This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.

وقد وافق جميع الأعمال الأسماك من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كاليفورنيا في بيركلي (البروتوكول رقم R330). تم تنفيذ القتل الرحيم باستخدام الغمر في 0.025٪ تريكين-S مخزنة مع 0.1٪ بيكربونات الصوديوم 39. يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. 1. إعداد ملاحظة: تنفيذ الخطوات 1،1-1،5 في أنابيب مخروطية أو قارورة التلألؤ التي يمكن ختم بإحكام وتكون وضعت أفقيا. الأسماك لا تحتاج إلى أن تهتز باستمرار، ولكن في محاولة لخلط الحل كلما كان ذلك ممكنا من قلب بلطف أو تهز رف من الأنابيب أو قارورة لفضح جميع الاطراف من الأسماك إلى حل تلطيخ والسماح صمة عار على اختراق الأنسجة بالتساوي. لا تضع دفعة كبيرة من الأسماك على شاكر منصة، والوزن الثقيل من السائل سوف كسر شاكر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح إما الأسماك الطازجة الموت الرحيم أو الأسماك المخزنة في الإيثانول مع 10٪ محايد مخزنة الفورمالين (NBF) بين عشية وضحاها. بدلا من ذلك، استخدم 4٪ paraformألدهيد في حل برنامج تلفزيوني 1X بدلا من 10٪ بنك الفجيرة الوطني. ملاحظة: في حالة استخراج الحمض النووي، لقطة لجزء صغير من الذيلية أو الصدرية زعانف قبل تثبيت وتخزينها في الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من الإصلاح بشكل صحيح في غطاء الكيميائية واستبدالها مع ماء الصنبور (وهذا هو ~ 7.0 درجة الحموضة) لمدة 2 ساعة. تجنب استخدام المياه غير المتأينة لأنها يمكن أن تكون في كثير من الأحيان الحمضية، ويمكن أن يزيل الكلس العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المياه والأسماك وصمة عار مع 0.008٪ الصبغ الأحمر S في 1٪ KOH في الماء لمدة 24 ساعة. وبالنسبة للأسماك أقل من 20 ملم مدة قياسية، واستخدام 0.004٪ الصبغ الأحمر S. (جعل حل الأسهم 100X (0.8٪) من الصبغ الأحمر الأحمر S ومن ثم يمكن تخفيفه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وصمة عار (وضع في حاوية النفايات المناسبة في غطاء محرك السيارة) ومكان الأسماك في مياه الصنبور لبضع ساعة. تغيير الماء حسب الحاجة حتى شطف الماء هو واضح في الغالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أسماك المياه والمكان إلى 50٪ الجلسرين، 0.25٪ KOH للمقاصة خفيفة وتشريح لاحق. ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول تلطيخ من الأساليب المذكورة سابقا 40،41. </li></ol><pالطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. تشريح ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لمراجعة رئيس ذات الصلة التشكل العظمي. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" /> ملطخة رئيس أبو شوكة التشكل العظمي الصبغ الأحمر رئيس أبو شوكة سمك شائك threespine المصورة مع مضان تحت مجموعة رودامين B مرشح: الشكل 1. هو المسمى التشكل المفيدة: أب = وصاد، Subop = subopercle، BSRS = branchiostegal أشعة، Preop = preopercle، Infraorb 1-3 = تحت الحجاج 1-3 (وتسمى أيضا circumorbitals أو suborbitals)، دنت = مضرس، PREMAX = عظم القواطع، ماكس = الفك العلوي ، ناس = الأنف، اللات. ethm = الغربالي الجانبي، Psph = parasphenoid، FRON = العظم الجبهي. للحصول على وصف أكثر تفصيلا لأبو شوكة سمك شائك الرأس هيكل عظمي، انظر أنكار (1974) 31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من</a>هذا الرقم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأسماك المسطحة (الشكل 2A) وإدراج الملقط حادة # 5 ساعات إلى جانب العين في ~ 45 درجة زاوية لثقب الغشاء الذي يغطي العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر الغشاء بعيدا عن العين، على غرار تقشير غطاء اللبن (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ملقط مفتوحة وراء العين، والاستيلاء على عقد من العصب البصري وراء العين، وإزالة العين (الشكل 2C). لا ثقب العين لأنها سوف تسرب الميلانين. إذا ثقب، الميلانين يمكن جرفت خلال خطوات لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من الخلفي، ووضع واحدة صغيرة شفرة تشريح مقص تحت رفرف وصاد، وسحب مقص شفرة ظهريا فوق وصاد، ثم قطع الأنسجة اللينة من خلال لمحجر العين (الشكل 2D). قطع ظهري حتى العظم وصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع العظم الجبهي (الظهرية لمحجر العين) (الشكل 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع العظام parasphenoid خط الوسط حول رانه وسط تجويف العين (الشكل 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع وصاد كرر على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ملقط تحت وصاد وقشر ببطء وجهه بعيدا عن الجسم، وتقليم أي نوع من الأنسجة الناعمة لا تزال تعلق (الشكل 2G - H). الحرص على عدم تعطيل الصف الأول من rakers الخيشومية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالملقط، فصل ceratohyals على كلا الجانبين من قاعدة اللامي خط الوسط في حين تقشير بعيدا وإزالة الهيكل العظمي القحفي الأمامي (الفك بأكمله بما في ذلك مضرس، قادمة الفك العلوي، والفك العلوي، والهيكل العظمي اللامية بأكمله بما في ذلك وصاد الجلد الخارجي، preopercle، subopercle، و أشعة branchiostegal وظهري الكامنة وعناصر غضروفي بطني، والجزء الأمامي من الجمجمة بما في ذلك الأنف، الغربالي الجانبي، والعظام تحت الحجاج، أنظر الشكلين 1 و 2I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمود الفقري الحوض يمكن طيها للخروج من الجسم، ويمكن أن تكون بمثابة مؤشر للملقط لانتزاع عقد سو عندما الحالية. العمود الفقري قفل في مكانه. لفتح، وسحب بلطف العمود الفقري مع ملقط مباشرة بعيدا عن جسم السمكة، ثم ينحني برفق من الخلف للضغط على العمود الفقري شقة ضد الأسماك. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مغلقة ملقط الخلفي وبطني إلى هيكل عظمي الخيشومي (أقل بقليل من أنبوب الأمعاء) وملقط السحب الأمامية، إغاظة بعيدا العضلات والأربطة المتبقية التي تعلق على هيكل عظمي الخيشومي (الشكل 2J - K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نصائح من ملقط مغلقة، كشط بعيدا العضلات ربط ظهري هيكل عظمي الخيشومي إلى القحف بطني في الخلفية إلى الاتجاه الأمامي (الشكل 2L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر 2.9 و 2.10 على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم قاعدة أنبوب القناة الهضمية وسحب الأمامية لإزالة الخيشومي الهيكل العظمي والأمعاء أنبوب (الشكل 2M - N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل أنبوب الأمعاء عن طريق خفض الخلفي عمودي إلى نهاية ceratobranchial الخامس (الشكل 2O </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة أي شظايا العظام المتبقية من قحف المخ على الجانب الظهري من الهيكل العظمي الخيشومي، إدراج مقص في سلة خيشومي لاجراء خفض الظهري (قطع الأمامي إلى الخلفي) بين مجموعات ثنائية لوحات ظهري الأسنان (الشكل 3A - D). وتتركز ضمان قطع لتجنب إتلاف لوحات ظهري الأسنان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين من التخفيضات الجانبية الضحلة في لمعة الأمعاء مطاطي في نهاية الخلفي من الهيكل العظمي الخيشومي (نهاية الأمامي من أنبوب الأمعاء) للمساعدة في فتح هيكل عظمي الخيشومي (الشكل 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأسماك وكل قطعة نسيج في وعاء ووضع الهيكل العظمي الخيشومي إلى أنبوب microcentrifuge مع 50٪ الجلسرين، 0.25٪ KOH لمواصلة المقاصة لطيف، أو 100٪ الجلسرين إذا لم يكن يحتاج المقاصة أخرى. بحيث يمكن تتبع الجرار التسمية وأنابيب مع معرف فريد. كمية من العلاج المطلوب هو إلى حد كبير وظيفة من حجم الأسماك، والأسماك الكبار كبيرة (أكثر من 40 مترم في طول قياسي) تتطلب عادة المقاصة إضافية. </li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" /> الشكل 2: أبو شوكة الخيشومي الهيكل العظمي التشريح الصبغ الأحمر الملون الأسماك أبو شوكة سمك شائك threespine جاهزة للتشريح. وناقصة الصباغ العين من المقاصة واسعة النطاق. وتشير الأسهم الزرقاء اتجاه الحركة. (أ) عرض جانبي لرأس أبو شوكة سمك شائك، الأمامي هو الحق. (ب) إزالة الغشاء الذي يغطي العين. (ج) إزالة العين. (D) الظهرية قطع فوق وصاد. قطع العظم (E) أمامي. قطع (F) Parasphenoid. (G - I) إزالة الهيكل العظمي في الوجه. (J) إزالة اتصالات الأنسجة اللينة هيكل عظمي الخيشومي البطنية. (K - L) إزالة ظهري اتصالات هيكل عظمي خيشومي. (&lt;قوي&gt; M - N) إزالة الهيكل العظمي الخيشومي. (O) فصل أنبوب الأمعاء من الهيكل العظمي الخيشومي. نرى خطوات 2.1 خلال 2.16 لمزيد من التفاصيل. شريط مقياس = 5 ملم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 3. الخيشومي الهيكل العظمي إعادة تلطيخ (إذا لزم الأمر) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على قتامة هيكل عظمي خيشومي أو الأنسجة واضحة أكثر، وإزالة 50٪ الجلسرين، 0.25٪ محلول KOH وتغسل مع 1٪ KOH مرتين (واحد غسل خمس دقائق تبعه ثانيا غسل 24 ساعة في حين تهتز أفقيا على شاكر منصة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1٪ KOH وإعادة صمة عار مع 0.008٪ الصبغ الأحمر S في 1٪ KOH لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وصمة عار واستبدالها مع 1٪ KOH لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل KOH واستبدالها مع 50٪ الجلسرين، 0.25٪ KOH. </li></ol> 4. تصاعد الخيشومي الهيكل العظمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هيكل عظمي الخيشوميمن 50٪ الجلسرين، 0.25٪ KOH أو 100٪ الجلسرين ومكان بالقرب من قاع 22 مم × 60 مم غطاء زجاجي زلة مع الجانب الظهري مواجهة (الشكل 3F). إضافة بضع قطرات من الجلسرين 50٪، 0.25٪ KOH أو 100٪ الجلسرين على رأس الهيكل العظمي الخيشومي. إذا الانتقال من 50٪ الجلسرين، 0.25٪ KOH إلى 100٪ الجلسرين، تغيير الحل في أنبوب microcentrifuge ويهز ل&gt; 5 دقائق قبل تركيب لكي تتوازن الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح اثنين من كرات صغيرة من الصلصال ومكان على حد سواء من انزلاق الغطاء ليكون بمثابة الفواصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فضفاضة ساترة الثانية على أعلى مع ما يكفي من الضغط لشد الهيكل العظمي الخيشومي الأمامي (الشكل 3G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر فتح رفرف ظهري غادر بما في ذلك لوحات الأسنان الظهرية، تتسطح، والانزلاق بين لل coverslips (الشكل 3H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر تقنية مع رفرف ظهري الحق ودفع هيكل عظمي الخيشومي بأكمله بعيدا عن حافة ساترة (الشكل 3I). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيرأصلا، عقد كل من اللوحات ظهري مفتوحة مع ملقط ووضع بعناية ساترة على، تسطيح الهيكل العظمي الخيشومي في اقتراح واحد على نحو سلس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، جبل الهيكل العظمي الخيشومي رأسا على عقب في غطاء واحد زلة، التفلطح كل جانب الظهرية بها أفقيا حتى الجاذبية لا يسمح الهيكل العظمي الخيشومي ليغلق احتياطية. ثم يغطى مع الثاني 22 مم × 60 مم غطاء زجاجي زلة وعكس الإعدادية. ملاحظة: أساليب مختلفة التركيب تميل للعمل بشكل أفضل أو أسوأ من ذلك بالنسبة لكل فرد. حاول كل ونرى ما يشعر أكثر راحة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط برفق على أعلى ساترة لشد كرات من الطين ما يكفي للحفاظ على هيكل عظمي الخيشومي شنت شقة، ولكن الحرص على عدم سحق العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وخلال عملية التركيب، قد ceratobranchials تدوير وتحجب صف من rakers. تصحيح هذا عن طريق تحريك ملقط بين لل coverslips وإعادة توجيه، وceratobranchials أو هيكل عظمي الخيشومي بأكمله. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر محضرات شقة في صواني الشرائح في ريال عمانيدرجة الحرارة أوم. شنت في 100٪ الجلسرين، محضرات يمكن تخزينها بين coverslips سدها لمدة عشر سنوات على الأقل. ملقط نظيفة ومقص مع الأيزوبروبانول أو الايثانول ونصائح غطاء. </li></ol><img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" /> ويظهر تصاعد شقة الهيكل العظمي الخيشومي التلاعب وتركيب الهيكل العظمي الخيشومي: الرقم 3. وتشير الأسهم الزرقاء اتجاه الحركة. (A) الخيشومي هيكل عظمي ظهري حتى الجانب. (B - D) دوران وشق بين لوحات ظهري الأسنان. (E) قطع الجانبي في الأنسجة الرخوة لمزيد من فتح قاعدة أنبوب الأمعاء. (F) الخيشومي هيكل عظمي وضعت في أسفل ساترة جاهزة للتركيب. (G) ساترة الثانية وضعت على النصف الأمامي من الهيكل العظمي الخيشومي (فوق لوحات الأسنان الظهرية). (H - I)تركيب مسطحة الهيكل العظمي الخيشومي عن طريق فتح اللوحات لوحة ظهري الأسنان والانزلاق بين اثنين من زلات الغطاء. نرى خطوات 4.1 خلال 4.6 لمزيد من التفاصيل. شريط مقياس = 5 ملم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<ol>
	<li>Cooper, W. J., Westneat, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function+of+damselfish+skulls:+rapid+and+repeated+evolution+into+a+limited+number+of+trophic+niches.">Form and function of damselfish skulls: rapid and repeated evolution into a limited number of trophic niches.</a> BMC Evol. Biol. 9 (24), (2009).</li><li>Albertson, R. C., Kocher, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+basis+of+cichlid+trophic+diversity.">Genetic and developmental basis of cichlid trophic diversity.</a> Heredity. 97 (3), 211-221 (2006).</li><li>Martin, C. H., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+novelty+is+linked+to+exceptional+rates+of+morphological+diversification+in+two+adaptive+radiations+of+cyprinodon+pupfish.">Trophic novelty is linked to exceptional rates of morphological diversification in two adaptive radiations of cyprinodon pupfish.</a> Evolution. 65 (8), 2197-2212 (2011).</li><li>Wainwright, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+pharyngognathy:+A+phylogenetic+and+functional+appraisal+of+the+pharyngeal+jaw+key+innovation+in+labroid+fishes+and+beyond.">The evolution of pharyngognathy: A phylogenetic and functional appraisal of the pharyngeal jaw key innovation in labroid fishes and beyond.</a> Syst. Biol. 61 (6), 1001-1027 (2012).</li><li>Sibbing, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+capture+and+oral+processing.">Food capture and oral processing.</a> Cyprinid Fishes. , 377-412 (1991).</li><li>Bell, M., Foster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+facial+bone+morphology+in+threespine+sticklebacks.">Evolution and development of facial bone morphology in threespine sticklebacks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (16), 5791-5796 (2005).</li><li>Mcgee, M. D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+as+a+generator+of+phenotypic+diversity+in+threespine+stickleback.">Convergent evolution as a generator of phenotypic diversity in threespine stickleback.</a> Evolution. 67 (4), 1204-1208 (2013).</li><li>McGee, M. D., Schluter, D., Wainwright, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+basis+of+ecological+divergence+in+sympatric+stickleback.">Functional basis of ecological divergence in sympatric stickleback.</a> BMC Evol. Biol. 13, 277 (2013).</li><li>McGuigan, K., Nishimura, N., Currey, M., Hurwit, D., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+variation+in+static+allometry+in+the+threespine+stickleback.">Quantitative genetic variation in static allometry in the threespine stickleback.</a> Integr. Comp. Biol. 50 (6), 1067-1080 (2010).</li><li>Caldecutt, W. J., Bell, M. A., Buckland-Nicks, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+and+geographic+variation+in+dentition+of+threespine+stickleback,+Gasterosteus+aculeatus.">Sexual dimorphism and geographic variation in dentition of threespine stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 2001 (4), 936-944 (2001).</li><li>Berner, D., Moser, D., Roesti, M., Buescher, H., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+architecture+of+skeletal+evolution+in+european+lake+and+stream+stickleback.">Genetic architecture of skeletal evolution in european lake and stream stickleback.</a> Evolution. 68 (6), 1792-1805 (2014).</li><li>Jamniczky, H. a., Barry, T. N., Rogers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eco-evo-devo+in+the+study+of+adaptive+divergence:+examples+from+threespine+stickleback+(Gasterosteus+aculeatus).">Eco-evo-devo in the study of adaptive divergence: examples from threespine stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> Integr. Comp. Biol. 55 (1), 166-178 (2015).</li><li>Magnuson, J., Heitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+raker+apparatus+and+food+selectivity+among+mackerels,+tunas,+and+dolphins.">Gill raker apparatus and food selectivity among mackerels, tunas, and dolphins.</a> Fish. Bull. 69 (2), 361-370 (1971).</li><li>Kahilainen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gill+raker+number+variability+in+adaptive+radiation+of+coregonid+fish.">The role of gill raker number variability in adaptive radiation of coregonid fish.</a> Evol. Ecol. 25 (3), 573-588 (2011).</li><li>Arnegard, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+ecological+divergence+during+speciation.">Genetics of ecological divergence during speciation.</a> Nature. 511 (7509), 307-311 (2014).</li><li>Gross, H. P., Anderson, J. M., Gross, H. P., Anderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+in+the+gillrakers+and+diet+of+European+threespine+sticklebacks,+Gasterosteus+aculeatus.">Geographic variation in the gillrakers and diet of European threespine sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Copeia. 1984 (1), 87-97 (1984).</li><li>Hagen, D., Gilbertson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+and+environmental+selection+in+Gasterosteus+aculeatus+L+in+the+Pacific+Northwest,+America.">Geographic variation and environmental selection in Gasterosteus aculeatus L in the Pacific Northwest, America.</a> Evolution. 26 (1), 32-51 (1972).</li><li>McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+and+evolution+of+sympatric+sticklebacks+(Gasterosteus):+morphological+and+genetic+evidence+for+a+species+pair+in+Enos+Lake,+British+Columbia.">Ecology and evolution of sympatric sticklebacks (Gasterosteus): morphological and genetic evidence for a species pair in Enos Lake, British Columbia.</a> Can. J. Zool. 62 (7), 1402-1408 (1984).</li><li>Schluter, D., McPhail, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+character+displacement+and+speciation+in+sticklebacks.">Ecological character displacement and speciation in sticklebacks.</a> Am. Nat. 140 (1), 85-108 (1992).</li><li>Robinson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trade+offs+in+Habitat-specific+foraging+efficiency+and+the+nascent+adaptive+divergence+of+sticklebacks+in+lakes.">Trade offs in Habitat-specific foraging efficiency and the nascent adaptive divergence of sticklebacks in lakes.</a> Behaviour. 137 (7), 865-888 (2000).</li><li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution.">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> Evodevo. 5 (1), (2014).</li><li>Miller, C. T., Glazer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+loci.">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li><li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing.">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5, 1463-1472 (2015).</li><li>Wainwright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus.">Functional morphology of the pharyngeal jaw apparatus.</a> Fish Physiol. Fish Biomech. , 77-102 (2006).</li><li>Hulsey, C. D., Fraser, G. J., Streelman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+complex+biomechanical+systems:+300+million+years+of+fish+jaws.">Evolution and development of complex biomechanical systems: 300 million years of fish jaws.</a> Zebrafish. 2 (4), 243-257 (2005).</li><li>Lauder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+design+and+evolution+of+the+pharyngeal+jaw+apparatus+in+euteleostean+fishes.">Functional design and evolution of the pharyngeal jaw apparatus in euteleostean fishes.</a> Zool. J. Linn. Soc. 77, 1-38 (1983).</li><li>Fraser, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancient+gene+network+is+co-opted+for+teeth+on+old+and+new+jaws.">An ancient gene network is co-opted for teeth on old and new jaws.</a> PLoS Biol. 7 (2), e1000031 (2009).</li><li>Stock, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dentition+in+comparative+context.">Zebrafish dentition in comparative context.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 523-549 (2007).</li><li>Liem, K., Greenwood, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+approach+to+the+phylogeny+of+the+pharyngognath+teleosts.">A functional approach to the phylogeny of the pharyngognath teleosts.</a> Am. Zool. 21 (1), 83-101 (1981).</li><li>Anker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+kinetics+of+the+head+of+the+stickleback,+Gasterosteus+aculeatus.">Morphology and kinetics of the head of the stickleback, Gasterosteus aculeatus.</a> Trans. Zool. Soc. London. 32 (5), 311-416 (1974).</li><li>Meyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometrics+and+allometry+in+the+trophically+polymorphic+cichlid+fish,+Cichlusomu+citrinelfum:+Alternative+adaptations+and+ontogenetic+changes+in+shape.">Morphometrics and allometry in the trophically polymorphic cichlid fish, Cichlusomu citrinelfum: Alternative adaptations and ontogenetic changes in shape.</a> J. Zool., Lond. 221, 237-260 (1990).</li><li>Huysseune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+in+the+lower+pharyngeal+jaw+dentition+of+Astatoreochromis+alluaudi+(Teleostei:+Cichlidae).">Phenotypic plasticity in the lower pharyngeal jaw dentition of Astatoreochromis alluaudi (Teleostei: Cichlidae).</a> Arch. Oral Biol. 40 (11), 1005-1014 (1995).</li><li>Muschick, M., Indermaur, A., Salzburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+Evolution+within+an+adaptive+radiation+of+cichlid+fishes.">Convergent Evolution within an adaptive radiation of cichlid fishes.</a> Curr. Biol. 22 (24), 2362-2368 (2012).</li><li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6.">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li><li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks.">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. (142), 2442-2451 (2015).</li><li>Tucker, A. S., Fraser, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+developmental+diversity+of+tooth+regeneration.">Evolution and developmental diversity of tooth regeneration.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 25-26, 71-80 (2014).</li><li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks.">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. B. 281, (2014).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>Bell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+phenetics+and+genetics.">Evolutionary phenetics and genetics.</a> Evol. Genet. Fishes. , 431-528 (1984).</li><li>Taylor, W. R., Van Dyke, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+procedures+for+staining+and+clearing+small+fishes+and+other+vertebrates+for+bone+and+cartilage+study.">Revised procedures for staining and clearing small fishes and other vertebrates for bone and cartilage study.</a> Cybium. 9 (2), 107-119 (1985).</li><li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+190+base+pair,+TGF-&#946;+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression.">A 190 base pair, TGF-&#946; responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li><li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis-Regulatory+changes+in+Kit+ligand+expression+and+parallel+evolution+of+pigmentation+in+sticklebacks+and+humans.">cis-Regulatory changes in Kit ligand expression and parallel evolution of pigmentation in sticklebacks and humans.</a> Cell. 131 (6), 1179-1189 (2007).</li><li>Aigler, S. R., Jandzik, D., Hatta, K., Uesugi, K., Stock, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+constraint+underlie+irreversibility+of+tooth+loss+in+cypriniform+fishes.">Selection and constraint underlie irreversibility of tooth loss in cypriniform fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (21), 7707-7712 (2014).</li><li>Pasco-Viel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trends+of+the+pharyngeal+dentition+in+Cypriniformes+(Actinopterygii+Ostariophysi).">Evolutionary trends of the pharyngeal dentition in Cypriniformes (Actinopterygii Ostariophysi).</a> PLoS One. 5 (6), e11293 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all...

كمية لا تصدق من التنوع موجود في الهيكل العظمي رئيس من بين الفقاريات، وخاصة بين الأسماك. في كثير من الحالات وهذا التنوع يسهل استراتيجيات التغذية المختلفة 1-4، ويمكن أن تنطوي على تغييرات كبيرة على كل من الزخرفة القحفي الخارجية والداخلية. يقع الهيكل العظمي الخيشومي داخليا في الحلق من الأسماك ويحيط معظم الشدق. ويتكون الهيكل العظمي الخيشومي من 5 قطاعات المتجانسة بشكل متسلسل، والأمامي أربعة منها دعم الخياشيم. معا هذه القطاعات الخمسة تعمل كحلقة وصل بين الأسماك وطعامهم 5. تباين في العديد من الصفات بما في ذلك rakers الخيشومية والأسنان البلعومية، والعظام خيشومي المساهمة في البحث عن الطعام كفاءة على أنواع مختلفة من المواد الغذائية. خضعت أبو شوكة إشعاع التكيف بعد أشكال المحيطية الأجداد المستعمر بحيرات المياه العذبة والجداول في جميع أنحاء نصف الكرة الشمالي. التحول في النظام الغذائيوقد نتج من العوالق الحيوانية الصغيرة في المحيط الى فريسة أكبر في المياه العذبة في الاختلاف غذائي كبير في 6 عدة سمات القحفي. في حين أن العديد من الدراسات التي تركز على الاختلافات القحفي الخارجية في أبو شوكة 7-13، والتغيرات القحفي هامة تتطور بشكل متكرر في الهيكل العظمي الخيشومي الداخلي. القدرة على خلق الهجينة الخصبة بين السكان أبو شوكة سمك شائك متميزة شكليا يوفر فرصة ممتازة لخريطة الأساس الجيني للتغيرات تطورت إلى هيكل عظمي الخيشومي. واحدة سمة الغذائية ذات أهمية إيكولوجية هي الزخرفة من rakers الخيشومية والعظام الجلدية الدورية التي تبطن الجزء الأمامي والخلفي وجوه من عظام خيشومي وتستخدم لتصفية العناصر فريسة. الأسماك التي تتغذى عادة على بنود الفرائس الصغيرة تميل إلى أن تكون أطول وأكثر كثافة rakers الخيشومية متباعدة مقارنة الأسماك التي تتغذى على أكبر فريسة 14،15. تم الإبلاغ عن الاختلاف في rakers الخيشومية على حد سواء ثithin وبين الأنواع 14-19، وجوانب الخيشومية الجراف الزخرفة تسهم في محاريب التغذية واللياقة البدنية (16). وقد وثقت عقود من البحث على نطاق واسع عدد الخيشومية الجراف والتباين طول في أبو شوكة threespine 17-21. ومع ذلك، تركز هذه الدراسات عادة على الصف الأول من rakers الخيشومية. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة نمطية في التحكم الجيني عدد الخيشومية الجراف عبر الهيكل العظمي الخيشومي 22،23 وعبر صف واحد في الجراف الخيشومية تباعد 23 وطول 24 تسليط الضوء على أهمية دراسة أكثر من صف واحد أو الجراف الخيشومية واحد لفهم الأساس الجيني التنموي للحد من الخيشومية الجراف. هناك سمة الغذائية الثانية من أهمية بيئية والطبية على حد سواء هي الزخرفة الأسنان البلعومية. الأسنان في الأسماك يمكن أن يكون موجودا في كل من الفك عن طريق الفم وفي الهيكل العظمي الخيشومي، والمعروفة باسم الأسنان البلعومية. وتستخدم الأسنان عن طريق الفم في المقام الأول لصالقبض على ري في حين تستخدم الأسنان البلعومية لالمضغ وفريسة التلاعب 25-27. تشكل كلتا المجموعتين عبر آليات تنموية مشتركة وتعتبر تنمويا مثلي 28. يحدث نمطية للاهتمام حيث مسنن بعض الأنواع، مثل الزرد، وعدم الفم والبلعوم ظهري أسنان 29 في حين أن الأنواع الأخرى متعددة ceratobranchials مسننة، pharyngobranchials، وأحيانا قاعدة اللامي وhypobranchials 30. في أبو شوكة، وتوجد الأسنان البلعومية البطني على ceratobranchial الخامس وظهريا على الأمامي والخلفي pharyngobranchials 31. وتشير الحركيات على تغذية أبو شوكة سمك شائك ويستخدم الفك عن طريق الفم في المقام الأول لالتقاط الفريسة، وتسهيل شفط التغذية 9 ترك المضغ في الفك البلعوم. في البلطي، أقل التشكل البلعوم الفك يختلف بشكل كبير 32،33، ولقد ثبت من أن يكون متوائما والمترابطة مع مكانة الغذائية 34. متعددوقد تطورت التنوير القائل السكان أبو شوكة سمك شائك المياه العذبة زيادات حادة في البلعوم بطني الأسنان عدد 23،35،36. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة أن الأساس الجيني التنموي من هذا المكسب الأسنان تطورت يختلف إلى حد كبير في اثنين من السكان المستمدة بشكل مستقل عن أبو شوكة المياه العذبة 36. وخلافا للأسنان الثدييات والأسماك وتجديد أسنانهم باستمرار طوال حياة البالغين 37. تطورت كل من هذه العالي السكان المياه العذبة ذو أسنان وصفه سابقا بمعدل استبدال الأسنان المتسارع، وتوفير نظام الفقاريات نادرة لدراسة الأساس الجيني للتجديد 36. هناك سمة الغذائية الثالثة التي تطورت بشكل متكرر في أبو شوكة المياه العذبة أطول فوق الخيشومية وceratobranchial العظام، وخيشومي homologs قوس قطعي من الفك العلوي والسفلي، على التوالي 38. عظام خيشومي أطول تمنح لالشدق أكبر وعلى الأرجح هي التكيف ليسمح للمواد فريسة أكبر لتكون جonsumed. وعلاوة على ذلك، في الأسماك الأخرى، وعظام فوق الخيشومية مهمة لعلاج الاكتئاب لوحات الأسنان ظهري البلعوم 25. مثل الخيشومية rakers والأسنان البلعومية، وعظام خيشومي داخلية، وبالتالي، من الصعب تصور بسهولة أو كميا. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لتشريح وشقة جبل الهيكل العظمي-الخيشومي، مما يتيح التصور السهل وتقدير من مجموعة متنوعة من الصفات القحفي الهامة. بينما يصف هذا البروتوكول تشريح أبو شوكة سمك شائك، يعمل هذا الأسلوب نفسه في مجموعة متنوعة من الأسماك الأخرى.

<table><tbody><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin (NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glasses 22 mm x 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 10 mm Glass Petri Dish</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td>To dissect samples on</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Can be poured into glass or plastic Petri dishes to make dissecting plates</td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 lb cream</td></tr><tr><td>Scintillation Vials (case of 500)</td><td>Wheaton</td><td>986586</td><td>Borosilicate Glass with Screw Cap</td></tr><tr><td>Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Dumostars are an alternative</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>Alternate sizes are available depending on size of sample</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Leica</td><td>S6E with KL300 LED</td><td>Many other models work nicely, having a flat base helps</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes 1.7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cardboard slide tray</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and flat-mounting of the threespine stickleback branchial skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

<html> هذه النتائج البروتوكول في الهيكل العظمي الخيشومي شنت تشريح ومسطحة (الشكل 4) حيث مجموعة متنوعة من الصفات الغذائية الهامة يمكن أن يكون كميا. من وجهة نظر الظهرية، كافة الصفوف من rakers الخيشومية، جميع لوحات البلعوم الأسنان، وتقريبا كل العظام ...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton at JoVE.com

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

تشريح وشقة-تصاعد للThreespine أبو شوكة الخيشومي الهيكل العظمي

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

dissection-flat-mounting-threespine-stickleback-branchial

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of California, Berkeley. The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species. 

Video: Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

We report here the robust and efficient expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of Branchiostoma lanceolatum. The development of the microinjection technique in this basal chordate will pave the way for far-reaching technical innovations in this emerging model system, including in vivo imaging and gene-specific manipulations.

التعبير عن البروتينات الفلورية في<em&gt; السهيم</em&gt; من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Developmental Biology

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle shells provides unique design principles with potentials for guiding the design of protective materials and systems in the future. Understanding the structure-property relationships for these material systems at the microscale and nanoscale where failure initiates is essential. Currently, experimental techniques such as nanoindentation, X-ray CT, and SEM provide researchers with a way to correlate the mechanical behavior with hierarchical microstructures of these material systems1-6. However, a well-defined standard procedure for specimen preparation of mineralized biomaterials is not currently available. In this study, the methods for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of A. spatula using nanoindentation, FTIR, SEM, with energy-dispersive X-ray (EDX) microanalysis, and X-ray CT are presented.

Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

This paper presents the methods used for probing spatially correlated chemical, structural, and mechanical properties of the multilayered scale of Atractosteus spatula (A. spatula) using nanoindentation, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), and X-ray computed tomography (X-ray CT). The experimental results have been used to investigate the design principles of protective biological materials.

توصيف قشور السمك متعدد الطبقات (<em&gt; ملعقة Atractosteus</em&gt;) عن طريق Nanoindentation، أشعة CT، FTIR، ووزارة شؤون المرأة

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

Bioengineering

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Neuroscience

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from the presomitic mesoderm (PSM) as the tail end of the embryo elongates posteriorly. Somites form with regular periodicity and scale in size. Zebrafish is a popular model organism as it is genetically tractable and has transparent embryos that allow for live imaging. Nevertheless, during somitogenesis, fish embryos are wrapped around a large, rounding yolk. This geometry limits live imaging of PSM tissue in zebrafish embryos, particularly at higher resolutions that require a close objective working distance. Here, we present a flattened 3-D tissue culture method for live imaging of zebrafish tail explants. Tail explants mimic intact embryos by displaying a proportional slowdown of axis elongation and shortening of rostrocaudal somite lengths. We are further able to stall axis elongation speed through explant culture. This, for the first time, enables us to untangle the chemical input of signaling gradients from the mechanistic input of axial elongation. In future studies, this method can be combined with a microfluidic setup to allow time-controlled pharmaceutical perturbations or screening of vertebrate segmentation without any drug penetration concerns.

Here, we present the protocol for 3-D tissue culture of the zebrafish posterior body axis, enabling live study of vertebrate segmentation. This explant model provides control over axis elongation, alteration of morphogen sources, and subcellular resolution tissue-level live imaging.

ثقافة Explant الذيل ثلاثي الأبعاد لدراسة تجزئة الفقاريات في حمار وحشي

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

نهج التصور والتحليل ثلاثي ورباعي الأبعاد لدراسة الاستطالة المحورية الفقارية وتجزئتها

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

نموذج إصابة جرح الطعنة للتكتوم البصري البالغ باستخدام الزرد و Medaka للتحليل المقارن للقدرة التجديدية

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

تشريح وشقة-تصاعد للThreespine أبو شوكة الخيشومي الهيكل العظمي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التعبير عن البروتينات الفلورية في