The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Experimenteller Aufbau <ol><li> Insectary Anforderungen <ol><li> Pflegen Sie alle C. capitata Lebensphasen bei 25 ° C, 65% Luftfeuchtigkeit und 12.12 h Hell / Dunkel - Lichtperiode. </li><li> Jeweils etwa 1.500-2.000 Mittelmeerfruchtfliege Puppen in einem 6 L Käfig. Verwenden Sie einen Käfig mit einem Messingnetz auf der einen Seite mit Löchern klein genug , um die Eiablage 42 zu stimulieren. Setzen Sie einen Schwamm Streifen durch eine kleine Öffnung in der Basis Käfig fliegt mit Wasser mittels Kapillarwirkung zu liefern. Verwenden Sie eine Mischung aus Hefe und Zucker (1:10) als Nahrungsquelle für die Erwachsenen (1A). Erhöhen Sie die Menge an Hefe (bis zu 1: 3, Hefe: Zucker) sollten die Weibchen nicht Eier zu legen. </li><li> Legen Sie eine Platte mit Wasser unter dem Käfig gefüllt, um die Eier zu sammeln durch das Sieb aufgebracht. Als jungfräulichen Weibchen Eiablage kann, warten Sie, bis die Fliegen mindestens 6-7 Tage alt sind, bevor Eier für die Mikroinjektionsexperimente zu sammeln. Dadurch wird sichergestellt, dass die Weibchen gepaart habenund dass die Eier befruchtet worden sind. </li><li> Sammeln Sie die Eier durch Filtern des Wassers mit einem feinen Netz Sieb. Übertragen Sie die Eier aus dem Sieb in einer Kunststoff - Box Standard Larvenfutter enthält (1,5 LH 2 O, 100 ml HCl 1%, 5 g Breitspektrum antimikrobielle Mittel in 50 ml Ethanol gelöst, 400 g Zucker, 175 g entmineralisiertes Bierhefe, 1 kg Weichweizenkleie) mit einer Pasteurpipette. </li><li> Legen Sie jedes Feld in einem transparenten Behälter mit einem Netto-Deckel geschlossen Luftzirkulation zu ermöglichen , und eine Schicht aus Kleie enthält , zu begünstigen Verpuppung (1B). </li><li> Nach etwa 10 Tagen, überprüfen 3. Larvenstadium , die aus der Larvenfutter entstehen und springen nach unten in die Kleie - Schicht für Verpuppung. </li><li> 24 Stunden später, sammeln die Puppen in einer kleinen Tasse mit einer weichen Bürste und sie zu einem neuen erwachsenen Käfig übertragen. Erwachsene entstehen normalerweise 10 Tage nach der Verpuppung. Die sich abzeichnende Fliege verwendet die ptilinum, eine aufblasbare Tasche befindet sich auf den Kopf über the Basis der Antennen, um das Ende des Puparium zu zwingen, aus. Nach dem Auftauchen kollabiert die ptilinum permanent im Inneren des Kopfes zurück. </li></ol></li><li> Herstellung von 1 L Nahrung für mikroinjizierten Larven <ol><li> Man löst 2,5 g Agar in 300 ml H 2 O. </li><li> Warm 500 ml H 2 O auf einer heißen Rührplatte und lösen 4 g Natriumbenzoat, 4,5 ml 37% HCl, 42 g Hefeextrakt und 115 g dehydrierte Karotten Pulver. </li><li> In dem Gemisch eine Lösung von 2,86 g Breitspektrum aufgelöst antimikrobielles Mittel in 10 ml absolutem Ethanol. </li><li> das Medium in 15 cm runden Petrischalen verteilen und abkühlen lassen. Falls erforderlich, lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Slide Vorbereitung <ol><li> Legen Sie eine 2 cm Streifen doppelseitiges Klebeband auf einem Objektträger (75 x 26 mm 2) und die Ränder mit einem China - Marker markieren, um Öl Ausbreitung und die daraus folgende Austrocknung der injizierten Embryonen verhindern. </li></ol></li><li><strong&gt; Nukleinsäure-Vorbereitung <ol><li> Isolieren Plasmid - DNA im Handel erhältlichen Kits 34 verwendet wird . Auszufällen, das Plasmid unter Verwendung von Ethanol und resuspendieren in Injektionspuffer (0.1 mM Phosphatpuffer pH 7,4, 5 mM KCl) in der gewünschten Konzentration. </li><li> Reinige in vitro synthetisierte lange dsRNA Phenol-Chloroform, ausfällen Isopropanol und resuspendieren in Injektionspuffer 43. </li></ol></li></ol> 2. Embryo Vorbereitung <ol><li> Legen Sie ein Tablett mit Wasser unter einem Käfig gefüllt, die 6-7 Tage alte Erwachsene. </li><li> Lassen Sie die Frauen für 30 min bis Eiablage und dann die Embryonen sammeln durch Filtern des Wassers ein feines Sieb mit. Halten Sie das Sieb in Wasser Austrocknung der Embryonen zu vermeiden. </li><li> Dechorionate die Embryonen, die durch das Sieb für 5 Sekunden immerging in einer handelsüblichen 50% igen Bleichlösung. </li><li> Waschen Sie die Embryonen vorsichtig durch wiederholtes das Sieb in sauberen Reinstwasser immerging (zumindest4-5 mal). Schließlich legen Sie das Sieb in saubere Reinstwasser. Verwenden Sie die Embryonen innerhalb von maximal 2 Stunden. HINWEIS: Die Zeitsteuerung der Mikroinjektion ist die Notwendigkeit verwandten in vorge blastoderm Embryonen zu injizieren, während einer Phase der Kernteilungen vor Zellularisierung. Auf diese Weise können die injizierte DNA in die Kerne aufgewickelt zu werden, und zwar in die Ur-Keimzellkerne, die die Gameten stammen werden. In Drosophila beginnt Zellularisierung am Pol - Zellen bei etwa 90 min nach der Befruchtung (bei 25 ° C), mit blastoderm Bildung ca. 30 min später 44 auftritt, während in der Mittelmeerfruchtfliege Zellularisierung zwischen 9 und 12 Stunden 45,46 erfolgt. </li><li> Embryo Orientierung in Reihen <ol><li> Mit einem feinen Pinsel, sammeln etwa 50 Embryonen und legen Sie sie auf einer Platte aus schwarzem Filterpapier mit Wasser getränkt. </li><li> Unter einem Sezieren Stereomikroskop, ordnen Sie die Embryonen in einer Reihe auf der oberen Fläche des doppelseitigen Klebeband aufdas Mikroskop - Objektträger einen feinen Pinsel (000) (Abbildung 1C) verwendet wird . HINWEIS: Richten Sie die Embryonen alle in der gleichen Ausrichtung, wie Injektion in den hinteren Pol durchgeführt wird, wo Keimbahn entstehen wird; die hinteren Pol ist mit dem Mikropyle Bereich gegenüber. </li><li> Decken Sie die Embryonen mit einer Schicht aus Chlortrifluorethylen Öl, sicherzustellen, dass das Öl überschwappen nicht Porzellan Marker Grenzen (siehe 1.3). Hinweis: Vor dem Abdecken der Embryonen mit Öl, kann ein weiterer Schritt durchgeführt werden: die Embryonen können für ein paar Minuten getrocknet werden, um ihre Flüssigkeitsgehalt zu reduzieren und damit den Eintritt der injizierten DNA-Lösung erleichtern. Dies kann helfen, embryo Platzen während des Einspritzens oder übermäßiger Leckage des eingespritzten Lösung, als Folge des hohen Flüssigkeitsdruck vermeiden. </li></ol></li></ol> 3. Embryo Mikroinjektions <ol><li> Füllen Sie eine Nadel (1-2 ul) mit Plasmid-DNA oder dsRNA-Lösung (1-2 ug / ul) mit einer Mikropipette. </li><li&gt; Verbinden der Nadel mit dem Mikroinjektionsvorrichtung, die die Einspritzzeit (0,5 s) steuert, wobei der Druck (800 hPa) und der Gegendruck (150 hPa). </li><li> Führen Mikroinjektions unter einem Stereomikroskop, ein Mikromanipulator mit Hilfe der Bewegungen der Nadel (Figur 1D) zu steuern. Verwenden Sie den Mikroskoptisch, um den Schlitten zu bewegen. <ol><li> Platzieren Sie den Schieber auf der Bühne des Umfangs. </li><li> Legen Sie die Spitze der Nadel in den hinteren Pol des Embryos (Abbildung 1E). </li><li> Injizieren Sie die Lösung durch das Mikroinjektionssystem mit dem Pedal zu aktivieren. Die injizierte Flüssigkeit induziert einen Anstieg des Innendrucks, was zu einer leichten Bewegung des Embryos. </li><li> Lassen Sie das Pedal und sofort, aber vorsichtig, entfernen Sie die Nadel aus dem Embryo. </li><li> Beobachten etwas zytoplasmatischen Leckage an der Injektionsstelle. HINWEIS: Um zwischen potentiellen tödlichen Wirkungen von DNA / dsRNA / siRNA und Mortalität aufgrund der Mikroinjektions pro diskriminierenverfahren selbst müssen Kontrollexperimente durchgeführt werden. Diese umfassen die Injektion von Puffer allein, oder, im Fall der reversen Genetik Experimenten eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) abgeleitetes doppelsträngige RNA (dsRNA-GFP) oder siRNA. </li></ol></li><li> Nach der Injektion inkubieren die Embryonen bei 25 ° C. </li></ol> 4. Post-Injektionsverfahren <ol><li> Zwei Tage nach der Injektion, überprüfen Sie die Folien für geschlüpften Larven (1F) unter einem Stereomikroskop. Die Larven können in der Öl bewegen, aber so schnell wie möglich zu Larvenfutter übertragen werden müssen. Aus diesem Grund überprüfen Sie die Folien mehrmals täglich. </li><li> Mit einem feinen Pinsel (000), sanft übertragen die geschlüpften Larven auf die Karotte-basierte Larvenfutter. Übertragen Sie bis zu einem Maximum von 200 Larven pro jeder Petrischale. </li><li> Inkubiere die Larven bei 65% Luftfeuchtigkeit (25 ° C). Stellen Sie sicher, dass der Deckel nicht an der Schale kleben bleibt, beeinträchtigt den Luftaustausch. </li><li> Halten Sie die Petrischalen mit Deckelgeschlossen meist so, dass es noch den Luftstrom zu den Larven ist. Um eine übermäßige Trocknung zu vermeiden, überprüfen die Gerichte täglich und bei Bedarf, Wasser für die Verdunstung zu kompensieren. </li><li> Legen Sie die Petrischalen in einem durchsichtigen Behälter mit einem Netz-Deckel geschlossen und eine Schicht aus Kleie enthält Verpuppung zu begünstigen. Als für die Routine Insektarium Aufzucht, 3. Larvenstadium Sprung aus dem Larvenfutter und in der Kleie verpuppen. </li><li> Sammeln Sie die Puppen und legen Sie sie in einem kleinen Käfig für erwachsene Aufzucht und Screening (dies ist Generation 0, G0). Hinten die Nachkommen auf Standard-Larvenfutter. </li><li> Im Falle von Transformationsexperimente Keimbahn, überprüfen Sie mögliche transformierte Individuen in der nächsten Generation (G1), als Individuen in der Regel injiziert Chimären sind. Trans Ereignisse, ja vielleicht in einem der Kerne der embryonalen syncytium aufgetreten sind, die entweder die Keimbahn oder die soma bilden. <ol><li> Bald nach dem Auflaufen, CO 2 mit G1 Personen betäuben und prüfen , ob transformationen Veranstaltungen unter einem Epifluoreszenz-Stereomikroskop. Um auf das Vorhandensein von roten Fluoreszenz-Bildschirm, verwenden Sie einen DsRedwide Filter (Ext 546/12;.. Emm 605/75), während auf Bildschirm für grüne Fluoreszenz verwenden, um die EYFP Filter (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Platzieren Sie verwandelt Menschen in einem kleinen Käfig mit Wildtyp Erwachsenen des anderen Geschlechts und ihren Ursprung einer neuen, zunächst heterozygot, Stamm. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikroinjektion von Nucleinsäuren in Insekten Embryonen ist ein universelles Verfahren, das sowohl die Analyse der Genfunktion und biotechnologischen Anwendungen erleichtert. Die jüngste Veröffentlichung der Genomsequenzen von einer zunehmenden Anzahl von Insektenarten führt zu einem dringenden Bedarf an Werkzeugen für die funktionelle Charakterisierung von Genen von noch unbekannter Funktion. RNA-Interferenz ist eine der wertvollsten Methoden erwiesen abzuleiten molekularen Funktionen <...

Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata ist eine kosmopolitische Arten , die ausgiebig Schäden Früchte und Kulturpflanzen. Es gehört zur Familie Tephritidae, die zu den Gattungen Bactrocera und Anastrepha gehör mehrere Schädlingsarten, wie diejenigen einschließt. Die Mittelmeerfruchtfliege ist die am meisten untersuchten Arten dieser Familie, und es hat sich zu einem Modell nicht nur für die Untersuchung von Insekten Invasionen 1, aber auch 2 für die Optimierung von Pflanzenschutzstrategien geworden. Die Mittelmeerfruchtfliege ist ein multivoltine Arten , die mehr als 300 Arten von Wild angreifen kann und Kulturpflanzen 3,4. Der Schaden wird sowohl durch die Erwachsenen und die Larvenstadien: begattete durchdringen die Oberfläche der Frucht für die Eiablage, so dass Mikroorganismen ihre Handelsqualität zu beeinflussen, während die Larven ernähren sich von dem Fruchtfleisch. Nach drei Larvenstadien, Larven aus dem Wirt entstehen und in den Boden verpuppen. Ceratitiscapitata zeigt eine nahezu weltweite Verbreitung, einschließlich Afrika, dem Nahen Osten, Westaustralien, Mittel- und Südamerika, Europa und Gebieten der Vereinigten Staaten von Amerika 5. Die am häufigsten verwendeten Strategien Mittelmeerfruchtfliege parasitäre Erkrankungen zu begrenzen , die Verwendung von Insektiziden (zB Malathion, Spinosad) und die umweltfreundliche Sterile Insect Technique (SIT) 6 beinhalten. Der zweite Ansatz beinhaltet die Freisetzung in die Wildnis von Hunderttausenden von Männern gegenüber ionisierender Bestrahlung steril durch Belichtung gemacht. Die Paarung solcher sterilisierten Männchen zu wilden Weibchen führt zu keiner Nachkommen, eine Verringerung der Bevölkerungsgröße zu verursachen, was schließlich zu Ausrottung führen. Obwohl hat SIT weltweit in mehreren Kampagnen bewährt, sind seine größten Nachteile die hohen Kosten für die Aufzucht und Millionen von Insekten Sterilisation freigesetzt werden. Kennzeichnung von freigesetzten Individuen zu unterscheiden, steril von wilden Insekten im Bereich nicht erfasst währendÜberwachung der Aktivitäten und wird derzeit unter Verwendung von fluoreszierenden Pulver erreicht. Diese Verfahren sind teuer und haben unerwünschte Nebenwirkungen 7. Um zu optimieren und / oder wirksamer Ansätze für die Kontrolle dieses Schädlings, der Mittelmeerfruchtfliege Biologie und Genetik zu entwickeln, wurde von zahlreichen Forschern weltweit weit erforscht. Die Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz 8,9, werden neue Untersuchungen an Genfunktionen erleichtern. RNA-Interferenz ist ein leistungsfähiges Werkzeug für solche Studien, und es kann durch die Mikroinjektion von dsRNA (doppelsträngige RNA) oder siRNA (small interfering RNA) erreicht werden. Diese Technik ist verwendet worden, zum Beispiel, dass die Geschlechtsbestimmung Molekular cascade in C. demonstrieren capitata nur teilweise gegenüber derjenigen von 10 Drosophila konserviert. Die Entwicklung von Protokollen Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject C erlaubt capitata die erste nicht zu sein-Drosophilid Fliegenarten genetisch modifiziert werden. Als seine Eier ähnlich denen von Drosophila, sowohl in Bezug auf Morphologie und Widerstand sind 11 bis Desikkation, um das Protokoll Plasmid DNA in vorge blastoderm Embryonen liefern zunächst D. entwickelt melanogaster 12,13 zunächst wurde für den Einsatz in C angepasst capitata. Diese ersten Experimente Mittelmeerfruchtfliege Keimbahntransformation erlaubt basierend auf dem Transposon - Element Minos 11. Unter Verwendung anderer Transposon-basierte Ansätze Anschließend wurde das ursprüngliche System 14 modifiziert. Dies ist der Fall von piggyBac aus der Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Das Protokoll wurde seit weiter optimiert und dadurch die Transformation anderer Tephritiden Spezies 16-21 und auch von vielen anderen Diptera 22-31 erlaubt hat. Alle diese Systeme beruhen auf der Verwendung eines typischen binären Vektor / Helferplasmid Transformationssystem: artificial, defekte transpoSöhne gewünschten Gene enthalten , werden in das Plasmid DNA zusammengesetzt und in das Genom des Insekten integriert , indem das Transposase - Enzym 32 liefert. Eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Linien wurden mit mehreren Funktionen, einschließlich Stämmen erzeugt, eine bedingte dominant-letale Gen trägt, die Letalität induziert, Stämme produzieren nur für Männer Nachkommen und erfordern somit keine zusätzlichen sexing Strategien und Stämme mit fluoreszierenden Spermien, was die Genauigkeit verbessern kann der SIT Überwachungsphase 33-37. Obwohl die Freisetzung in der Wildnis von transgenen Organismen in Pilotversuchen gegen Mücken aufgetreten ist nur 38,39 mindestens ein Unternehmen im Bereich 40 eine Reihe von transgenen Mittelmeerfruchtfliege Stämme für ihre Verwendung zu bewerten. Embryo Mikroinjektions kann auch die Entwicklung von neuen genom Editing-Tools, wie zum Beispiel Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens), gruppierten regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom wiederholt (CR favorisierenISPR) / CRISPR associated protein 9 Nuklease (Cas9) und Homing-Endonukleasen Gene (HEG), die neue evolutionäre und Entwicklungsstudien ermöglichen wird, sowie die zur Verfügung stehende biotechnologische Toolbox erweitert. Genom-Bearbeitung Ansätze erlaubt bereits die Erzeugung von Gen-Antriebssysteme in Stechmücken 41, und deren Übertragung auf die Mittelmeerfruchtfliege steht unmittelbar bevor. Hier beschreiben wir ein universelles Protokoll für Mikroinjizierung Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen, die nützlich für alle Anwendungen der oben genannten sein kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 x injection Buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Buffer</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Construct Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Helper Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dsRNA</td>
			<td style="width:107px;">RNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Phenol-Chloroform purified</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Standard Larval food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing Food&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products&#160; dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#8217;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Carrot Larval Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>yeast extract and sugar (1:10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z692247</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection needles&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956000</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloaders</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double slided tape</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Whatman Black circle paper</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:107px;">Generic reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Diluite 1:2 before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paintbrush (000)</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-153</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult cages</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:107px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceratitis capitata</td>
			<td style="width:107px;">Animal</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">The strain used is ISPRA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

Die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) ist eine Schädlingsarten mit extrem hohen landwirtschaftlichen Relevanz. Dies ist aufgrund seiner Fortpflanzungsverhalten: Frauen die äußere Oberfläche von Obst und Gemüse beschädigen, wenn sie Eier und die geschlüpften Larven ernähren sich von ihren Zellstoff lag. Wilde C. capitata Populationen werden traditionell durch Insektizid kontrolliert Spritzen und / oder umweltfreundliche Ansätze, die erfolgreichste ist die Sterile Insect Technique (SIT). Die SIT setzt auf Massenerziehung, strahlungsbasierte Sterilisation und Feld Freisetzung von Männern, die ihre Fähigkeit behalten, sich zu paaren, sind aber nicht in der Lage fruchtbare Nachkommen zu erzeugen. Das Aufkommen und die anschließende rasante Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge, zusammen mit der Verfügbarkeit der Mittelmeerfruchtfliege Genomsequenz hat verstärkt unser Verständnis der Biologie dieser Spezies. Dies begünstigt die Verbreitung von neuen Strategien für die Genom Manipulation, die can Bevölkerungskontrolle angewendet werden. In diesem Zusammenhang spielt Embryo Mikroinjektions eine doppelte Rolle in der Toolbox für Mittelmeerfruchtfliege Steuerung erweitert. Die Fähigkeit, mit der Funktion von Genen zu stören, die wichtige biologische Prozesse regulieren, in der Tat, erweitert unser Verständnis der molekularen Maschinen der Mittelmeerfruchtfliege Invasivität zugrunde liegen. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit Keimbahntransformation zu erreichen, um die Produktion von mehreren transgenen Stämme, die für zukünftige Anwendungen im Bereich neuen SIT Einstellungen getestet werden können. Tatsächlich kann die genetische Manipulation verwendet werden, um gewünschte Eigenschaften zu verleihen, die können zum Beispiel verwendet werden, sterile männliche Leistung auf dem Gebiet zu überwachen, oder dass in frühen Lebensphasen Letalität führen kann. Hier beschreiben wir eine Methode Nukleinsäuren in der Mittelmeerfruchtfliege Embryonen microinject diese beiden Hauptziele zu erreichen.

Hier berichten wir über zwei Anwendungen von Embryo Mikroinjektions an der funktionellen Charakterisierung eines Gens von Interesse (Fall 1) gerichtet ist, und bei der Erzeugung transgener Stämme (Fall 2) sind. Lieferung von dsRNA in Embryonen Genfunktion zu entwirren. Das innexin-5 - Gen kodiert für ein Spalt-Übergang, die in Insekten, exprimiert wird ...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K Aufrufe.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Serie: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

Das Terroir-Konzept Interpretiert durch Grape Berry Metabolomics und Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Forschung

Genetik

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the others contain 5&#39; monophosphate generated post-transcriptionally (processed transcripts). To discriminate between the two types of transcripts, several strategies have been developed, and most of them depend on presence/absence of 5&#39; triphosphate. However, the triphosphate at primary 5&#39; termini is unstable, and it hinders a clear discrimination of the two types of transcripts. To systematically differentiate and map the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion, we have developed a circular RT-PCR (cRT-PCR)-based strategy by combining cRT-PCR, RNA 5&#39; polyphoshpatase treatment, quantitative RT-PCR (RT-qPCR), and Northern blot. As an improvement, this strategy includes an RNA normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate.
In this protocol, the enriched mitochondrial RNA is pre-treated by RNA 5&#39; polyphosphatase, which converts 5&#39; triphsophate to monophosphate. After circularization and reverse transcription, the two cDNAs derived from 5&#39; polyphosphatase-treated and non-treated RNAs are normalized by maize 26S mature rRNA, which has a processed 5&#39; end and is insensitive to 5&#39; polyphosphatase. After normalization, the primary and processed transcripts are discriminated by comparing cRT-PCR and RT-qPCR products obtained from the treated and non-treated RNAs. The transcript termini are determined by cloning and sequencing of the cRT-PCR products, and then verified by Northern blot.
By using this strategy, most steady-state transcripts in maize mitochondrion have been determined. Due to the complicated transcript pattern of some mitochondrial genes, a few steady-state transcripts were not differentiated and/or mapped, though they were detected in a Northern blot. We are not sure whether this strategy is suitable to discriminate and map the steady-state transcripts in other plant mitochondria or in plastids.

We present a circular RT-PCR-based strategy by combining circular RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5&#39; polyphosphatase-treatment, and Northern blot. This protocol includes a normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate, and it is suitable for discriminating and mapping the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion.

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...