The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. التجريبية مجموعة المتابعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متطلبات Insectary <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على جميع C. مراحل الرؤيسية الحياة عند 25 درجة مئوية، الرطوبة 65٪ و12/12 ساعة ضوء / الضوئية المعتمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع حوالي 1،500-2،000 الشرانق medfly في قفص 6 L. استخدام قفص مع النحاس شبكة على جانب واحد مع فتحات صغيرة بما يكفي لتحفيز وضع البيض 42. إدراج قطاع الإسفنج من خلال فتحة صغيرة في قاعدة القفص لتوفير الذباب مع الماء عن طريق العمل الشعري. استخدام خليط الخميرة والسكر (01:10) كمصدر الغذاء للبالغين (الشكل 1A). زيادة كمية الخميرة (تصل إلى 1: 3، والخميرة: السكر) في حال فشل الإناث لوضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة مملوءة بالماء أسفل القفص لجمع البيض المودعة من خلال شبكة. كما الإناث البكر يمكن يسرأ، وانتظر حتى الذباب هي 6-7 أيام على الأقل القديمة قبل جمع البيض لتجارب حقن مكروي. وهذا يضمن أن الإناث سوف يكون تزاوجوالتي سيكون قد تم تخصيب البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض من خلال تصفية المياه مع صافي مصفاة غرامة. نقل البيض من مصفاة في علبة بلاستيكية تحتوي على المواد الغذائية اليرقات قياسي (1.5 LH 2 O، 100 مل حمض الهيدروكلوريك 1٪، 5 ز اسع الطيف عامل مضاد للميكروبات حل في 50 مل ايثانول، و 400 غرام من السكر، 175 غرام خميرة البيرة المنزوعة، و1 كغ نخالة القمح اللين) باستخدام ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كل مربع في وعاء شفاف مغلقة مع صافي غطاء للسماح للدوران الهواء وتحتوي على طبقة من نخالة لصالح التشرنق (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حوالي 10 أيام، للتحقق من 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات التي تخرج من المواد الغذائية اليرقات والقفز الى طبقة النخالة لالتشرنق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وجمع الشرانق في فنجان صغير باستخدام فرشاة ناعمة ونقلها إلى قفص الكبار جديد. الكبار تظهر عادة بعد 10 يوما التشرنق. يستخدم الطيران الناشئة ptilinum، جيب نفخ تقع رأسا على عقب فوق القاعدة (ه) من الهوائيات، لإجبار قبالة نهاية puparium. بعد ظهور، وptilinum ينهار بشكل دائم إلى داخل الرأس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 لتر الغذاء ليرقات microinjected <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 2.5 غرام أجار في 300 مل H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دافئ 500 مل H 2 O على طبق من اثارة ساخنة وتذوب 4 ز بنزوات الصوديوم، 4.5 مل 37٪ حمض الهيدروكلوريك، 42 ز خلاصة الخميرة و 115 غرام من مسحوق الجزرة المجففة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى خليط محلول 2.86 غرام واسعة الطيف عامل مضاد للميكروبات المذاب في 10 مل ايثانول المطلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع المتوسطة في 15 سم جولة أطباق بتري والسماح لتبرد. إذا لزم الأمر، وتخزين عند 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريط 2 سم من الشريط على الوجهين على شريحة المجهر (75 × 26 مم 2)، وعلامة على حواف مع علامة الصين، لمنع انتشار النفط ويترتب على ذلك من جفاف الأجنة المحقونة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><stرونغ&gt; تحضير الأحماض النووية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل DNA البلازميد باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا 34. يعجل البلازميد باستخدام الإيثانول واعادة تعليق في المخزن حقن (0.1 ملي العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4، 5 ملي بوكل) في التركيز المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية في المختبر synthetized طويلة الرنا المزدوج الجديلة باستخدام الفينول كلوروفورم، يعجل باستخدام الأيزوبروبانول واعادة تعليق في المخزن حقن 43. </li></ol></li></ol> 2. الأجنة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع علبة مملوءة بالماء تحت قفص يحتوي على 6-7 يوم البالغين من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للإناث ليسرأ لمدة 30 دقيقة ثم جمع الأجنة عن طريق تصفية المياه باستخدام مصفاة دقيقة. احتفظ مصفاة في الماء لتجنب الجفاف من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate الأجنة التي كتبها immerging مصفاة لمدة 5 ثانية في 50٪ من محلول التبييض التجارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة بعناية من قبل immerging مرارا مصفاة في الماء عالى النقاء نظيفة (على الأقل4-5 مرات). وأخيرا، وضع مصفاة في الماء عالى النقاء نظيفة. استخدام الأجنة خلال مدة لا تجاوز 2 ساعة. ملاحظة: توقيت حقن مكروي يرتبط إلى ضرورة حقن في الأجنة قبل الأريمة، خلال مرحلة من الانقسامات النووية قبل cellularization. وهذا يسمح للالحمض النووي حقن الواجب اتخاذها المتابعة إلى نوى، وتحديدا في نوى الخلايا الجرثومية البدائية التي سوف تنشأ الأمشاج. في ذبابة الفاكهة، cellularization في الخلايا القطب يبدأ في حوالي 90 دقيقة بعد الإخصاب (عند 25 ° C)، مع تشكيل الأريمة تحدث بعد حوالي 30 دقيقة 44، في حين أنه في cellularization medfly يقام بين 9 و 12 ساعة 45،46. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجه الجنين في صفوف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الفرشاة الجميلة، وجمع حوالي 50 الأجنة ووضعها على قرص من ورق الترشيح السوداء ينقع بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت مجهر تشريحي تشريح، وترتيب الأجنة في صف واحد على السطح العلوي من الشريط على الوجهين علىالشريحة المجهر باستخدام الفرشاة الجميلة (000) (الشكل 1C). ملاحظة: محاذاة الأجنة كلها في نفس الاتجاه، كما يتم تنفيذ الحقن في القطب الخلفي، حيث خط الجرثومية سوف تنشأ. القطب الخلفي هو الآخر إلى المنطقة بويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الأجنة مع طبقة من النفط chlorotrifluoroethylene التأكد من أن النفط لا تمتد الصين حدود علامة (انظر 1.3). ملاحظة: قبل أن تغطي الأجنة مع النفط، خطوة أخرى يمكن أن يؤديها: الأجنة يمكن المجفف لبضع دقائق لتقليل محتواها السائل، وبالتالي تسهيل دخول محلول الحمض النووي حقن. هذا قد يساعد في تجنب الجنين انفجار أثناء الحقن أو تسرب المفرط من الحل حقن، نتيجة لضغط السائل عالية. </li></ol></li></ol> 3. الأجنة حقن مكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل الإبرة (1-2 ميكرولتر) مع DNA البلازميد أو حل الرنا المزدوج الجديلة (1-2 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام micropipette. </li><lط&gt; ربط الإبرة إلى جهاز حقن مكروي، التي تسيطر على الوقت الحقن (0.5 ثانية)، والضغط (800 هكتوبسكال) واحداهما (150 هكتوبسكال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حقن مكروي تحت مجهر تشريحي، وذلك باستخدام micromanipulator لمراقبة تحركات من الإبرة (الشكل 1D). استخدام المسرح المجهر لتحريك الشريحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على مرحلة من مراحل النطاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج غيض من الإبرة في القطب الخلفي للجنين (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول من خلال تفعيل نظام حقن مكروي مع دواسة. السائل المحقون يدفع زيادة في الضغط الداخلي، مما أدى إلى حركة بسيطة للجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج عن دواسة وعلى الفور، ولكن بلطف، وإزالة الإبرة من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة تسرب حشوية قليلا في موقع الحقن. ملاحظة: للتمييز بين الآثار المميتة المحتملة من الحمض النووي / الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا وفيات بسبب حقن مكروي المواليةcedure نفسه، يجب إجراء تجارب السيطرة. تتكون هذه الحقن من العازلة فقط، أو، في حالة من التجارب علم الوراثة العكسية من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -derived RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة GFP)، أو سيرنا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن احتضان الأجنة عند 25 درجة مئوية. </li></ol> 4. إجراءات ما بعد حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يومين من الحقن، والتحقق من الشرائح لاليرقات (الشكل 1F) تحت مجهر تشريحي. اليرقات يمكن أن تتحرك في مجال النفط ولكن الحاجة إلى أن يتم تحويلها إلى المواد الغذائية اليرقات في أقرب وقت ممكن. لهذا السبب، والتحقق من الشرائح عدة مرات في اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الفرشاة الجميلة (000)، ونقل بلطف اليرقات على الغذاء اليرقات القائم على الجزر. نقل ما يصل إلى حد أقصى قدره 200 اليرقات في كل طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان اليرقات في 65٪ الرطوبة (25 درجة مئوية). تأكد من أن غطاء لا عصا إلى الطبق، إضعاف تبادل الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أطباق بتري مع غطاءأغلقت معظمها بحيث لا يزال هناك تدفق الهواء إلى اليرقات. لتجنب جفاف المفرط، والتحقق من الأطباق يوميا، وإذا لزم الأمر، إضافة الماء لتعويض التبخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق بتري في وعاء واضحة مغلقة من قبل الصافية للغطاء وتحتوي على طبقة من نخالة لصالح التشرنق. أما بالنسبة للتربية insectary الروتينية، 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات القفز من الطعام اليرقات وتخدر تصبح خادرة في نخالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الشرانق ووضعها في قفص صغير لتربية الكبار والفرز (وهذا هو الجيل 0، G0). الخلفي ذرية على الغذاء اليرقات القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة تجارب التحول خط الجرثومية، لفحص إمكانية الأفراد تحولت في الجيل القادم (G1)، كأفراد حقن وعادة ما تكون الوهم. الأحداث والتحول، في الواقع، ربما تكون قد حدثت في أي من نوى مخلى الجنينية، التي ستشكل إما خط الجرثومية أو سوما. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ظهور قريبا، تخدير الأفراد G1 باستخدام ثاني أكسيد الكربون (2) والتحقق من وجود transfأحداث ormation الوقود النووي تحت مجهر تشريحي epifluorescence. للكشف عن وجود مضان أحمر، استخدم مرشح DsRedwide (تحويلة 546/12... عمانويل 605/75)، في حين أن الشاشة لمخضر استخدام فلتر EYFP (تحويلة 500/20... عمانويل 535/30) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأفراد تحولت في قفص صغير مع من النوع البري البالغين من الجنس الآخر، وتنشأ من جديد، في البداية متخالف، سلالة. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microinjection من الأحماض النووية في الأجنة الحشرات هي تقنية عالمية تسهل كل من تحليل وظيفة الجين والتطبيقات التكنولوجية الحيوية. نشر مؤخرا من تسلسل الجينوم من عدد متزايد من أنواع الحشرات يؤدي إلى الحاجة الملحة لأدوات لتوصيف وظيفي من ا?...

ذبابة فاكهة البحر المتوسط (medfly) آفة Ceratitis الرؤيسية هو نوع عالمية أن على نطاق واسع الأضرار الفواكه والمحاصيل الزراعية. وهو ينتمي إلى عائلة ذبابة منزلية، والتي تشمل عدة أنواع الآفات، مثل أولئك الذين ينتمون إلى أجناس Bactrocera وAnastrepha. وmedfly هي الأنواع الأكثر درس من هذه العائلة، وأصبح نموذجا ليس فقط لدراسة الغزوات الحشرات 1، ولكن أيضا لتحسين استراتيجيات إدارة الآفات 2. وmedfly هي الأنواع multivoltine التي يمكن أن تهاجم أكثر من 300 نوع من الحياة البرية والنباتات المزروعة 3،4. وسبب الضرر من قبل كل من البالغين ومراحل اليرقات: الإناث تزاوج تخترق سطح الفاكهة لوضع البيض، مما يسمح للميكروبات لتؤثر على نوعية التجارية الخاصة بهم، في حين أن تتغذى اليرقات على لب الفاكهة. بعد ثلاث مراحل اليرقات، تخرج اليرقات من المضيف وتخدر تصبح خادرة في التربة. آفة Ceratitisيعرض الرؤيسية التوزيع في جميع أنحاء العالم تقريبا، بما في ذلك أفريقيا والشرق الأوسط واستراليا الغربية والوسطى وأمريكا الجنوبية وأوروبا ومناطق من الولايات المتحدة 5. الاستراتيجيات الأكثر شيوعا للحد من تفشي medfly تنطوي على استخدام المبيدات الحشرية (على سبيل المثال، الملاثيون، Spinosad) وصديقة للبيئة تقنية الحشرة العقيمة (SIT) 6. ويشمل هذا النهج الأخير لإطلاقها في البرية من مئات الآلاف من الذكور المقدمة عقيمة عن التعرض لأشعة المؤينة. التزاوج لهذه الذكور المعقمة للإناث البرية النتائج في أي ذرية، مما تسبب في انخفاض في حجم السكان، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى القضاء. على الرغم من أن SIT أثبت فعاليته في عدة حملات في جميع أنحاء العالم، وتشمل العوائق الرئيسية لارتفاع تكاليف تربية وتعقيم الملايين من الحشرات التي ستصدر. تمييز الأفراد الذين أطلق سراحهم من الضروري التمييز عقيمة من الحشرات البرية المأسورة في الميدان خلالرصد أنشطة وتحقيقه حاليا باستخدام مساحيق الفلورسنت. هذه الإجراءات مكلفة ولها آثار جانبية غير مرغوب فيها-7. من أجل تحسين و / أو لوضع نهج أكثر فعالية لمكافحة هذه الآفة، تم استكشافها على نطاق واسع البيولوجيا البحر المتوسط ​​وذبابة علم الوراثة من قبل العديد من الباحثين في جميع أنحاء العالم. توافر تسلسل الجينوم medfly 8،9، سيسهل التحقيقات رواية على وظائف الجينات. تدخل الحمض النووي الريبي هو أداة قوية لمثل هذه الدراسات، وأنه يمكن أن يتحقق من خلال Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة (RNA المزدوج تقطعت بهم السبل) أو سيرنا (صغير التدخل RNA). وقد استخدمت هذه التقنية، على سبيل المثال، لإثبات أن سلسلة الجزيئية تحديد الجنس في C. يتم حفظها الرؤيسية إلا جزئيا فيما يتعلق بهذه ذبابة الفاكهة 10. وضع بروتوكولات لmicroinject الأجنة medfly يسمح C. الرؤيسية ليكون أول غيرذباب -Drosophilid لتعديلها وراثيا. كما بيوضها مماثلة لتلك التي من ذبابة الفاكهة، سواء من حيث الشكل ومقاومة للجفاف 11، وبروتوكول لتقديم DNA البلازميد في الأجنة قبل الأريمة ضعت أول لد. البطن 12،13 تم تكييفها في البداية لاستخدامها في C. الرؤيسية. هذه التجارب الأولى سمحت medfly تحول خط الجرثومية والتى ترتكز على جين قافز مينوس 11. وفي وقت لاحق، تم تعديل النظام الأصلي 14 باستخدام النهج الأخرى القائمة على ينقول. هذا هو حال piggyBac من حرشفية الأجنحة Trichoplusia ني 15. بروتوكول منذ ذلك الحين أبعد الأمثل وهذا ما يسمح للتحول من الأنواع الأخرى tephritid 16-21 وكذلك غيرها الكثير من ذوات الجناحين 22-31. جميع هذه الأنظمة تعتمد على استخدام ناقلات / المساعد نظام التحول البلازميد ثنائي نموذجي: الاصطناعي، TRANSPO معيبيتم تجميع أبناء تحتوي على الجينات المطلوبة إلى البلازميد ودمجها في جينوم الحشرات من خلال تزويد انزيم ترانسبوزاز 32. تم إنشاء عدد من خطوط medfly المعدلة وراثيا، مع ميزات متعددة بما في ذلك سلالات يحمل الجينات القاتلة المهيمنة المشروط أن يدفع الفتك، من السلالات المنتجة للذكور فقط ذرية، وبالتالي لا تتطلب استراتيجيات سإكسينغ] إضافية، والتوترات مع الحيوانات المنوية الفلورسنت، الأمر الذي قد يعزز دقة من مرحلة المراقبة SIT 33-37. وعلى الرغم من الافراج عنه في البرية من الكائنات المعدلة وراثيا قد وقعت في الاختبارات التجريبية ضد البعوض فقط 38،39، شركة واحدة على الأقل وتقييم عدد من سلالات medfly المعدلة وراثيا لاستخدامها في مجال 40. يمكن أن الجنين حقن مكروي مواتية أيضا لتطوير أدوات الجينوم تحرير جديدة، مثل النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPR) / كريسبر بروتين يرتبط 9 نوكلياز (Cas9) ونوكلياز داخلي مؤلف الجينات (HEGs)، مما سيمكن الدراسات التطورية والتنموية الجديدة، فضلا عن توسيع الأدوات التكنولوجية الحيوية المتاحة. يسمح النهج الجينوم التحرير بالفعل جيل من أنظمة الدفع الجينات في البعوض 41، ونقلهم إلى medfly بات وشيكا. نحن هنا وصف بروتوكول عالمي لmicroinjecting الأحماض النووية في الأجنة medfly التي يمكن أن تكون مفيدة لجميع التطبيقات المذكورة أعلاه.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

ذبابة فاكهة البحر الأبيض المتوسط (medfly) آفة Ceratitis الرؤيسية (فيدمان) (ذوات الجناحين: ذبابة منزلية) هو نوع من الآفات ذات الأهمية الزراعية مرتفعة للغاية. ومن المقرر أن سلوكها الإنجابي هذا: الإناث تلف السطح الخارجي من الفواكه والخضروات عندما تضع بيضها وتغذية اليرقات على لب بهم. البرية C. يتم التحكم في السكان الرؤيسية تقليديا من خلال رش مبيدات الحشرات و / أو النهج الصديقة للبيئة، والأكثر نجاحا يجري تقنية الحشرة العقيمة (SIT). تعتمد SIT على كتلة تربية والتعقيم القائم على الإشعاع وإطلاق المجال للذكور التي تحتفظ قدرتها على زميله ولكنها ليست قادرة على توليد ذرية خصبة. ظهور والتطور السريع لاحقة من أدوات التكنولوجيا الحيوية، جنبا إلى جنب مع توافر تسلسل الجينوم medfly، وعززت بشكل كبير من فهمنا للبيولوجيا من هذا النوع. هذا يفضل انتشار استراتيجيات جديدة للتلاعب الجينوم، الذي كاليفورنيان أن تطبق على التحكم في عدد السكان. في هذا السياق، الجنين حقن مكروي يلعب دورا مزدوجا في توسيع الأدوات للسيطرة medfly. القدرة على تتداخل مع وظيفة الجينات التي تنظم العمليات الحيوية الأساسية، في الواقع، ويوسع فهمنا لآلية الجزيئية الكامنة وراء الغزو medfly. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تحقيق التحول خط الجرثومية تسهل إنتاج سلالات معدلة وراثيا المتعددة التي يمكن اختبارها للتطبيقات الميدانية في المستقبل في إعدادات SIT جديدة. في الواقع، والتلاعب الجيني يمكن أن تستخدم لإضفاء الصفات المرغوبة التي يمكن، على سبيل المثال، يمكن استخدامها لمراقبة أداء الذكور العقيمة في هذا المجال، أو التي يمكن أن تؤدي في وقت مبكر الفتك مرحلة الحياة. نحن هنا تصف طريقة لmicroinject الأحماض النووية في الأجنة medfly لتحقيق هذه الأهداف الرئيسيين.

نحن هنا تقرير طلبين من حقن مكروي الجنين الموجهة إلى توصيف وظيفي للالجين (الحالة 1)، وفي توليد سلالات معدلة وراثيا (الحالة 2)، على التوالي. تسليم الرنا المزدوج الجديلة في أجنة لكشف وظيفة الجين. <...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata at JoVE.com

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،<em&gt; آفة Ceratitis الرؤيسية</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

9.0K Views.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Video: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em&gt; Ciona المعوية</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Developmental Biology

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

تدخل الحمض النووي الريبي في الخنافس المائية كأداة قوية للتلاعب التعبير الجيني في نقاط زمنية تنموية محددة

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Environment

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

حقن Gryllus بيماكولاتوس البيض

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

وساطة رني ضربة قاضية بواسطة الجينات وTransgenesis Microinjection في نيماتودا Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Biology

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

الحقن المجهري لنطاط الذرة ، Peregrinus maidis ، الأجنة لتحرير جينوم CRISPR / Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Bioengineering

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

منهج في Microinjection من<em&gt; Patiria minata</em&gt; بيضات ملقحة

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

حقن الجرو والكبار لRNAi و CRISPR تحرير الجينات في Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video