agli approcci confocale microscopia convenzionale: Per acquisire risultati significativi Dall&#39;imaging vivo esperimenti microscopiche, è importante che l&#39;osservazione influisce solo minimamente il campione. Tuttavia, molti organismi, tra cui zebrafish sono molto sensibili alla esposizione alla luce laser, il che rende difficile per l&#39;immagine di loro in un microscopio confocale con elevata risoluzione temporale senza fototossicità efdifetti come in fase di stallo o ritardato 6,7 sviluppo. LSFM è attualmente la tecnica di imaging di fluorescenza con minimi effetti dirompenti sul campione 7. Poiché il sottile foglio leggero laser illumina solo la parte del campione che viene esposta in un particolare punto di tempo, il foglio microscopio ottico è usando fotoni molto efficiente. Di conseguenza, la bassa esposizione alla luce permette più a lungo le osservazioni time-lapse di esemplari sani, ad esempio 12-17. Inoltre, grazie alla minima invasività della LSFM, il numero di immagini acquisite non è più dettata dalla quantità di luce che il campione può tollerare, ma piuttosto da quanti dati possono essere elaborati e memorizzati. Sulla stessa linea di mantenere il campione in condizioni fisiologiche vicino, LSFM viene fornito con il montaggio del campione strategie alternative ben si adatta per gli embrioni dal vivo. Nelle tecniche LSFM, gli embrioni sono tipicamente inseriti all&#39;interno di una colonna sottile di bassa agarosio percentuale. il mounting in cilindri agarosio permette la completa libertà di rotazione, in modo che il campione può essere osservato dalla angolo perfetto (in LSFM denominato vista) e da diverse viste simultaneamente. Imaging MultiView e la successiva fusione MultiView è utile in particolare per i grandi campioni di scattering e permette loro cattura ad alta risoluzione isotropo. Una sintesi di altre possibili strategie di montaggio LSFM può essere trovato nel manuale operativo del microscopio ufficiale, nel capitolo dedicato alla preparazione del campione scritto dal laboratorio di E. Reynaud. È una lettura consigliata, soprattutto se l&#39;obiettivo è quello di diversi campioni dell&#39;immagine quanto descritto qui. L&#39;acquisizione delle immagini in LSFM è grande campo, a base di fotocamera, al contrario di scansione laser microscopio confocale. Ciò si traduce in un rapporto segnale rumore (SNR) per le immagini acquisite superiore e può essere estremamente veloce (decine a centinaia di fotogrammi al secondo). L&#39;elevata sensibilità del LSFM permette inoltre di imaging di samp debolmente fluorescenteles, come fattori di trascrizione espressi a livelli endogeni 18 o, in un prossimo futuro, le proteine ​​endogene marcati usando CRISPR / Cas9. L&#39;elevato SNR è anche importante per il successo analisi dell&#39;immagine valle. L&#39;alta velocità è necessario non solo per catturare processi intracellulari rapidi, ma anche per l&#39;immagine dell&#39;intero embrione da viste multiple abbastanza veloce. Una fusione armoniosa delle visualizzazioni multiple può essere raggiunto solo se il fenomeno osservato non cambia durante l&#39;acquisizione di queste diverse pile z provenienti da viste separate. I vantaggi di LSFM tipicamente non va a scapito della qualità dell&#39;immagine. La risoluzione laterale di LSFM è leggermente peggiore rispetto alla risoluzione di un microscopio confocale. Questo perché gli obiettivi di rilevazione utilizzati in LSFM hanno una minore apertura numerica (di solito 1,0 o inferiore) rispetto a 1.2-1.3 di acqua o immersione silicio obiettivi su configurazioni confocale standard. Inoltre, grazie al rilevamento ampio campo in LSFM (Absence di un foro), c&#39;è più luce fuori fuoco rispetto ad un microscopio confocale. La quantità di out-of-focus luce è determinato dallo spessore foglio leggero. Tuttavia, questi svantaggi sono compensati dal SNR superiore in LSFM. In pratica, questo si traduce in immagini di qualità simili rispetto a, per esempio filatura disco acquisizione confocale 15. Di conseguenza, ciò consente l&#39;estrazione affidabile di caratteristiche come membrane cellulari o nuclei, per esempio, per cell lineage tracing 15,19. La risoluzione assiale LSFM è determinata, oltre all&#39;obiettivo rilevamento, dallo spessore foglio leggero. La risoluzione assiale LSFM può in alcuni casi superare la risoluzione dei microscopi confocale. In primo luogo, il miglioramento della risoluzione viene quando il foglio leggero è più sottile rispetto alla risoluzione assiale dell&#39;obiettivo rilevamento, che tipicamente si verifica per grandi campioni viste con obiettivo a basso ingrandimento. Il secondo modo, come il LSFM può achIEVE migliore risoluzione assiale, è la fusione MultiView, in cui le informazioni ad alta risoluzione XY Da diversi punti di vista si combina in un&#39;unica serie di immagini. Lo stack fusa risultante ha una risoluzione isotropa avvicina i valori di risoluzione nella direzione laterale 20,21. La strategia per la registrazione delle molteplici vista sulla vicenda descritta in questo articolo si basa sull&#39;utilizzo di perle di polistirene fluorescenti come marcatori fiduciari incorporati nel agarosio intorno al campione 20,21. Come risultato della commercializzazione LSFM, questa tecnica è ora disponibile per una vasta comunità di scienziati 22. Pertanto, la motivazione per la scrittura di questo protocollo è quello di rendere questa tecnologia accessibile a biologi dello sviluppo che mancano di esperienza pratica in LSFM e per ottenere questi scienziati iniziato a utilizzare questa tecnologia con i loro campioni. Il nostro protocollo utilizza il microscopio foglio di luce commerciale, che costituisce un concettualmente semplice microscopio tcappello è facile da usare. Vorremmo inoltre segnaliamo altri protocolli più recenti per l&#39;imaging zebrafish con configurazioni LSFM casa costruita, che potrebbero essere adatti per rispondere a particolari domande 23-25. Un&#39;altra opzione ingresso al LSFM sono le piattaforme aperte 26,27, che utilizzano i principi di accesso aperto per portare la microscopia foglio di luce per una comunità più ampia. La documentazione sia l&#39;hardware e gli aspetti del software può essere trovato alla http://openspim.org e https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. In questo protocollo, si usa il pesce zebra teleosteo come sistema modello per studiare i processi di sviluppo con LSFM. Morfogenesi dell&#39;occhio zebrafish è un esempio che sottolinea molti dei vantaggi di LSFM. LSFM è già stato utilizzato in passato per indagare lo sviluppo degli occhi in Medaka 28 e in zebrafish 29,30. Alla fase iniziale di sviluppo dell&#39;occhio è complicato per orientare l&#39;embrione in modo corretto per la microscopia convenzionale,come il tuorlo ingombranti non consente l&#39;embrione a giacere sul lato con il suo occhio rivolto verso l&#39;obiettivo. Tuttavia, con il montaggio LSFM in una colonna di agarosio, il campione può essere riproducibile posizionato. Inoltre, durante la transizione da vescicola ottica allo stadio tazza ottica, l&#39;occhio eseguono importanti riarrangiamenti morfogenetiche accompagnati dalla crescita, che richiede catturando una grande z stack e un grande campo di vista. Anche per queste sfide LSFM è superiore a confocale convenzionale. Il processo di formazione tazza ottica è tridimensionale, quindi è difficile da comprendere e visualizzare esclusivamente da immagini da una visualizzazione. Questo rende l&#39;imaging MultiView con risoluzione isotropo vantaggioso. Dopo la formazione tazza ottica, la retina diventa sempre più sensibile all&#39;esposizione laser. Così, la fototossicità bassa associata a LSFM è un grande vantaggio per l&#39;imaging a lungo termine. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l&#39;imaging di uno a tre giorni embrioni di zebrafish unlarve ND con focus sullo sviluppo dell&#39;occhio. Il nostro metodo permette la registrazione di filmati time-lapse che copre fino a 12-14 ore con alta risoluzione spaziale e temporale. È importante sottolineare che, mostriamo anche una pipeline per l&#39;elaborazione dei dati, che è un passo essenziale per LSFM, come questa tecnica genera invariabilmente grandi insiemi di dati, spesso nella gamma terabyte.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A4018 or A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;mm inner diameter, marked black) capilllaries</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip plungers for 20&amp;nbsp;&amp;mu;l capillaries</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings for chamber windows 17&amp;times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Links&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstruction application</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFM è un metodo ideale per l&#39;imaging processi di sviluppo attraverso le scale. Diverse applicazioni sono compilate qui che mostra l&#39;imaging sia a breve che a lungo termine delle strutture intracellulari, così come le cellule ei tessuti interi. Questi esempi dimostrano anche che LSFM è uno strumento utile a vari stadi di sviluppo dell&#39;occhio dalla formazione tazza ottico al neurogenesi nella retina. Film 1 serve come illustrazione dell&#39;approccio generale LSFM, prima che mostra una vista ingrandita di un embrione intatto nel incorporamento cilindro agarosio in campo chiaro e successivamente mostra una vista dettagliata della retina nel canale di fluorescenza. <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. LSFM della retina zebrafish Per illustrare l&#39;approccio LSFM, questo film mostra prima nel campo chiaro che l&#39;embrione è ripreso intatto all&#39;interno di ungarose cilindro prima di passare a fluorescenza. Successivamente si è dimostrato che il grande campo di vista permette l&#39;osservazione di tutta la retina. Successivamente, il film mostra una piccola regione ingrandita della retina per evidenziare la buona risoluzione subcellulare. Un Ath5: gap-GFP 37 transgenico zebrafish è stato utilizzato per l&#39;imaging. Questo transgene etichette diverse neuroni della retina (principalmente cellule gangliari e precursori dei fotorecettori). La parte di fluorescenza del film è stato catturato come una singola registrazione con illuminazione a doppia faccia con l&#39;obiettivo 40X / 1.0 W con 5 min intervalli di vista. La proiezione massima intensità di un grosso volume di 30 micron viene mostrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Movie 2 dimostra, come gli eventi intracellulari molto veloci possono essere catturati con alta risoluzione; in questo caso la crescita dei microtubuli ala loro più finisce nelle cellule progenitrici neuronali della retina. Le informazioni contenute nel film consente per il monitoraggio e la quantificazione dei microtubuli, più fine la crescita. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Movie 2:. Dinamica dei microtubuli in una singola cella Questo film consente di catturare in crescita più punte di microtubuli etichettati dal più la punta proteina marcatore EB3-GFP 38. La proteina è espressa in una singola cellula progenitrice retinica. I microtubuli sono in crescita prevalentemente nella direzione da apicale al basale (dall&#39;alto in basso). La velocità media delle comete Eb3 stata misurata come 0.28 ± 0.05 micron / sec. Il punto luminoso nella parte apicale della cellula espositiva attività nucleazione dei microtubuli alto è il centrosoma. Il tipo di embrione selvaggio è stato iniettato con HSP70: EB3-GFP plasmide DNA. Il film è stato acquisito 4 ore dopo shock termico (15 minuti a 37 ° C) a circa 28 hrpost fertilizzione (HPF) come una singola registrazione con illuminazione singola faccia vista utilizzando gli intervalli di tempo oggettivo e 1 sec 63X / 1.0 W. La singola cellula è stata ritagliata da un campo visivo che copre la maggior parte della retina. L&#39;intensità massima è indicata la proiezione di due fette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a> La figura 3 mostra, come le strutture intracellulari possono essere seguite per molte ore. Qui, il centrosoma entro translocating cellule gangliari della retina (RGCs) viene catturato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Figura 3:. Localizzazione Centrosome durante la traslocazione cellule gangliari retiniche Questo montaggio di un esperimento time-lapse mostra la posizione del centrosoma durante la maturazione della retina cellule gangliari (RGC).Nei progenitori neuronali centrosoma è localizzata nella punta estrema del processo apicale (01:00). Durante la divisione cellulare, i due centrosomi servono come pali per il fuso mitotico (2,25). Questa divisione si traduce in una cellula figlia che si differenzia in un RGC e una seconda cellula figlia che diventa un precursore dei fotorecettori. Dopo divisione, il corpo cellulare del RGC trasloca nel lato basale della retina, mentre il processo apicale rimane attaccato al lato apicale. Una volta che la RGC raggiunge il lato basale, il suo processo apicale stacca e il centrosoma viaggia con esso (6,15). Il centrosoma può essere seguita mentre gradualmente ritraendo insieme con il processo apicale (6:50, 7:20, 8:10). Nel l&#39;ultimo fotogramma (08:55) il cellule gangliari sta crescendo un assone dal suo lato basale, mentre il centrosoma è ancora localizzato apicale. L&#39;espressione del mosaico è stata realizzata per iniezione plasmide DNA in tipo selvaggio embrione in uno stadio delle cellule. Le cellule vengono visualizzati dal Ath5: GFP-CAAX (verde) construct, che etichette RGCs e altri neuroni. I centrosomi (frecce) sono etichettati da Centrin-tdTomato 29 espressione (magenta). Il lato apicale della retina è nella parte superiore dell&#39;immagine e il lato basale in basso. Viene mostrata la proiezione massima intensità di un grosso volume di 30 micron. Le immagini sono state ritagliate da un film che copre l&#39;intera retina. Il film inizia a circa 34 ore dopo la fecondazione (HPF). A z pila è stata acquisita ogni 5 minuti con l&#39;obiettivo 40X / 1.0 W. Il tempo è mostrato in hh: mm. Barra della scala rappresenta 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In figura 4 è mostrato, come singola comportamento cellulare può essere estratto dai dati catturando tutto il tessuto come nel film 1. Traslocazione di RGC può essere facilmente tracciati e il suo processo apicale e basalees seguito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Figura 4:. Translocation di una singola cellula gangliare retinica La traslocazione RGC da apicale a lato basale della retina avviene dopo la mitosi terminale come descritto in figura 3 L&#39;RGC è etichettato con espressione del Ath5:. Gap-GFP 37 transgene. Viene mostrata la proiezione massima intensità di un grosso volume di 30 micron. Le immagini sono state ritagliate da un film che copre l&#39;intera retina. Il film inizia a circa 34 HPF. A z pila è stata acquisita ogni 5 minuti con l&#39;obiettivo 40X / 1.0 W. Il tempo è mostrato in hh: mm. Barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5 dimostra la capacità di MultiView LSFM per catturare sc tessutiprocessi morfogenetici ale con risoluzione cellulare sull&#39;esempio di ottica morfogenesi tazza, durante il quale ottica vescicole si trasforma in una coppa ottica. La qualità dell&#39;immagine può essere notevolmente migliorata mediante imaging multiview, quando l&#39;immagine finale è combinata dalle informazioni su 5 viste diverse (in questo caso) in una z stack con risoluzione isotropica. Questa figura illustra il miglioramento della qualità di immagine dopo la fusione medio ponderato e l&#39;ulteriore aumento di contrasto e risoluzione dopo MultiView deconvoluzione. La figura mostra due fette ottici in diversi orientamenti attraverso il set di dati. Inoltre, un montaggio dal set di dati deconvolved mostra la morfogenesi coppa ottica nel corso del tempo. Tutti i punti di tempo sono poi mostrati in Movie 3. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Figura 5: Confronto tra qualità dell&#39;immagine tra visualizzazione singola e due metodi di multiview fusione. (A) Una fetta ottica di visualizzare i dati riportati da singoli vista laterale e (B) vista dorsale. artefatti banda e il degrado del segnale più all&#39;interno del campione sono evidenti. Anche una parte dell&#39;immagine visibile nei dati fuse (CF) non è stato catturato in questa vista particolare. (C) La stessa fetta ottica, ora come MultiView fuso i dati riportati dalla vista laterale e (D) vista dorsale. Si noti che gli artefatti banda sono soppressi e strutture profonde nel campione sono meglio risolti. (E) La stessa fetta ottica ora come MultiView deconvolved dati mostrati alla vista laterale e (F) vista dorsale. Si noti la maggiore contrasto e la risoluzione in modo che le singole membrane cellulari e nuclei possono essere ben distinti. La risoluzione non si deteriora notevolmente più profonda all&#39;interno del campione. Il set di dati è stata acquisita con illuminazione a doppia faccia da 5 viste di circa 20 gradi. Lo Z pile di abil 100 micron con 1,5 micron dimensione del passo sono stati acquisiti ad ogni vista in intervalli di 10 min per 10 ore, con l&#39;obiettivo 20X / 1.0 W. immagini di ingresso per la fusione MultiView e deconvoluzione sono stati giù campionati 2 × per accelerare l&#39;elaborazione delle immagini. 15 iterazioni del deconvoluzione multivista sono stati eseguiti. (G) Il montaggio mostra una parte ritagliata del vista dorsale dai dati deconvolved per evidenziare gli eventi morfogenetici durante lo sviluppo dell&#39;occhio presto dalla vescicola ottica alla fase coppa ottica. I due strati della vescicola ottica, che sono inizialmente simili epiteli colonnare, si differenziano in distinte popolazioni cellulari. Lo strato distale vicino l&#39;epidermide diventa neuroepitelio della retina (RN) e lo strato prossimale vicino al tubo neurale diventa l&#39;epitelio pigmentato retinico (RP). Le cellule del allungato RN e invaginate per formare la coppa ottica (1:40-05:00); Allo stesso tempo le cellule RP appiattiscono. L&#39;ectoderma superficiale è indotto a formare una lente (01:40), whinvaginates ich più tardi (05:00). Il film inizia alle 17 HPF. Il tempo è mostrato in hh: mm. Tutte le membrane cellulari sono etichettati dal β-actina: ras-GFP transgene e tutti i nuclei sono etichettati dal HSP70: H2B-RFP transgene. barra della scala rappresenta 30 micron. FB prosencefalo, lente LE, OP placode olfattiva, RN neuroepitelio retina, RP dell&#39;epitelio pigmentato retinico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Optic tazza morfogenesi mostrato con un&#39;unica vista e due metodi di fusione MultiView Il filmato time-lapse illustra il processo completo di ottica morfogenesi tazza dalla vescicola ottica alla fase coppa ottica.. Essa mostra una sola fetta ottica dalla vista laterale (in alto) e una sola fetta ottica dalla vista dorsale (in basso). Le cellule del sviluppo vescicola ottica subiscono riarrangiamenti complessi per formare finalmente la coppa ottica emisferica con neuroepitelio retina interna ed esterna dell&#39;epitelio pigmentato retinico. Una lente è formata da ectoderma superficie. Si invagina insieme al neuroepitelio e si siede in tazza ottica. Tutte le membrane cellulari sono etichettati dalla espressione della β-actina: ras-GFP (green) transgene ed i nuclei sono etichettati con HSP70: H2B-RFP (magenta). Il film inizia a circa 17 HPF. Il set di dati è stata acquisita con illuminazione a doppia faccia da 5 vedute circa 20 gradi l&#39;uno dall&#39;altro e az pile di circa 100 micron sono stati acquisiti ogni 10 minuti con l&#39;obiettivo 20X / 1.0 W. Il tempo è mostrato in hh: mm. Barra della scala rappresenta 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Video: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di microscopia a foglio luminoso multiview perfezionato per embrioni di zebrafish

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Strategie per il montaggio di embrioni di zebrafish per la microscopia a foglio luminoso multivista ad alta risoluzione - Tecniche per l'ima

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Analisi della contrazione cardiaca del pesce zebra con l'interazione della realtà virtuale

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Autore in primo piano: Imaging 4D Light-Sheet ad alta risoluzione e realtà virtuale in zebrafish per l'analisi di singole cellule della funzione cardiaca

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all'Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra

Imaging a foglio luminoso 4D della contrazione cardiaca del pesce zebra