The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. ניסיוני Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרישות insectary <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על כל ג חי capitata טיולים של 25 מעלות צלזיוס, לחות 65% ו 12/12 שעות אור / photoperiod הכהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על 1,500-2,000 גלמים medfly בכלוב L 6. השתמש כלוב עם פליז רשת בצד אחד עם חורים קטנים מספיק כדי לעורר הטלה 42. הכנס רצועה ספוגה דרך פתח קטן בבסיס של הכלוב כדי לספק זבובים עם מים באמצעות כוח הנימיות. השתמש תערובת של שמרים וסוכר (1:10) כמקור מזון עבור המבוגרים (איור 1 א). להגדיל את כמות שמרים (עד 1: 3, שמרים: סוכר) צריכות הנקבות מצליחות להטיל ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת מלאה במים מתחת לכלוב לאסוף את הביצים שהופקדו מבעד לרשת. כמו נקבות בתולה יכולות oviposit, לחכות עד הזבובים לפחות בן 6-7 ימים לפני איסוף ביצים עבור ניסויי microinjection. פעולה זו תבטיח כי הנקבות הזדווגווכי הביצים תהיינה כבר מופרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הביצים על ידי סינון המים עם מסננת נטו בסדר. מעבירים את הביצים מן מסננת בקופסת פלסטיק המכיל מזון הזחל סטנדרטי (1.5 LH 2 O, 100 מ&quot;ל HCl 1%, 5 גרם סוכן מומס מיקרוביאלית-קשת רחבה ב 50 מ&quot;ל אתנול, 400 גרם סוכר, 175 גרם שמרי בירה demineralized, 1 קילו סובין חיטה רך) בעזרת פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל תיבת במיכל שקוף סגור עם מכסה נטו לאפשר זרימת אוויר המכיל שכבת סובין להעדיף התגלמות (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ -10 ימים, לבדוק 3 rd instar זחלים העולות ממזון הזחל ולקפוץ למטה לתוך שכבת הסובין עבור התגלמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות מאוחר יותר, לאסוף את הגלמים בכוס קטנה בעזרת מברשת רכה ולהעבירם לכלוב בוגרים חדש. מבוגרים בדרך כלל מופיעים 10 ימים לאחר ההתגלמות. הזבוב מתעורר משתמש ptilinum, כיס מתנפח ממוקם על הראש מעל הבסיס הדואר של האנטנות, לכפות את סוף puparium. לאחר הופעתה, את ptilinum לצמיתות צונח לאחור בתוך הראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת 1 L מזון לזחלי microinjected <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אגר 2.5 גרם ב 300 מ&quot;ל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ&quot;ל חם 500 H 2 O על פלטה חשמלית ערבוב להמיס 4 גרם נתרן בנזואט, 4.5 מ&quot;ל 37% HCl, תמצית שמרים 42 גרם ו -115 גרם אבקת גזר מיובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לתערובת פתרון של 2.86 גרם סוכן מיקרוביאלית הספקטרום הרחב מומס ב 10 מ&quot;ל אתנול אבסולוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את בינוניים 15 ס&quot;מ עגולים צלחות פטרי להתקרר. במידת הצורך, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רצועת 2 סנטימטר של סרט דו צדדי על שקופיות מיקרוסקופ (75 x 26 מ&quot;מ 2) ולסמן את הקצוות עם סמן בסין, כדי למנוע את התפשטות נפט ההתייבשות הסוגרת של העוברים המוזרקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><stרונג&gt; הכנה חומצות גרעין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד פלסמיד דנ&quot;א באמצעות 34 ערכות זמינות מסחרי. לזרז את הפלסמיד באמצעות אתנול מחדש להשעות במאגר הזרקה (חיץ פוספט 0.1 מ&quot;מ pH 7.4, 5 KCl מ&quot;מ) בריכוז הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר במבחנה synthetized ארוך dsRNA באמצעות כלורופורם פנול, לזרז באמצעות isopropanol מחדש להשעות במאגר הזרקת 43. </li></ol></li></ol> 2. עובר כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגש מלא במים תחת כלוב ובו מבוגרים ישנים 6-7 יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הנקבות כדי oviposit למשך 30 דקות ולאחר מכן לאסוף את העוברים על ידי סינון המים באמצעות מסננת דקה. שמור תמיד את המסננת במים כדי למנוע התייבשות של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים על ידי immerging מסננת למשך 5 שניות בתמיסת אקונומיקה מסחרית 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העוברים בקפידה על ידי immerging מסננת שוב ושוב במי ultrapure נקיים (לפחות4-5 פעמים). לבסוף, הניח את המסננת במי ultrapure נקיים. השתמש עובר בתוך 2 שעות מקסימום. הערה: התזמון של microinjection קשור בצורך להזריק לעוברי טרום blastoderm, במהלך שלב של חטיבות גרעיניות לפני cellularization. זה מאפשר ה- DNA מוזרק להילקח למעלה לתוך גרעינים, במיוחד לתוך גרעין התא נבט הקדמוני אשר מקורן הגמטות. ב תסיסנית, cellularization על תאי המוט מתחיל בערך 90 דקות לאחר ההפריה (25 מעלות צלזיוס), עם היווצרות blastoderm המתרחשת כ -30 דקות מאוחר יותר 44, ואילו cellularization medfly מתרחש בין 9 ל 12 שעות 45,46. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוריינטציה העובר בשורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול בסדר, לאסוף כ -50 עוברים ומניחים אותם על דיסק של נייר פילטר שחור ספוגה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו לנתח, לארגן את העוברים ברציפות על פני השטח העליונים של הסרט דו צדדי עלשקופיות מיקרוסקופ באמצעות מכחול בסדר (000) (תרשים 1C). הערה: ישר את העוברים כולם באותו הכיוון, כמו ההזרקה מתבצעת בקוטב האחורי, שם ניבט אונליין ייוצר; בקוטב האחורי הוא הפוך באזור micropyle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את העוברים עם שכבה של שמן chlorotrifluoroethylene ולוודא כי השמן לא יגלוש סין גבולות סמן (ראה 1.3). הערה: לפני המכסים את העוברים עם שמן, צעד נוסף יכול להתבצע: העוברים ניתן מיובשים במשך כמה דקות כדי להפחית את תכולת הנוזל ובכך להקל על כניסתם של הפתרון ה- DNA המוזרק. זה עשוי לעזור למנוע התפוצצות עוברת במהלך הזרקה או דליפה מוגזמת של הפתרון המוזרק, כפועל יוצא של הלחץ הנזיל הגבוה. </li></ol></li></ol> העובר 3. Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מחט (1-2 μl) עם DNA פלסמיד או פתרון dsRNA (1-2 מיקרוגרם / μl) באמצעות micropipette. </li><li&gt; חבר את המחט למנגנון microinjection, השולטת זמן הזרקה (0.5 שניות), הלחץ (800 hPa) ואת backpressure (150 hPa). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microinjection תחת סטראו, באמצעות micromanipulator לשלוט בתנועות של המחט (איור 1D). השתמש הבמה מיקרוסקופ כדי להעביר את השקף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על הבמה של היקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה המחט לתוך בקוטב האחורי של העובר (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון על ידי הפעלת מערכת microinjection עם הדוושה. הנוזל המוזרק גורם לעלייה בלחץ פנימי, וכתוצאה מכך תנועה קלה של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הדוושה ומייד, אבל בעדינות, להוציא את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים דליפה cytoplasmic קטנה במקום ההזרקה. הערה: כדי להפלות בין השפעות קטלניות הפוטנציאל של DNA / dsRNA / siRNA ותמותה בשל פרו microinjectioncedure עצמו, ניסויי שליטה חייבות להתבצע. אלה מהווים את הזריקה של חיץ בלבד, או, במקרה של ניסויים גנטיקה הפוכה, של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -derived RNA פעמיים תקועים (dsRNA-GFP), או siRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה בעקבות הדגירה עוברת על 25 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הליכים שלאחר הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר ההזרקה, לבדוק את השקופיות עבור הזחלים בקעו (איור 1F) תחת סטראו. הזחלים יכולים לנוע שמן אבל צריך להיות מועבר המזון הזחל בהקדם האפשרי. מסיבה זו, לבדוק את השקופיות כמה פעמים ביום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול בסדר (000), להעביר את הזחלים בקעו בעדינות לאוכל זחל מבוסס הגזר. העבר עד למקסימום של 200 זחלים לכל צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הזחלים בלחות 65% (25 מעלות צלזיוס). ודא כי המכסה אינו מקל על הצלחת, וכתוצאה מכך נפגע חילופי אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על צלחות פטרי עם מכסהבעיקר סגור כך שעדיין יש זרימת אוויר אל הזחלים. כדי למנוע ייבוש יתר, תבדוק את הכלים יומי, במידת הצורך, מוסיפים מים כדי לפצות על התאדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את צלחות פטרי במכל ברור העצום בקרום-נטו המכיל שכבת הסובין להעדיף התגלמות. באשר לגידול insectary שגרתית, 3 rd instar הזחלים לקפוץ החוצה של מזון הזחל pupate ב סובין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הגלמים ומניחים אותם בכלוב קטן עבור גידול מבוגר ומיון (זה הדור 0, G0). אחורי הצאצאים על מזון זחל סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ניסויי טרנספורמציה ניבט אונליין, לבדוק ליחידים טרנספורמציה אפשריים בדור הבא (G1), כיחידים מוזרקים בדרך כלל הן מפלצות. אירועי טרנספוזיציה, אכן, אולי התרחשו בכל הגרעינים של syncytium העוברי, אשר יהוו גם את שורת הניבט או סומה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לאחר הופעתה, להרדים אנשים G1 באמצעות CO 2 ולבדוק transfאירועי ormation תחת סטראו epifluorescence. למסך עבור נוכחות של הקרינה אדום, להשתמש במסנן DsRedwide (שלוחה 546/12;.. Emm 605/75), זמן מסך פלואורסצנטי ירוק להשתמש במסנן EYFP (שלוחה 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אנשים שינו בכלוב קטן עם מבוגרים wild-type של המין השני מקורן זן חדש, בתחילה הטרוזיגוטיים,. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microinjection של חומצות גרעין בעוברי חרקים הוא טכניקה אוניברסלית המאפשרת הוא הניתוח של תפקוד גן ויישומים ביוטכנולוגיים. הפרסום האחרון של רצפי גנום ממספר גדל והולך של מיני חרקים מוביל צורך דחוף כלים לאפיון הפונקציונלי של גנים של פונקצ...

זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata הוא מין קוסמופוליטי כי פירות נזקים בהרחבה וגידולים מעובדים. זה שייך למשפחת Tephritidae, הכוללת מינים מזיקים שונים, כגון השייכים לסוגים Bactrocera ו Anastrepha. Medfly הוא המין הנחקר ביותר של המשפחה הזו, והיא הפכה להיות דוגמא ומופת לא רק לחקר פלישות חרקי 1, אלא גם עבור אופטימיזציה של אסטרטגיות במזיקי 2. Medfly הוא מין multivoltine שיכול לתקוף יותר מ -300 מינים של בר צמחי תרבות 3,4. הנזק נגרם על ידי שני מבוגרים בשלבים הזחל: הנקבות הזדווגו לחדור את פני השטח של הפרי עבור ההטלה, המאפשר מיקרואורגניזמים כדי להשפיע על איכות המסחרי שלהם, ואילו את ההזנה הזחלים על עיסת הפירות. לאחר שלושה שלבי זחל, זחלים יוצאים מן המארח pupate לתוך האדמה. Ceratitiscapitata מציג חלוקה כמעט כלל עולמי, כולל אפריקה, המזרח התיכון, מערב אוסטרליה, מרכז ודרום אמריקה, אירופה, ותחומי בארצות הברית 5. האסטרטגיות הנפוצות ביותר להגביל מכת medfly כרוכה בשימוש חומר הדברה (למשל, malathion, Spinosad) ואת טכניקת סטרילית החרקים הידידותית לסביבה (SIT) 6. הגישה האחרונה כרוכה שחרור לטבע של מאות אלפי גברים שניתנו סטרילי על ידי חשיפה קרינה מייננת. ההזדווגות של זכרים מעוקרים כגון לנקבות בטבע התוצאה לא צאצאים, גרימת ירידה בגודל אוכלוסייה, המובילה בסופו של דבר לחיסול. למרות SIT הוכיח יעילות קמפיינים רבים מרחבי העולם, החסרונות העיקריים שלה כוללים את העלויות הגבוהות של גידול וטיהור מיליוני חרקים להשתחרר. סימון של אנשים שוחררו יש להבחין סטרילי מפני חרקים בטבע שנתפסו בשטח במהלךניטור פעילויות וזה מושג כיום באמצעות אבקות ניאון. נהלים אלה הם יקרים ויש לי 7 תופעות לוואי בלתי רצוי. על מנת לייעל ו / או לפתח גישות יעילות יותר של השליטה על המזיק הזה, ביולוגיה והגנטיקה medfly נחקרו באופן נרחב על ידי חוקרים רבים ברחבי העולם. הזמינות של רצף הגנום medfly 8,9, תקל חקירות רומן על פונקציות גן. התערבות RNA הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים כאלה וזה יכול להיות מושגת באמצעות microinjection של dsRNA (RNA פעמיים תקועים) או siRNA (RNA התערבות קטנה). טכניקה זו נעשתה שימוש, למשל, על מנת להוכיח כי המפל המולקולרי קביעת הזוויג ב C. capitata נשמרת באופן חלקי בלבד ביחס לזה של תסיסנית 10. הפיתוח של פרוטוקולי microinject עובר medfly מותר ג capitata להיות בלתי הראשוןמיני זבוב -Drosophilid להיות מהונדסים גנטי. כפי ביציו דומות לאלו של תסיסנית, הן מבחינת מורפולוגיה ועמידות בפני התייבשות 11, פרוטוקול להעביר דנ&quot;א פלסמיד לעוברי טרום blastoderm הראשון שפותח עבור ד melanogaster 12,13 בתחילה הותאם לשימוש ב C. capitata. הניסויים הראשונים אפשרו טרנספורמציה נבט אונליין medfly מבוסס על טרנספוזון מינוס 11. בהמשך לכך, המערכת המקורית שונתה 14 תוך שימוש בגישות transposon מבוסס אחרים. זהו המקרה של piggyBac מן פרפראים Trichoplusia ni 15. הפרוטוקול מאז מותאם יותר וזה התיר טרנספורמציה של מיני tephritid אחרים 16-21 וגם של רבים אחרים Diptera 22-31. כל המערכות הללו מסתמכות על השימוש של מערכת טרנספורמציה פלסמיד וקטור / עוזר בינארי אופיינית: מלאכותי, transpo הפגוםבנים שיישאו את הגנים הרצויים הם התאספו לתוך ה- DNA פלסמיד והשתלבו הגנום של החרק על ידי אספקת האנזים transposase 32. מספר קווי medfly המהונדסים נוצר, עם תכונות רבות, כוללים זני נושאת גן קטלני דומיננטי מותנה שגרם קטלני, זנים בייצור צאצאים לגברים בלבד ובכך לא מחייב אסטרטגיות זיהוי מין באמצעים נוספות, זנים עם זרע פלורסנט, אשר עשוי לשפר את הדיוק שלב ניטור SIT 33-37. למרות שחרורו בטבע של האורגניזם מהונדס שחל בדיקות טייס נגד יתושים רק 38,39, לפחות חברה אחת בוחנת מספר זני medfly המהונדסים לשימושם בתחום 40. microinjection העובר יכול גם לטובת פיתוח כלים הגנום עריכה חדשים, כגון nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs), חזרות palindromic קצר interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / CRISPR הקשורים nuclease חלבון 9 (Cas9) וגנים endonucleases ביות (HEGs), אשר יאפשר מחקרים האבולוציוניים וההתפתחותיים הרומן, כמו גם הרחבת ארגז הכלים ביוטכנולוגיים זמין. גישות הגנום עריכה כבר מותרות דור מערכות כונן גני יתושים 41, והעבירו אל medfly הוא קרוב. כאן אנו מתארים פרוטוקול אוניברסלי עבור microinjecting חומצות גרעין בעוברים medfly שיכול להיות שימושי עבור כל היישומים הנ&quot;ל.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

זבוב הים התיכון (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) הוא מין הדברה עם הרלוונטיות חקלאיות גבוהות מאוד. זאת בשל התנהגות הרבייה שלה: נקבות לפגום במשטח החיצוני של פרות וירקות כאשר הם מטילים ביצים ואת הזנת הזחלים בקעו על העיסה שלהם. Wild ג אוכלוסיות capitata נשלטות באופן מסורתי באמצעות דברת ריסוס ו / או גישות ידידותיות לסביבה, המצליחות ביותר להיות טכניקת חרקי סטרילי (SIT). לשבת מסתמך על-גידול המוני, עיקור מבוסס קרינה בתחום שחרור הזכרים שומרים ליכולתם להזדווג, אבל הם לא מסוגלים להפיק צאצאים פוריים. ההופעה ואת ההתפתחות המהירה הבאה של כלים ביוטכנולוגיים, יחד עם הזמינות של רצף הגנום medfly, שהגביר מאוד את הבנתנו את הביולוגיה של מין זה. זה העדיף ההתפשטות של אסטרטגיות חדשות עבור מניפולציה הגנום, אשר can להיות מיושם על שליטה באוכלוסייה. בהקשר זה, microinjection העובר ממלא תפקיד כפול בהרחבת ארגז הכלים לבקרת medfly. היכולת להפריע לתפקוד של גנים המווסתים תהליכים ביולוגיים מפתח, אכן, מרחיב את הבנתנו את המנגנון המולקולרי שבבסיס הפולשנות medfly. יתר על כן, היכולת להשיג שינוי הניבט אונליין הופכת לפשוט את הייצור של זנים מהונדסים רבים שיכולים להיבדק עבור יישומים בתחום בעתיד במסגרות SIT רומן. אכן, ניתן להשתמש מניפולציה גנטית להעניק תכונות רצויות שיכולות, למשל, לשמש כדי לפקח על הביצועים זכר סטרילי בתחום, או שיכול לגרום הקטלניות החיים בשלב מוקדם. כאן אנו מתארים שיטה microinject חומצות גרעין לעוברי medfly להשיג שתי מטרות עיקריות אלה.

כאן אנו מדווחים שני יישומים של microinjection עובר מכוון האפיון הפונקציונלי של גן של עניין (מקרה 1), ועל הדור של זנים מהונדסים (מקרה 2), בהתאמה. משלוח dsRNA לעוברי לפענח תפקוד הגן. <p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata at JoVE.com

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

9.0K Views.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Video: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Developmental Biology

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Environment

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

הזרקת גרללוס ביצי ביצה

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Biology

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Bioengineering

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video