This work was supported by a grant from the National Health Research Institutes (03-A1 BNMP11-014).

ملاحظة: تم وضع التصاميم الضوئية الرئيسية لدينا تصنيع الجهاز ميكروفلويديك باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والبرمجيات. ثم تم استخدامها في التصاميم لافتعال photomasks الكروم باستخدام خدمة تجارية. وقدمت الأجهزة PDMS باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة. 11 1. تصنيع قوالب ماستر بواسطة الطباعة الحجرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل عملية ضوئيه 12، استخدام رقائق السليكون 4 بوصة باعتبارها الركيزة ويذوى رقائق في الفرن التقليدي عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف رقائق السليكون المجففة باستخدام الأكسجين العلاج البلازما في 100 واط لمدة 30 ثانية في نظافة البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن اثنين سخانات عند 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية، على التوالي، لعملية الخبز التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف 5 غرام من مقاومة للضوء سلبي (PR) على رقائق السليكون تنظيفها من قبل المغطي تدور. تدور في 1200 دورة في الدقيقة (SU-8 50) لمدة 30 ثانية لإنتاج طبقة متناهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العلاقات العامةالمغلفة رقاقة على موقد محمى على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة وتحويلها إلى موقد مسخن آخر في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 33 دقيقة (100 ميكرون أنماط سميكة) لتنفيذ عملية خبز لينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخبز، ووضع العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون على حامل من اليجنر مؤتمتة شبه قناع ومحاذاته إلى 25400 نقطة لكل بوصة الدقة الشفافية الضوئية الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) بجرعة 500 ميغا جول / سم 2 لإنشاء نمط العلاقات العامة على رقاقة السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرقاقة من اليجنر ووضعه على موقد لمرحلة ما بعد الخبز في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع رقائق في SU-8 مطور حل (البروبيلين جليكول monomethyl الأثير خلات، PGMEA) ليغسل العلاقات العامة uncrosslinked لمدة 12 دقيقة والجافة بلطف مع غاز النيتروجين لفضح علامات المحاذاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى، ومعطف 5 غرام من مقاومة للضوء سلبي على رقائق من قبل المغطي تدور. تدور في 700 دورة في الدقيقة (SU-8 100) لمدة 30 ثانية و 1،200 دورة في الدقيقة (SU-8 10) لمدة 30 ثانية لمدة 300 &amp;# 181؛ م نمط سميكة و 27 ميكرون نمط سميكة على التوالي لجعل طبقة microwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة العلاقات العامة المغلفة على موقد عند 65 درجة مئوية لمدة 4 دقائق وعلى 95 درجة مئوية لمدة 8 دقائق (27 ميكرون عميقة القبض جيدا طبقة)؛ وعند 65 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة وعند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 110 دقيقة (300 ميكرون طبقة ثقافة بئر عميقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التبريد، ووضع العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون على اليجنر قناع مجهزة للأشعة فوق البنفسجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح العلاقات العامة المغلفة رقاقة السيليكون لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) بجرعة 250 ميغا جول / سم 2 (27 ميكرون نمط سميكة) و 700 ميغا جول / سم 2 (300 ميكرون نمط سميك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خبز رقاق في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (27 ميكرون نمط سميكة) و 30 دقيقة (300 ميكرون نمط سميك)، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل العلاقات العامة uncrosslinked من قبل PGMEA لمدة 6 دقائق (27 ميكرون نمط سميكة) و 25 دقيقة (300 ميكرون نمط سميك)، على التوالي، ومن ثم تجفيفها مع غاز النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس ارتفاع نمط يتميز علىرقاقة مع profilometer المسح بالليزر عن طريق وضع رقاقة على مرحلة س ص من profilometer المسح بالليزر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط البؤري لتظهر بوضوح ملامح نمط على الرقاقة باستخدام &quot;عرض الكاميرا&quot; واسطة المراقبة تحت 20X عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل وضع المراقبة من &quot;وجهة نظر الكاميرا&quot; إلى &quot;عرض الليزر&quot;، وتعيين المناصب العليا والسفلى من الميزات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط وضع قياس، منطقة، والجودة، وض الملعب حتى شفاف (أعلى)، 1 خط (1،024 × 1)، عالية الدقة و 0.5 ميكرون، على التوالي، ثم اضغط على أسفل بداية لبدء القياس. </li></ol></li></ol> 2. إعداد الأجهزة PDMS لعزل وحيدة الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل PDMS الصب، silanize القوالب رئيسية مع trichlorosilane لخلق سطح مسعور، مما يجعل من الاسهل لتقشر PDMS النسخ المتماثلة من القوالب الرئيسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القوالب الرئيسية وقارب الترجيح التي تحتوي على200 ميكرولتر من trichlorosilane في مجفف، وتطبيق فراغ (-85 كيلو باسكال) لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف فراغ ثم تترك القوالب الرئيسية في مجفف لsilanize القوالب الماجستير في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القوالب الرئيسية من المجفف ووضع كل القالب الرئيسي في 10 سم طبق بتري. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بمبلغ إجمالي قدره 17.6 غرام عدة PDMS البوليمر تحتوي على قاعدة وكيل علاج في نسبة 10: 1، ثم صب PDMS على القالب الرئيسي في طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بتري في مجفف وتطبيق فراغ (-85 كيلو باسكال) لمدة 1 ساعة لإزالة فقاعات الهواء في PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبق بيتري من المجفف ووضعه في الفرن التقليدي عند 65 درجة مئوية لمدة 3-6 ساعة لعلاج PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PDMS المقلدة الشفاء من القوالب الرئيسية ولكمة اثنين من الثقوب بمثابة مدخل ومخرج على طرفي متناهية على مجموعة PDMS متماثلة القبض جيدا من قبل الناخس مع الداخلية-قطر 0.75 ملم لقناة الموائعية (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شريط لتنظيف السطح من النسخ المتماثلة PDMS، ثم قم بوضع النسخ المتماثلة PDMS في نظافة البلازما لوجيزة علاج الأوكسجين البلازما (100 واط لمدة 14 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النسخ المتماثلة PDMS من آلة الأكسجين البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة أعلى (التي تحتوي على microwells القبض) وPDMS القاع (التي تحتوي على microwells الثقافة) نسخة باليد تحت مجهر تشريحي وتقديمهم إلى الاتصال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع PDMS المقلدة الانحياز في الفرن على 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتحقيق الترابط الدائم بين النسخ المتماثلة PDMS لتشكيل الجهاز النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الجهاز PDMS في منزوع الأيونات (DI) حاوية مملوءة للمياه ووضع الحاويات في مجفف تحت فراغ (-85 كيلو باسكال) لمدة 15 دقيقة لإزالة الهواء من متناهية من الجهاز PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجهاز PDMS مملوءة بالماء DI في نسيج الثقافة هود واستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي للضوء: 254 نانومتر) لتعقيم الجهاز لمدة 30 ميلن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الماء DI في الجهاز PDMS مع 5٪ مصل بقري الزلال (BSA) في حل برنامج تلفزيوني 1X واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمنع الخلايا من الالتصاق على سطح PDMS. ملاحظة: طلاء BSA أمر بالغ الأهمية لتحسين كفاءة نقل الخلايا المعزولة من التقاط تماما لثقافة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال حل BSA 5٪ في الجهاز PDMS مع تعقيمها حل برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol> 3. إعداد وحيدة الخلية تعليق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة العصبية الجذعية KT98 الخلية، وسرطان البشري A549 خلية وMDA-MB-435 نحن في طبق بتري في حاضنة الثقافة الخلية التقليدية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، و 95٪ رطوبة) لإعداد الخلايا لتجربة خلية جهاز PDMS . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة والتخلص من ثقافة المتوسط ​​قضى (DMEM المتوسطة القاعدية المتوفرة مع 10٪ الجنين مصل بقري و 1٪ المضادات الحيوية) من الطبق الثقافة مع الخلايا المزروعة إلى 70-80٪ التقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بلطف الخلايا مع تعقيمها برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة والتخلص من برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من مزيج انزيم المؤتلف مع بروتين، حال الكولاجين، والأنشطة الدناز (يرجى الاطلاع على قائمة المواد للحصول على معلومات مفصلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الطبق الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم اضغط على طبق ثقافة لتسهيل مفرزة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني تعقيمها لتفريق الخلايا، ومن ثم نقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف بيليه خلية في 1 مل تعقيمها برنامج تلفزيوني وحساب عدد الخلايا الحية باستخدام معيار التريبان الأزرق طريقة استبعاد 13. ملاحظة: هذه الخطوة إعادة تعليق أمر بالغ الأهمية لإعداد فصل جيدا تعليق وحيد الخلية إلى تحسين كفاءة العزل وحيدة الخلية. </li></ol> 4. عزل وحيدة الخلية والثقافة نسيلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية بتركيز 2،2-2،5 X10 <suص&gt; 6 خلية / مل في متناهية من الجهاز PDMS عبر فتحة منفذ للجهاز مع ماصة المحمولة. ملاحظة: تحميل ماصة تعليق خلية يحتاج إلى توقف والذي عقد في موقف المحطة الأولى لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى متناهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 50 ميكرولتر آخر من تعليق الخلية من خلال ثقب مدخل لملء بالتساوي حتى متناهية كاملة مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق فتحة منفذ مع المكونات (أ، 1 مم قطع النايلون خط الصيد 3 مم طويل) لتجنب تدفق الناجم عن الضغط الهيدروليكي من قطرات على مدخل ومخرج الثقوب. ملاحظة: كانت المقابس الأشعة فوق البنفسجية تعقيم داخل الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ 1 مل محقنة معقمة مع مستنبت، إخراج فقاعات الهواء منها، وإعداده على ضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط المتوسطة تحميل الحقنة لثقب مدخل الجهاز PDMS عبر 23 G إبرة حادة و(PTFE) أنابيب البولي tetrafluoroethene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المكونات من ثقب منفذ وجميعآه فترة زمنية 2-دقيقة للسماح للخلايا ليستقر في خلية واحدة القبض على الآبار بواسطة قوة الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل خلايا uncaptured مع 300 ميكرولتر من مستنبت بمعدل تدفق 600 ميكرولتر / دقيقة يقودها ضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لمدة 2 دقيقة لتحقيق الاستقرار في الجهاز، وختم مدخل ومخرج الثقوب بسدادات لتشكيل نظام الاستزراع المغلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الجهاز باليد إلى نقل الخلايا وحيدة القبض على microwells الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجهاز PDMS في صحن زراعة الأنسجة 100 ملم، وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني تعقيم حول الجهاز لتجنب ثقافة تبخر المتوسط ​​من متناهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبق الثقافة الحاضنة التقليدية الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، و 95٪ الرطوبة) للثقافة نسيلي من الخلايا واحدة. </li></ol> 5. الثقافة المتوسطة التجديد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 د الثقافة واستبدال مستنبت في الجهاز PDMS مع متوسطة جديدة لتحسين العلاقات العامة خليةoliferation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اثنين من قطرات من مستنبت على رأس الجهاز PDMS بالقرب من المناطق مدخل ومخرج الثقوب لتجنب إدخال فقاعات الهواء إلى متناهية أثناء تنفيذ الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكمة اثنين من الثقوب من الجزء العلوي من الجهاز PDMS بالقرب من طرفي متناهية بمثابة مدخل ومخرج للمتناهية. ملاحظة: لا لكمة من خلال بأكملها طبقتين من الجهاز PDMS. بدلا من ذلك، فقط لكمة من خلال الطبقة العليا من PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل حقنة بلاستيكية 1 مل يحتوي متوسطة جديدة إلى مدخل طريق 23 G إبرة حادة وPTFE الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق المتوسطة 120 ميكرولتر جديدة في الجهاز لمدة 5 دقائق ليحل محل المتوسطة من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج اثنين من المقابس لاغلاق مدخل ومخرج الثقوب، ويعود الجهاز إلى حاضنة الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث مستنبت كل د 2 خلال الفترة الثقافة عن طريق إزالة المقابس الختم، تليها بتكرار الخطوات 5،4-5،5. </li></ol>

<ol>
	<li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity.">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li><li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity.">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical flow cytometry. , (2005).</li><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell.">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li><li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science.">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li><li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays.">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells.">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li><li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture.">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li><li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells.">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997 (2009).</li><li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture.">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li><li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses.">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li><li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays.">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li><li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation.">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li><li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+solid+tumors:+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization.">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li><li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays:+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays.">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity.">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

نظم جهاز المستندة إلى Microwell استخدمت 6،14 للتلاعب وحيدة الخلية والتحليل، مثل خلية واحدة على نطاق واسع لظاهرة الاحتباس 6 واحد الجذعية المكونة للدم تكاثر الخلايا 15. وعلى الرغم من حجم جيد والعدد والشكل يمكن تعديلها لتطبيقات محددة، ودائما يؤثر سلبا على كف...

ويتحقق وضع حاليا الخلايا واحدة على حدة في فضاء الثقافة عادة باستخدام الحد من التخفيف أو مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). بالنسبة لكثير من المختبرات، والحد من التخفيف هو وسيلة مريحة، لأنه يتطلب فقط ماصة والأنسجة لوحات الثقافة، والتي هي متاحة بسهولة. في هذه الحالة، يتم المخفف تعليق خلية متسلسل إلى كثافة الخلية المناسبة، ومن ثم وضعها في آبار الثقافة باستخدام ماصة اليدوية. ثم يتم استخدام هذه الخلايا وحيدة compartmented لتحليل الخلايا، مثل التباين الجيني فحص (1) ومستعمرة تشكيل 2. ومع ذلك، وهذه الطريقة منخفضة الإنتاجية والعمالة الكثيفة، دون اللجوء إلى استخدام ذراع روبوتية لمساعدة، لأن طبيعة توزيع بواسون من طريقة التخفيف الحد من تقيد الأحداث وحيدة الخلية إلى احتمال الحد الأقصى من 37٪ 3. يمكن آلات FACS مع الذراع الروبوتية متكامل التغلب على الحد من توزيع بواسون التي كتبها بدقة PLACجي خلية واحدة في الثقافة بشكل جيد في وقت 4. ومع ذلك، فإن ارتفاع إجهاد القص الميكانيكية (وبالتالي، خفضت بقاء الخلية) 5 وشراء آلة والتكاليف التشغيلية محدودة استخدامه في العديد من المختبرات. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، تم وضع أجهزة الميكروسكيل لبكفاءة عالية تحميل الخلايا وحيدة في microwells 6. ومع ذلك، فإن microwells لا توفر مساحة كافية للخلايا تحميل لتتكاثر، وذلك بسبب الحاجة إلى جعل حجم كل microwell قريب من خلية واحدة لتحقيق أقصى قدر من وحيد الخلية احتمال التحميل. كما يطلب فحوصات الثقافة في العديد من التطبيقات المستندة إلى خلية (على سبيل المثال، فحص مولد الرمع 7)، microwells أكبر (90-650 ميكرون في القطر أو في طول الجانب) كما تم استخدامها للسماح للثقافات خلية طويلة. ومع ذلك، مثل طريقة التخفيف الحد، فإنها تمتلك أيضا منخفضة وحيدة الخلية الكفاءات تحميل، تتراوح بين 10 - 30٪ 89 سابقا، قمنا بتطوير منصة عالية الإنتاجية ميكروفلويديك لعزل الخلايا وحيدة في microwells الفردية وإظهار تطبيقه في فحص مولد الرمع للخلايا معزولة. وقدم 10 على الجهاز مع بولي dimethylsiloxane (PDMS)، وتضم مجموعتين من صفائف microwell مع أحجام microwell المختلفة، التي يمكن أن تحسن إلى حد كبير كفاءة في تحميل خلية واحدة في microwell له حجم أكبر بكثير من الخلايا. والجدير بالذكر أن يسمح هذا &quot;ثنائي جيد&quot; مفهوم حجم منطقة ثقافة لتعديلها بمرونة دون التأثير على كفاءة القبض على خلية واحدة، مما يجعلها واضحة لضبط تصميم الجهاز لتناسب أنواع مختلفة من الخلايا والتطبيقات. وينبغي أن تكون هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية ومفيدة لتجارب زراعة الخلايا على المدى الطويل للدراسات خلية التجانس وحيدة النسيلة إنشاء خط الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1323">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">AutoCAD software</td>
			<td style="width:225px;">Autodesk</td>
			<td style="width:235px;">AutoCAD LT 2011</td>
			<td style="width:463px;">Part No. 057C1-74A111-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon wafer&#160;</td>
			<td>Eltech corperation</td>
			<td style="width:235px;">SPE0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional oven</td>
			<td>YEONG-SHIN company</td>
			<td style="width:235px;">ovp45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Nordson</td>
			<td style="width:235px;">AP-300</td>
			<td>Bench-Top Plasma Treatment System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 50 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131269</td>
			<td style="width:463px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 100 negative photoresist</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Y131273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spin coater</td>
			<td>Synrex Co., Ltd.</td>
			<td>SC-HMI 2&#34; ~ 6&#34;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hotplate</td>
			<td>YOTEC company</td>
			<td>YS-300S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Msak aligner</td>
			<td>Deya Optronic CO.</td>
			<td>A1K-5-MDA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 developer</td>
			<td>Grand Chemical Companies</td>
			<td>GP5002-000000-72GC</td>
			<td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scanning laser profilometer</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td>VK-X 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trichlorosilane</td>
			<td>Gelest, Inc</td>
			<td>SIT8174.0</td>
			<td style="width:463px;">TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL.&#160; Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products&#160;</td>
			<td>F42020-0000</td>
			<td>SPACE SAVER VACUUM DESICCATOR 190MM WHITE BASE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Harris Uni-Core puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15072</td>
			<td>with 0.75 mm inner-diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Removable tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch Removable Tape 811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica E24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bersing Technology</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM basal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Hyclone</td>
			<td>SH30071.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotics</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0014-100</td>
			<td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant enzyme mixture</td>
			<td>Innovative cell technology</td>
			<td style="width:235px;">AM-105</td>
			<td>Accumax</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DiIC12(3) cell membrane dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:235px;">354218</td>
			<td>Used as a cell tracker</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:235px;">703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic syringe (1 mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:235px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">23 gauge blunt needles</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td style="width:235px;">TD21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing</td>
			<td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>
			<td style="width:235px;">TFT-23T</td>
			<td>&#160;inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for high-throughput single-cell isolation and culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

وتضم منصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية وثقافة متناهية (200 ميكرومتر في الطول) مع مجموعتين من صفائف microwell (الشكل 2A). ويطلق على مجموعتين من صفائف microwell كما القبض جيدا (25 ميكرون في القطر و 27 ميكرون في العمق) والثقافة بشكل جيد (285 ميكرون في القطر و ...

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture at JoVE.com

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Views.  National Health Research Institutes, Taiwan. Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture. 

Video: A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

عالية الإنتاجية ميكروفلويديك السريع وانخفاض تكلفة النماذج طرق التعبئة والتغليف

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

منصة ميكروفلويديك مع تعدد كشف الالكترونية لتتبع المكانية من الجسيمات

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

منصة موائع جزيئية "التصوير الطولي" في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

منصة موائع جزيئية أولتراهيغ الإنتاجية لتسلسل جينوم خلية واحدة

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

منصة ميكروفلويديك لتحفيز الخلايا الغضروفية مع الضغط الديناميكي

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...