وصف هذا البروتوكول طريقة لتعداد الخلايا السرطانية الحمراء ، وعزل CTC السريري. للبدء ، قم بزراعة الخلايا السرطانية MCF-7 و MDA-MB-231 و HeLa في قارورة زراعة الخلايا في وقت واحد من 10 إلى الخامس في ملليمتر واحد من DMEM ، مع استكمال 10٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تنمو خطوط الخلايا كطبقات أحادية ملتصقة إلى التقاء 95٪ ، افصلها عن طبق المزرعة بمحلول 0.25٪ تربسين لمدة دقيقتين. تلطيخ الخلايا السرطانية عن طريق إضافة ثلاثة ميكرولتر من Calcein AM ، ووضع الطبق في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، هضم جميع الخلايا مع التربسين.
عد الخلايا السرطانية المستنبتة في برنامج تلفزيوني مع غرفة عد الخلايا ، وقم بتخفيفها حتى يتم الحصول على 100 خلية ورمية لكل ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، أدخل تعليق الخلية المخفف في رقاقة الموائع الدقيقة باستخدام حقنة مع مضخة حقنة بمعدلات تدفق متنوعة. الحصول على كفاءة الالتقاط لمعدلات التدفق المختلفة ، وتحديد معدل التدفق الأمثل.
احسب عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها على الرقاقة ، والتي تتدفق من المخرج. احسب كفاءة الالتقاط باستخدام الصيغة المحددة. كرر الإجراء للحصول على كفاءة الالتقاط لأعداد مختلفة من الخلايا السرطانية ، من 10 إلى 100.
اختبار والتحقق من رقاقة الموائع الدقيقة لأعداد نادرة من الخلايا السرطانية. قم بحقن هذه المعلقات ال 10 للعينات في رقائق الموائع الدقيقة باستخدام إبرة مجوفة مصنوعة من مجتذب ماصة لشفط الخلايا السرطانية المخففة. كشف وتعداد عدد الخلايا السرطانية لكل عينة بعد التقاطها على الشريحة.
بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا السرطانية باستخدام Calcein AM ، وقم بتعداد 100 خلية سرطانية في خمسة ميكرولتر من PBS. قم برفع هذه الخلايا إلى ملليلتر واحد من عينة الدم الكاملة والطبيعية. أدخل هذه الخلايا في الشريحة ، وقم بتعداد عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها على الشريحة ذات التألق المناعي الأخضر.
قم بإجراء التعداد في الجسم الحي كما هو موضح، واحسب كفاءة الالتقاط بعد الالتقاط. تعداد واحد إلى 10 خلايا سرطانية دون تلطيخ. قم برفع هذه الخلايا إلى ملليلتر واحد من الدم الطبيعي الكامل.
إدخال هذه العينات في رقاقة الموائع الدقيقة ، والتقاط الخلايا السرطانية. أضف ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من صبغة الفلورسنت إلى 20 إلى 30 ميكرولترا من PBS ، وأدخل هذا المحلول على الشريحة باستخدام حقنة. تعداد عدد الخلايا السرطانية التي تم التقاطها على الرقاقة مع تألق مناعي أزرق وأخضر لتحديد كفاءة الالتقاط.
بعد ذلك ، قم بتعديل سطح الشريحة باستخدام 100 ميكرولتر من 4٪ 3-mercaptopropyl trimethoxysilane والإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة للالتقاط القائم على التقارب لجزيء التصاق الخلايا المضادة للظهارة. في نهاية الحضانة ، اغسل الرقاقة ثلاث مرات بالإيثانول. ثم أضف 100 ميكرولتر من عامل التوصيل GMBS ، واتركه يتفاعل لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، استخدم حقنة لغسل الرقاقة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. عالج الشريحة ب 30 إلى 40 ميكرولترا من 10 ميكروغرام لكل مليلتر نيوترافيدين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مما يؤدي إلى تجميد الخلايا على GMBS ، ثم تتدفق مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأفيدين الزائد. قم بتعديل الشريحة بثلاثة ميكرولتر من الجسم المضاد لجزيء التصاق الخلايا الظهارية المضادة للبيوتينيل ، واحتضانها بين عشية وضحاها.
تم التقاط جميع الخلايا السرطانية حول مجموعة رقاقة الموجة دون فقدان أي خلايا ، مما يشير إلى كفاءة الالتقاط العالية لشريحة الموائع الدقيقة. الخلايا السرطانية الملطخة ب Hoechst و Calcein AM موضحة هنا. يتم عرض CTCs من مريض سرطان المعدة الذي تم التقاطه باستخدام مرشحات صغيرة للقطع الناقص هنا.
أيضا ، يتم عرض CTCs من مريض سرطان القولون والمستقيم الذي تم التقاطه باستخدام مرشحات دقيقة شبه منحرف ، وينبعث منها مضان أزرق وأخضر. لوحظت كفاءة التقاط عالية وقابلية للحياة للخلايا السرطانية التي تم التقاطها باستخدام مرشحات دقيقة كبيرة القطع الناقص. اعترف تحليل التألق المناعي السريري ل CTCs القولون والمستقيم التي تم التقاطها على رقاقة الموائع الدقيقة ب CTCs على أنها إيجابية DAPI ، إيجابية CK ، سلبية CD45 ، وكرات الدم البيضاء على أنها إيجابية DAPI ، سلبية CK ، إيجابية CD45.
يتم عرض خلايا ورم القولون والمستقيم المزروعة على رقاقة القطع الناقص الكبيرة بعد التقاطها ، وخلايا ورم القولون والمستقيم التي تم التقاطها على المرشحات الدقيقة للقطع الناقص الكبير هنا. توفر طريقة التعديل هذه باستخدام aptamer نهجا جديدا لإثراء عزل CTC.
