We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

פרסום מאמר וידאו זה נתמך על ידי Zeiss.

המורפוגנזה הוא תהליך שמעצב העובר ויחד עם הצמיחה וההתבדלות שמניע את ontogeny מביצית מופרית לאורגניזם רב-תאיים בוגרת. התהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולכים במהלך ההתפתחות של בעלי חיים יכולים להיות מנותחים על ידי מיטב הדמיה של שלמי חי דגימות 1-3. הסיבה לכך היא כי הדמיה העובר כולו כזה משמרת את כל המרכיבים שמניעים ולהסדיר פיתוח כולל הדרגתי של מולקולות איתות, מטריקס, כלי דם, עצבוב וכן תכונות מכאניות של הרקמות המקיפות אותם. כדי לגשר על המאזניים, שבה morphogenesis מתרחשת, אירועי subcellular מהר צריכים להיות בשבי בסולם זמן דק בהקשר של פיתוח של הרקמה כולה על שעות או ימים. כדי למלא את כל הדרישות הללו, יישום מודרני 4 של המיקרוסקופ תאורת מטוס המאונך 5 פותחתה. במקור, זה היה שמו מיקרוסקופיה תאורת מטוס סלקטיבי (SPIM) 4; עכשיו גיליון אור חובק-כל טווח מיקרוסקופ פלואורסצנטי (LSFM) משמש בדרך כלל. LSFM מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן, תוך גרימת פחות phototoxicity מאשר סריקת לייזר או דיסק מסתובב מיקרוסקופים confocal 6,7. כיום, יש כבר יישומים רבים של עקרון תאורה וכו &#39;אור בסיסי זה כבר נעשה שימוש לתדמית מגוון גדול של דגימות ותהליכים נגישים קודם לכן לחוקרים 8-11. ברצוננו הראשון כדי להדגיש כמה יתרונות מרכזיים של LSFM פני גישות מיקרוסקופיה confocal קונבנציונליות: כדי לרכוש תוצאות משמעותיות מניסויים מיקרוסקופים הדמיה לחיות, חשוב כי ההשגחה בלבד מינימאלית משפיעה על הדגימה. עם זאת, אורגניזמים רבים, כולל דג הזברה הם רגישים מאוד כדי חשיפה לאור לייזר, מה שהופך אותו מאתגר לתדמית אותם מיקרוסקופ confocal עם רזולוציה גבוהה בזמן ללא phototoxicity EFfects כמו 6,7 פיתוח נתקע או מתעכב. LSFM היא כיום טכניקת דימות פלואורסצנטי עם השפעות הרסניות לפחות על מדגם 7. מאז גיליון אור הליזר הדק מאיר רק את החלק של הדגימה כי הוא צלם בנקודת זמן מסוימת, המיקרוסקופ גיליון האור באמצעות פוטונים ביעילות רבה. כתוצאה מכך, החשיפה באור הנמוכה מאפשרת תצפיות זמן לשגות יותר של דגימות בריאות, למשל 12-17. יתר על כן, הודות הפולשנות המינימאלי של LSFM, מספר תמונות שנרכשו כבר לא מוכתבים על ידי כמה אור המדגם יכול לסבול, אלא על ידי כמות נתונים יכול להיות מעובד ומאוחסן. בנוסח הזהה של שמירה על הדגימה בתנאים פיסיולוגיים קרובים, LSFM מגיע עם אסטרטגיות הרכבת מדגם אלטרנטיבה גם מתאימות עובר לחיות. בטכניקות LSFM, את העוברים בדרך כלל מוטבעים בתוך טור דק של agarose אחוז הנמוך. מאונטיןg לגלילי agarose מאפשר חופש המוחלט של סיבוב, כך המדגם ניתן לצפות מן הזווית המושלמת (ב LSFM המכונה נוף) ומכמה נופים זמניים. ההדמיה המרובה התצוגות והאיחוי מרובה תצוגות הבאות מועילה במיוחד עבור גדולות, דגימות פיזור ומאפשרת לכידתם עם גבוהה, רזולוציה איזוטרופיים. סיכום של אסטרטגיות הרכבת LSFM אפשריות אחרות ניתן למצוא במדריך הפעלת מיקרוסקופ הרשמי, בפרק על הכנת מדגם שנכתבה על ידי המעבדה של E. ריינו. זוהי קריאה מומלצת, במיוחד אם המטרה היא מדגמים שונים תמונה ממתוארת כאן. רכישת תמונת LSFM היא תחום רחב, מצלמה מבוססת, בניגוד מיקרוסקופ confocal סריקת ליזר. התוצאה היא אות גבוהה יחס רעש (SNR) עבור תמונות רכשו יכולה להיות מהיר מאוד (עשרות עד מאה פריימים לשניים). הרגישות הגבוהה של LSFM נוספת מאפשרת הדמיה של samp ניאון בחולשהles, כמו גורמי שעתוק לידי ביטוי ברמות אנדוגני 18 או, בעתיד הקרוב, חלבונים אנדוגניים מתויג באמצעות CRISPR / Cas9. ה- SNR גבוה כמו כן, חשוב לניתוח תמונה במורד מוצלח. המהירות הגבוהה נדרשת לא רק כדי ללכוד תהליכים מהירים תאיים, אלא גם כדי שזה יקלוט את העובר כולו מתצוגות מספר מספיק מהר. פיוז&#39;ן חלק של התצוגות המרובות יושג רק, אם התופעה שנצפתה לא משנה במהלך רכישת ערימות z כמה אלה קרובים מתצוגות נפרדות. היתרונות של LSFM לא באים בדרך כלל על חשבון איכות התמונה. ההחלטה לרוחב של LSFM היא קצת יותר גרועה מאשר הרזולוציה של מיקרוסקופ confocal. הסיבה לכך היא כי מטרות האיתור המשמשות LSFM יש צמצם מספרי נמוך (בדרך כלל 1.0 או פחות) לעומת 1.2-1.3 יעדי מים או טבילת סיליקון על setups confocal הסטנדרטי. בנוסף, בשל גילוי השדה הרחב LSFM (absence של חריר), יש יותר out-of-פוקוס אור לעומת מיקרוסקופ confocal. הכמות מחוץ מוקד האור נקבעה על ידי עובי גיליון האור. אף על פי כן, חסרונות אלה מפוצים על ידי יחס אות לרעש גבוה ב LSFM. בפועל, הדבר גורם תמונות באיכות דומות בהשוואה למשל ספינינג רכישת confocal דיסק 15. כתוצאה מכך, זה מאפשר מיצוי אמין של תכונות כמו קרום תא או גרעינים, למשל, עבור שושלת תא התחקות 15,19. ההחלטה צירית של LSFM נקבע, בנוסף המטרה זיהוי, על ידי עובי גיליון אור. ההחלטה צירית של LSFM יכול במקרים מסוימים לעלות את הרזולוציה של מיקרוסקופים confocal. ראשית, השיפור ברזולוציה מגיע כשהידיעה האור היא רזה יותר הרזולוציה הצירית של מטרת האיתור, אשר מתרחשת בדרך כלל עבור דגימות גדולות צלמו עם מטרה בהגדלה נמוכה. הדרך השנייה, כיצד LSFM יכול ACHieve טוב יותר ברזולוציה צירית, הוא ההיתוך המרובה התצוגות, בו המידע ברזולוצית XY גבוהה מתצוגות שונות בשילוב לתוך ערימת תמונה אחת. מחסנית התמזגה וכתוצאה מכך יש ברזולוציית איזוטרופיים מתקרב ערכי רזולוציה בכיוון לרוחב 20,21. תוכנית המשחק של רישום תצוגות מרובות על זה לזה המתואר במאמר זה מבוססת על שימוש חרוזי פוליסטירן פלורסנט כסמנים האמונים מוטבע agarose סביב המדגם 20,21. כתוצאה מסחור LSFM, טכניקה זו היא כעת לרשות קהילה רחבה של מדענים 22. לכן, המוטיבציה לכתיבת פרוטוקול זה היא להפוך את הטכנולוגיה הזו נגישה ביולוגים התפתחותיים חסר ניסיון מעשי LSFM וכדי לקבל מדענים אלה התחילו להשתמש בטכנולוגיה זו עם דגימות שלהם. הפרוטוקול שלנו משתמש מיקרוסקופ גיליון האור המסחרי, המהווה t במיקרוסקופ פשוט מושגיתכובע קל לתפעול. אנחנו גם רוצים להזכיר פרוטוקולים אחרונים אחרים הדמית דג זברה עם setups LSFM הבית בנוי, אשר עשוי להיות מתאים כדי לענות על שאלות בפרט 23-25. אפשרות נוספת לכניסת LSFM הן הפלטפורמות הפתוחות 26,27, אשר להשתמש בעקרונות גישה הפתוחים להביא מיקרוסקופיה גיליון אור קהילה גדולה יותר. התיעוד של הן את החומרה ואת ההיבטים התוכנה ניתן למצוא בכתובת http://openspim.org ו https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים דג הזברה החוליות כמערכת מודל ללמוד תהליכים התפתחותיים עם LSFM. המורפוגנזה של עין דג הזברה היא דוגמא כי מדגישה את היתרונות רבים של LSFM. LSFM כבר נעשה שימוש בעבר כדי לחקור התפתחות העין medaka 28 ו דג הזברה 29,30. בשלב המוקדם של התפתחות עין זה מסובך להתמצא העובר כראוי עבור מיקרוסקופיה קונבנציונלי,כמו החלמון המגושם אינו מאפשר העובר לשכב על הצד עם העין שלה מול המטרה. עם זאת, עם LSFM הרכבה לתוך עמודת agarose, המדגם ניתן למקם reproducibly. בנוסף, במהלך המעבר מן השלפוחית ​​אופטית לשלב כוס האופטית, העין עוברת rearrangements הגדולה המוךפו&quot;גנטי שהולכת מלווה צמיחה, מחייב לכיד ערימת z גדולה בשדה גדול של נוף. כמו כן, עד שהמשימה הזאת LSFM עדיפה על הדמית confocal קונבנציונלית. תהליך היווצרות כוס ראיה הוא תלת ממדי, ולכן קשה להבין ולדמיין אך ורק על ידי הדמיה מעין אחד. זה עושה הדמיה מרובה תצוגות עם רזולוציה איזוטרופיים מועילה. לאחר היווצרות כוס אופטית, הרשתית הופכת רגישה יותר ויותר חשיפת ליזר. לפיכך, phototoxicity נמוך הקשורים LSFM הוא יתרון גדול עבור הדמיה לטווח ארוך. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדמיה של אחד עד שלושה ימים דג זברה ישנה עוברזחלי nd עם דגש על התפתחות העין. השיטה שלנו מאפשרת הקלטה של ​​זמן לשגות סרטים מכסים עד 12-14 שעות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. חשוב לציין, אנו גם מציגים צינור עיבוד נתונים, המהווה שלב הכרחי בדרך LSFM, כמו הטכניקה הזו תמיד מייצרת מערכי נתונים גדולים, לעתים קרובות בטווח הטרה.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A4018 or A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;mm inner diameter, marked black) capilllaries</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip plungers for 20&amp;nbsp;&amp;mu;l capillaries</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings for chamber windows 17&amp;times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Links&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstruction application</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFM היא שיטה אידיאלית עבור הדמית תהליכים התפתחותיים ברחבי כף. מספר יישומים מופקים כאן מראים הדמיה קצרה וארוכה הן של מבנים תאיים, כמו גם תאים ורקמות כולו. גם דוגמאות אלו מראות כי LSFM הוא כלי שימושי בשלבים שונים של פיתוח עין מפני היווצרות כוס ראייה נוירוגנזה ברשתית. סרט 1 משמש המחשה של גישת LSFM הכללית, ראשון מראה נוף מוקטן של עובר שלמים מפני הטבעת גליל agarose ב brightfield ובהמשך מראה תצוגה מפורטת של הרשתית בערוץ פלואורסצנטי. <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> סרט 1:. LSFM של רשתית דג הזברה כדי להדגים את גישת LSFM, הסרט הזה מציג לראשונה brightfield כי העובר הוא צלם ללא פגע בתוך אgarose גליל לפני מעבר קרינה. מאוחר יותר הוא הראה כי השדה הרחב של תצוגה מאפשר תצפית של הרשתית כולה. לאחר מכן, הסרט מראה אזור קטן מוגדל של הרשתית כדי להדגיש את רזולוצית subcellular הטובה. Ath5: פער-GFP 37 עובר דג זברה מהונדס שמש הדמיה. transgene זו מסמנת נוירונים שונים ברשתית (בעיקר תאי גנגליון ומבשרי קולטי האור). חלק הקרינה של הסרט נתפס כתצוגה יחידה הקלטה עם תאורה כפולה צדדית באמצעות מטרת W 40X / 1.0 עם 5 מרווחי דקות. תחזית העצמה המקסימלית של הספר עב-כרס 30 מיקרומטר מוצגת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> סרט 2 מדגים, כמה מהר מאוד אירועים תאיים יכול ליפול בפח עם רזולוציה גבוהה; במקרה זה את הצמיחה של microtubules בבתוספת שלהם מסתיימת ובתאים העצביים ברשתית. המידע הכלול בסרט מאפשר מעקב וכימות של צמיחת microtubule בתוספת הסוף. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> סרט 2:. דינמיקת microtubule בתא בודד הסרט הזה לוכד גוברת טיפים בתוספת של microtubules שזכה על פי חלבון סמן פלוס טיפ EB3-GFP 38. החלבון מתבטא תאים ובתאים רשתית יחיד. Microtubules גדל בעיקר בכיוון מן הפסגה אל בסיס (מלמעלה למטה). המהירות הממוצעת של שביטים EB3 נמדדה כמו 0.28 ± 0.05 מיקרומטר / sec. נקודת האור בצד הפסגה של תא מפגין פעילות התגרענות microtubule הגבוה היא centrosome. העובר סוג הבר הזריק hsp70: EB3-GFP פלסמיד דנ&quot;א. הסרט נרכש 4 שעות לאחר הלם חום (15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס) בסביבות 28 hrpost חומר דשןation (hpf) כתצוגה יחידה הקלטה עם תאורה צדדית יחידה באמצעות במרווחים אובייקטיבי W 63X / 1.0 ושעת 1 שניות. התא הבודד היה קצוץ מתוך שדה הראייה מכסה את הרוב של הרשתית. תחזית העצמה המקסימלית של שתי פרוסות מוצגת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> איור 3 מראה, כיצד מבנים תאיים ניתן בעקבות במשך שעות רבות. כאן, centrosome בתוך translocating תאי הגנגליון ברשתית (RGCs) הוא נתפס. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> איור 3:. לוקליזציה centrosome במהלך טרנסלוקציה תא גנגליון ברשתית מונטאז זה של ניסוי זמן לשגות מציגה את המיקום של centrosome ברחבי התא גנגליון ברשתית (RGC) התבגרות.בשנות ה אבות עצביים centrosome מותאמת קצה קצהו של תהליך הפסגה (1:00). במהלך חלוקת התא, שני centrosomes לשמש הקטבים עבור ציר mitotic (2:25). חלוקה זו התוצאה בתא בת אחת המבדיל לתוך RGC ו תא בת שני שהופך מבשר תא קולט אור. לאחר חלוקה, גוף התא של RGC translocates לצד הבסיס של הרשתית, ואילו תהליך הפסגה נשאר מחובר בצד הפסגה. לאחר RGC מגיע לצד הבסיס, תהליך הפסגה שלה מנתק ואת centrosome נוסע עם זה (06:15). Centrosome ניתן בעקבות בעוד חוזרת בה יחד בהדרגה עם תהליך הפסגה (6:50, 7:20, 8:10). בפריים האחרון (08:55) את תא גנגליון גדל האקסון מצד הבסיס שלה, בעוד centrosome עדיין מקומי apically. ביטוי הפסיפס הושג על ידי הזרקת DNA פלסמיד לתוך עובר סוג בר בשלב תא אחד. התאים הם דמיינו ידי Ath5: GFP-CAAX (ירוק) construct, אשר תוויות RGCs ו נוירונים אחרים. Centrosomes (ראשי חץ) מסומנים על ידי Centrin-tdTomato 29 הביטוי (מג&#39;נטה). צד apical של הרשתית הוא בחלק העליון של התמונה ואת צד הבסיס בתחתית. תחזית העצמה המקסימלית של הספר עב-כרס 30 מיקרומטר מוצגת. התמונות היו קצוצות מסרט המכסה את הרשתית כולה. הסרט מתחיל ב הפריה סביב 34 שעות (hpf). ערימה z נרכשה כל 5 דקות במטרה W 40X / 1.0. זמן מוצג hh: mm. סרגל קנה מידה מייצג 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> באיור 4 הוא מוצג, איך ההתנהגות תא בודד יכול להיות מופק נתונים לכידת הרקמה כולה כמו סרט 1. טרנסלוקציה של RGC ניתן לעקוב בקלות תהליך apical ואת הבסיס שלהes אחריו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> איור 4:. טרנסלוקציה של תא גנגליון ברשתית יחיד טרנסלוקציה RGC מן הפסגה לצד הבסיס של הרשתית מתרחשת לאחר מיטוזה מסוף כמתואר באיור 3 RGC מסומן על ידי הביטוי של Ath5:. הפער-GFP 37 transgene. תחזית העצמה המקסימלית של הספר עב-כרס 30 מיקרומטר מוצגת. התמונות היו קצוצות מסרט המכסה את הרשתית כולה. הסרט מתחיל בסביבות 34 hpf. ערימה z נרכשה כל 5 דקות במטרה W 40X / 1.0. זמן מוצג hh: mm. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> איור 5 מדגים את היכולת של LSFM מרובה תצוגות ללכוד רקמות SCתהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולכים אייל עם רזולוציה הסלולר על הדוגמא של morphogenesis כוס האופטי, שבמהלכה שלפוחית ​​אופטית הופכת כוס אופטית. איכות התמונה ניתן לשפר במידה רבה על ידי הדמיה מרובה תצוגות, כאשר התמונה האחרונה בשילוב מן המידע מ- 5 תצוגות שונות (במקרה זה) לתוך ערימת z אחד עם רזולוציה איזוטרופיים. נתון זה ממחיש את השיפור באיכות תמונה לאחר היתוך משוקלל ורווח נוסף בניגוד תמונה ורזולוציה לאחר deconvolution המרובה תצוגות. האיור מציג שתי פרוסות אופטיות נטיות שונות באמצעות בסיס הנתונים. בנוסף, מונטאז &#39;מן הנתונים deconvolved מציג את morphogenesis הכוס האופטי לאורך זמן. כל נקודות הזמן אז מוצגות לצעוק 3. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> איור 5: השוואה בין איכות תמונה בין תצוגה יחידה שתי שיטות multiview היתוך. (א) פרוסה אופטית אחד נתונים בתצוגה אחת לראות מן העין לרוחב (B) נוף הגבה. חפצי Stripe ושפלה של האות העמוק בתוך המדגם מורגשים. גם חלק של התמונה הגלויה בנתונים התמזגו (CF) לא נתפס לאור המסוים הזה. (C) אותן פרוסה אופטית, עכשיו כנתונים התמזגו מרובי תצוגות לראות מן העין לרוחב (D) הגבה נוף. שים לב חפצי פס מודחקים ומבנים עמוקים במדגם נפתרות טובים יותר. (E) אותן פרוסה אופטית חברה כפי מרובה תצוגות deconvolved נתונים המוצגים מן העין לרוחב (F) הגבה נוף. הערת הניגוד המוגבר החלטה כדי ממברנות התאים הבודדות הגרעינים יכולים להיות יפה מכובדות. ההחלטה אינה להתדרדר עמוק במיוחד בתוך המדגם. בסיס הנתונים נרכשו עם תאורה כפולה צדדים מ -5 נופים כ בנפרד 20 מעלות. ערימות z של abמתוך 100 מיקרומטר עם גודל 1.5 מיקרומטר צעד נרכשו בכל הנוף 10 מרווחי דקות במשך 10 שעות במטרה W 20X / 1.0. תמונות קלט עבור היתוך מרובה תצוגות ו deconvolution למטה נדגמו 2 × כדי לזרז את עיבוד התמונה. 15 חזרות של deconvolution מרובה תצוגות נוהלו. (ז) מונטאז מראה אזור חיתוך של הנוף הגבה מנתוני deconvolved כדי להדגיש את האירועים המוךפו&quot;גנטי שהולכים במהלך התפתחות עין מוקדם מן השלפוחית ​​האופטית לשלב כוס האופטית. שתי השכבות של השלפוחית ​​האופטית, אשר בתחילה דומה epithelia עמודים, להתמיין אוכלוסיות תאים נפרדות. השכבה הדיסטלי הקרובה האפידרמיס הופכת neuroepithelium הרשתית (RN) ואת השכבה הפרוקסימלי קרובה הצינור העצבי הופכת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RP). תאי RN להאריך ו invaginate כדי ליצור את הכוס האופטית (1:40 עד 5:00); באותו הזמן תאי RP לשטח. האאקטודרם המשטח מושרה להקים עדשה (01:40), מה עליי לעשותinvaginates ich מאוחר (5:00). הסרט מתחיל ב 17 hpf. זמן מוצג hh: mm. כל ממברנות התאים מסומנים על ידי אקטין β: ראס-GFP transgene וכל גרעינים מסומנים על ידי hsp70: transgene H2B-RFP. סרגל קנה מידה מייצג 30 מיקרומטר. FB מוח קדמי, עדשת LE, OP הרחת placode, neuroepithelium רשתית RN, RP הפיגמנט ברשתית האפיתל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> סרט 3: morphogenesis כוס אופטיק מוצג עם תצוגה יחידה ושתי שיטות של היתוך מרובה תצוגות סרט הזמן לשגות ממחיש את התהליך השלם של morphogenesis כוס האופטי מן השלפוחית ​​האופטית לשלב כוס האופטית.. זה מראה פרוסה אופטית בודדת מהתצוגה לרוחב (למעלה) ופרוסה אופטית בודדת מתצוגת הגבי (למטה). התאים של השלפוחית ​​בפיתוח האופטית לעבור rearrangements המורכבת ולבסוף כדי ליצור את הכוס האופטית חצי כדור עם neuroepithelium ברשתית הפנימי אפיתל הפיגמנט ברשתית חיצוני. עדשה נוצרת מן האאקטודרם המשטח. זה invaginates יחד עם neuroepithelium ויושב הכוס האופטית. כל ממברנות התאים מסומנים על ידי ביטוי של אקטין β: ראס-GFP (ירוק) transgene ואת הגרעינים מסומנים עם hsp70: H2B-RFP (מג&#39;נטה). הסרט מתחיל בסביבות 17 hpf. בסיס הנתונים נרכשו עם תאורה כפולה צדדים מ -5 נופים כ 20 מעלות זה מזה, az ערימות של כ -100 מיקרומטר נרכשו כל 10 דקות במטרת W 20X / 1.0. זמן מוצג hh: mm. סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development at JoVE.com

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Video: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biology

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioengineering

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מיקרוסקופיה מרובת תצוגות מעודנת עבור עוברים של דגי זברה

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר Spotlight: אסטרטגיות להרכבת עוברים של דגי זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות ברזולוציה גבוהה — טכניקות להדמיה ושחזור תמונה

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

ניתוח התכווצות הלב של דגי זברה עם אינטראקציית מציאות מדומה

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

מחבר זרקור: דימות גיליון אור ברזולוציה גבוהה 4D ומציאות מדומה בדגי זברה לניתוח תא יחיד של תפקוד הלב

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה