The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. set-up sperimentale <ol><li> requisiti insectary <ol><li> Mantenere tutto C. vita capitata in scena a 25 ° C, 65% di umidità e 12/12 ore di luce / buio fotoperiodo. </li><li> Mettere circa 1.500-2.000 pupe medfly in una gabbia 6 L. Utilizzare una gabbia con ottone maglia su un lato con fori abbastanza piccolo per stimolare ovideposizione 42. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura nella base della gabbia di fornire mosche con acqua per mezzo di azione capillare. Usare una miscela di lievito e zucchero (1,10) come fonte di cibo per gli adulti (Figura 1A). Aumentare la quantità di lievito (fino a 1: 3, lievito: zucchero) devono le femmine riescono a deporre le uova. </li><li> Collocare un piatto riempito con acqua sotto la gabbia a raccogliere le uova depositate attraverso le maglie. Come femmine vergini possono oviposit, attendere fino a quando le mosche sono almeno 6-7 giorni prima di raccogliere le uova per gli esperimenti di microiniezione. Questo farà sì che le femmine sono accoppiatie che saranno state fecondate le uova. </li><li> Raccogliere le uova filtrando l&#39;acqua con un colino rete fine. Trasferire le uova dal filtro in una scatola di plastica contenente cibo larvale standard (1,5 LH 2 O, 100 ml di HCl 1%, 5 g ampio spettro antimicrobico disciolto in 50 ml di etanolo, 400 g di zucchero, 175 g di lievito di birra demineralizzata, 1 kg crusca di grano tenero) con una pipetta Pasteur. </li><li> Posizionare ogni scatola in un contenitore trasparente chiuso con un coperchio rete per permettere la circolazione dell&#39;aria e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento (Figura 1B). </li><li> Dopo circa 10 giorni, verificare la presenza di 3 ° larve instar che emergono dal cibo larvale e saltare giù nello strato di crusca per impupamento. </li><li> 24 ore più tardi, raccogliere le pupe in una tazzina con una spazzola morbida e trasferirli ad una nuova gabbia per adulti. Adulti normalmente emergono 10 giorni dopo impupamento. La mosca emergente utilizza il ptilinum, una tasca gonfiabile situato sulla sua testa sopra esimoe di base delle antenne, per forzare l&#39;estremità del puparium. Dopo la nascita, il ptilinum crolla definitivamente indietro all&#39;interno della testa. </li></ol></li><li> Preparazione di 1 L di cibo per le larve microiniezione <ol><li> Sciogliere 2.5 g di agar in 300 ml di H 2 O. </li><li> Warm 500 ml di H 2 O su una piastra di agitazione caldo e sciogliere 4 g di sodio benzoato, 4,5 ml di 37% di HCl, 42 g di estratto di lievito e 115 g di polvere disidratati carota. </li><li> Aggiungere alla miscela una soluzione di 2,86 g ampio spettro antimicrobico sciolti in 10 ml di etanolo assoluto. </li><li> Distribuire il mezzo in 15 cm rotonde piastre di Petri e lasciare raffreddare. Se necessario, conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> preparazione del vetrino <ol><li> Posizionare una striscia di 2 cm nastro biadesivo su un vetrino da microscopio (75 x 26 mm 2) e segnare i bordi con un pennarello la Cina, per prevenire la diffusione del petrolio e la conseguente essiccazione degli embrioni iniettati. </li></ol></li><li><strong&gt; Nucleic Acid Preparazione <ol><li> Isolare plasmide DNA utilizzando kit disponibili in commercio 34. Precipitare il plasmide usando etanolo e risospendere in tampone di iniezione (0,1 mM tampone fosfato pH 7,4, 5 mM KCl) alla concentrazione desiderata. </li><li> Purificare in vitro sintetizzata lungo dsRNA con fenolo-cloroformio, precipitare con isopropanolo e risospendere in tampone iniezione 43. </li></ol></li></ol> 2. Embryo Preparazione <ol><li> Posizionare un vassoio pieno di acqua sotto una gabbia contenente 6-7 giorni vecchi adulti. </li><li> Lasciare le femmine per oviposit per 30 minuti e poi raccogliere gli embrioni filtrando l&#39;acqua con un colino. Tenere sempre il filtro in acqua per evitare la disidratazione degli embrioni. </li><li> Dechorionate gli embrioni immergendo il filtro per 5 secondi in una soluzione commerciale di candeggina al 50%. </li><li> Lavare accuratamente gli embrioni ripetutamente immergendo il filtro in acqua ultrapura pulita (almeno4-5 volte). Infine, posizionare il filtro in acqua ultrapura pulita. Usare gli embrioni entro massimo 2 ore. NOTA: I tempi di microiniezione è legato alla necessità di iniettare in embrioni pre-blastoderma, durante una fase di divisioni nucleari prima cellularization. In questo modo il DNA iniettato da prendere-up nei nuclei, in particolare nei nuclei delle cellule germinali primordiali che provengono i gameti. In Drosophila, cellularization alle cellule polo inizia a circa 90 minuti dopo la fecondazione (a 25 ° C), con formazione blastoderma che si verificano circa 30 min più tardi 44, mentre nel cellularization medfly si svolge tra il 9 e il 12 ore 45,46. </li><li> Orientamento degli embrioni in righe <ol><li> Utilizzando un pennello fine, raccogliere circa 50 embrioni e metterli su un disco di carta da filtro nero inzuppato d&#39;acqua. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio dissezione, organizzare gli embrioni in fila sulla superficie superiore del nastro biadesivo suil vetrino da microscopio utilizzando un pennello fine (000) (Figura 1C). NOTA: allineare gli embrioni tutte con lo stesso orientamento, l&#39;iniezione viene eseguita nel polo posteriore, dove germinali avrà origine; polo posteriore è opposta alla zona micropilo. </li><li> Coprire gli embrioni con uno strato di olio clorotrifluoroetilene fare in modo che l&#39;olio non fuoriesca la Cina confini marcatori (vedi 1.3). NOTA: Prima di coprire gli embrioni con olio, un ulteriore passo può essere eseguito: gli embrioni possono essere essiccate per alcuni minuti per ridurre il loro contenuto di liquido e facilitare l&#39;ingresso della soluzione di DNA iniettato così. Questo può evitare embrione rottura durante l&#39;iniezione o eccessiva fuoriuscita della soluzione iniettata, in conseguenza della elevata pressione del liquido. </li></ol></li></ol> 3. Embrione microiniezione <ol><li> Riempire un ago (1-2 ml) con il DNA plasmide o una soluzione dsRNA (1-2 mg / mL) con una micropipetta. </li><li&gt; Collegare l&#39;ago all&#39;apparato microiniezione, che controlla il tempo di iniezione (0,5 sec), la pressione (800 hPa) e la contropressione (150 hPa). </li><li> Eseguire microiniezione allo stereomicroscopio, utilizzando un micromanipolatore per controllare i movimenti dell&#39;ago (Figura 1D). Utilizzare il palco microscopio per spostare la diapositiva. <ol><li> Posizionare il vetrino sul palco del campo di applicazione. </li><li> Inserire la punta dell&#39;ago nel polo posteriore dell&#39;embrione (Figura 1E). </li><li> Iniettare la soluzione attivando il sistema microiniezione con il pedale. Il liquido iniettato induce un aumento della pressione interna, causando un leggero movimento dell&#39;embrione. </li><li> Rilasciare il pedale e subito, ma delicatamente, rimuovere l&#39;ago dall&#39;embrione. </li><li> Osservare un po &#39;di dispersione citoplasmatica al sito di iniezione. NOTA: per discriminare tra i potenziali effetti letali di DNA / RNA a doppio filamento / siRNA e la mortalità a causa della microiniezione proprocedura stessa, esperimenti di controllo devono essere eseguite. Questi comprendono l&#39;iniezione di tampone soltanto, o, nel caso di esperimenti di genetica inversa, di una proteina fluorescente verde (GFP) -derived doppio filamento RNA (dsRNA-GFP), o siRNA. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;iniezione incubare gli embrioni a 25 ° C. </li></ol> 4. Procedure post-iniezione <ol><li> Due giorni dopo l&#39;iniezione, controllare le diapositive per le larve schiuse (Figura 1F) sotto uno stereomicroscopio. Le larve può muoversi nell&#39;olio ma devono essere trasferiti al cibo larvale appena possibile. Per questo motivo, controllare le diapositive più volte al giorno. </li><li> Utilizzando un pennello fine (000), trasferire delicatamente le larve schiuse al cibo larvale carota-based. Trasferire fino a un massimo di 200 larve per ogni piatto Petri. </li><li> Incubare le larve al 65% di umidità (25 ° C). Assicurarsi che il coperchio non si attacca al piatto, compromettendo ricambio d&#39;aria. </li><li> Mantenere le piastre di Petri con il coperchioper lo più chiusi in modo che ci sia ancora flusso d&#39;aria alle larve. Per evitare l&#39;asciugatura eccessiva, controllare i piatti tutti i giorni e, se necessario, aggiungere acqua per compensare l&#39;evaporazione. </li><li> Porre le capsule di Petri in un contenitore trasparente chiuso da un coperchio-rete e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento. Per quanto riguarda la routine di allevamento insectary, 3 ° larve instar saltare fuori del cibo larvale e pupate nella crusca. </li><li> Raccogliere le pupe e metterli in una piccola gabbia per l&#39;allevamento degli adulti e di screening (questo è Generazione 0, G0). Posteriore la progenie sul cibo larvale standard. </li><li> Nel caso di esperimenti di trasformazione germ-line, verificare la presenza di eventuali individui trasformati nella prossima generazione (G1), come individui iniettati di solito sono chimere. eventi di trasposizione, infatti, potrebbe essersi verificato in uno qualsiasi dei nuclei del sincizio embrionali, che andranno a formare sia il germe-line o il soma. <ol><li> Poco dopo la nascita, anestetizzare gli individui G1 con CO 2 e verificare la presenza di transfeventi ormazione sotto un stereomicroscopio epifluorescenza. Per lo screening per la presenza di fluorescenza rossa, utilizzare un filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mentre allo schermo per fluorescenza verde utilizzare il filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Mettere le persone trasformate in una piccola gabbia con wild-type adulti di sesso opposto e originare una nuova, inizialmente eterozigote, ceppo. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microiniezione di acidi nucleici in embrioni insetti è una tecnica universale che facilita sia l&#39;analisi della funzione genica e applicazioni biotecnologiche. La recente pubblicazione delle sequenze genomiche da un crescente numero di specie di insetti porta ad una necessità urgente di strumenti per la caratterizzazione funzionale dei geni di funzione ancora sconosciute. RNA-interferenza ha dimostrato di essere uno dei metodi più importanti per dedurre funzioni molecolari 49</sup...

La mosca della frutta mediterranea (medfly) Ceratitis capitata è una specie cosmopolita che estesamente danneggia frutta e coltivazioni. Appartiene alla famiglia Tephritidae, che comprende diverse specie di parassiti, come ad esempio quelli appartenenti ai generi Bactrocera e Anastrepha. La medfly è la specie più studiati di questa famiglia, ed è diventato un modello non solo per lo studio delle invasioni insetti 1, ma anche per ottimizzare le strategie di gestione dei parassiti 2. Il medfly è una specie multivoltine che possono attaccare più di 300 specie di selvatici e piante coltivate 3,4. Il danno è causato da entrambi gli adulti ed i stadi larvali: femmine fecondate perforare la superficie del frutto per la deposizione delle uova, permettendo ai microrganismi di influenzare la qualità commerciale, mentre le larve si nutrono della polpa di frutta. Dopo tre stadi larvali, larve emergono dall&#39;host e pupate nel terreno. Ceratitiscapitata mostra una distribuzione quasi tutto il mondo, tra cui l&#39;Africa, il Medio-Oriente, Western Australia, Centro e Sud America, Europa, e le aree degli Stati Uniti 5. Le strategie più comuni per limitare le infestazioni medfly comportano l&#39;uso di insetticidi (ad esempio, Malathion, spinosad) e l&#39;ecologico Sterile Insect Technique (SIT) 6. Il secondo approccio comporta il rilascio nell&#39;ambiente naturale di centinaia di migliaia di maschi resi sterili da esposizione a radiazioni ionizzanti. L&#39;accoppiamento di questi maschi sterilizzati alle femmine selvatiche si traduce in nessun progenie, causando una riduzione della dimensione della popolazione, portando infine alla eradicazione. Anche se SIT si è dimostrato efficace in più campagne in tutto il mondo, i suoi principali svantaggi sono gli alti costi di allevamento e sterilizzazione di milioni di insetti per essere rilasciato. Marcatura di esemplari rilasciati è necessario distinguere sterile da insetti selvatici catturati sul campo duranteattività di monitoraggio ed è attualmente realizzato con polveri fluorescenti. Queste procedure sono costose e hanno effetti collaterali indesiderati 7. Al fine di ottimizzare e / o per sviluppare approcci più efficaci per il controllo di questo parassita, biologia e genetica medfly sono stati ampiamente esplorato da numerosi ricercatori di tutto il mondo. La disponibilità della sequenza del genoma medfly 8,9, faciliterà nuove indagini sulle funzioni dei geni. RNA interferenza è un potente strumento per tali studi e può essere raggiunto attraverso la microiniezione di dsRNA (RNA a doppio filamento) o siRNA (small interfering RNA). Questa tecnica è stata utilizzata, per esempio, per dimostrare che la determinazione del sesso cascata molecolare in C. capitata è solo parzialmente conservata rispetto a quello di Drosophila 10. Lo sviluppo di protocolli per microinject embrioni medfly ammessi C. capitata di essere il primo nonspecie di mosca -Drosophilid da geneticamente modificati. Come le sue uova sono simili a quelli di Drosophila, sia in termini di morfologia e la resistenza all&#39;essiccamento 11, il protocollo per fornire DNA plasmidico in embrioni pre-blastoderma primo sviluppati per D. melanogaster 12,13 inizialmente è stato adattato per l&#39;uso in C. capitata. Questi primi esperimenti autorizzati medfly trasformazione della linea germinale in base all&#39;elemento trasponibili Minos 11. Successivamente, il sistema originale è stato modificato 14 utilizzando altri approcci basati trasposoni. Questo è il caso del piggyBac dal Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Il protocollo è stato poi ulteriormente ottimizzato e questo ha permesso la trasformazione di altre specie tephritid 16-21 e anche di molti altri Ditteri 22-31. Tutti questi sistemi si basano sull&#39;impiego di un tipico / helper sistema plasmidico trasformazione binaria vettoriale: artificiale, Transpo difettosofigli contenenti geni desiderati vengono assemblati in DNA plasmidico e integrato nel genoma dell&#39;insetto fornendo l&#39;enzima trasposasi 32. Un certo numero di linee medfly transgenici sono stati generati, con molteplici funzioni, tra cui i ceppi che trasportano un condizionale gene dominante letale che induce letalità, ceppi produttori di soli uomini prole e quindi non richiedono strategie di sessaggio aggiuntivi, e ceppi con sperma fluorescente, che può migliorare la precisione della fase di monitoraggio SIT 33-37. Anche se il rilascio in natura di organismi transgenici è verificato nei test pilota contro le zanzare solo 38,39, almeno una società sta valutando una serie di ceppi medfly transgenici per il loro utilizzo in campo 40. Embrione microiniezione può anche favorire lo sviluppo di nuovi strumenti di genoma-editing, come la trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens), raggruppati regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR proteina associata 9 nucleasi (Cas9) e endonucleasi homing geni (HEGs), che permetteranno nuovi studi evolutivi e di sviluppo, così come l&#39;espansione degli strumenti biotecnologico disponibile. Genome-editing approcci già permesso la generazione di sistemi gene-drive in zanzare 41, e il loro trasferimento al medfly è imminente. Qui si descrive un protocollo universale per microinjecting acidi nucleici in embrioni medfly che possono essere utili per tutte le applicazioni di cui sopra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 x injection Buffer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Buffer</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5mM KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Construct Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Helper Plasmid</td>
			<td style="width:107px;">DNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dsRNA</td>
			<td style="width:107px;">RNA</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Phenol-Chloroform purified</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Standard Larval food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing Food&#160;</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">1.5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products&#160; dissolved in 50 ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#8217;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Carrot Larval Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">2.5 g Agar, 4 g Sodium Benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86 g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult Food</td>
			<td style="width:107px;">Rearing food</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>yeast extract and sugar (1:10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z692247</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Injection needles&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956000</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloaders</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double slided tape</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Whatman Black circle paper</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:107px;">Generic reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">Diluite 1:2 before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paintbrush (000)</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-153</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microinjector</td>
			<td style="width:107px;">Instrument</td>
			<td style="width:93px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adult cages</td>
			<td style="width:107px;">Generic tool</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halocarbon oil 700</td>
			<td style="width:107px;">Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8898</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ceratitis capitata</td>
			<td style="width:107px;">Animal</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:257px;">The strain used is ISPRA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Ditteri: Tephritidae) è una specie di parassiti con altissima rilevanza agricola. Ciò è dovuto al suo comportamento riproduttivo: le femmine danneggiare la superficie esterna di frutta e verdura, quando depongono le uova e le larve si nutrono schiuse sulla loro polpa. Selvaggio C. popolazioni capitata sono tradizionalmente controllati attraverso insetticidi e / o approcci eco-friendly, il maggior successo è la tecnica sterile Insect (SIT). Il SIT deduce mass-allevamento, sterilizzazione radiometrica e abilitazione campo di maschi che mantengono la loro capacità di accoppiarsi, ma non sono in grado di generare progenie fertile. L&#39;avvento e la conseguente rapido sviluppo di strumenti biotecnologici, insieme con la disponibilità della sequenza del genoma medfly, ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della biologia di questa specie. Questo ha favorito la proliferazione di nuove strategie per la manipolazione del genoma, che can essere applicata al controllo della popolazione. In questo contesto, embrione microiniezione gioca un duplice ruolo nell&#39;espansione degli strumenti per il controllo della mosca della frutta. La capacità di interferire con la funzione dei geni che regolano i processi biologici chiave, infatti, amplia la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base invasività medfly. Inoltre, la capacità di raggiungere la trasformazione della linea germinale facilita la produzione di più ceppi transgenici che possono essere testati per le future applicazioni sul campo in contesti SIT romanzo. In effetti, la manipolazione genetica può essere utilizzata per conferire tratti desiderabili che possono, ad esempio, essere utilizzati per monitorare le prestazioni maschio sterile nel campo, o che può provocare nei primi mesi di vita letalità stadi. Qui si descrive un metodo per microinject acidi nucleici in embrioni medfly per raggiungere questi due obiettivi principali.

Qui riportiamo due applicazioni di microiniezione dell&#39;embrione diretto alla caratterizzazione funzionale di un gene di interesse (caso 1), e alla generazione di ceppi transgenici (caso 2), rispettivamente. Consegna di dsRNA in embrioni di svelare la funzione del gene. Il gene innexin-5 codifica una gap-junction che, negli insetti, si esprime in partico...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata at JoVE.com

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K Views.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Video: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to particular habitats and management practices. This article shows how certain terroir signatures can be detected in the berry metabolome and transcriptome of the grapevine cultivar Corvina using multivariate statistical analysis. The method first requires an appropriate sampling plan. In this case study, a specific clone of the Corvina cultivar was selected to minimize genetic differences, and samples were collected from seven vineyards representing three different macro-zones during three different growing seasons. An untargeted LC-MS metabolomics approach is recommended due to its high sensitivity, accompanied by efficient data processing using MZmine software and a metabolite identification strategy based on fragmentation tree analysis. Comprehensive transcriptome analysis can be achieved using microarrays containing probes covering ~99% of all predicted grapevine genes, allowing the simultaneous analysis of all differentially expressed genes in the context of different terroirs. Finally, multivariate data analysis based on projection methods can be used to overcome the strong vintage-specific effect, allowing the metabolomics and transcriptomics data to be integrated and analyzed in detail to identify informative correlations.

This article describes the application of untargeted metabolomics, transcriptomics and multivariate statistical analysis to grape berry transcripts and metabolites in order to gain insight into the terroir concept, i.e., the impact of the environment on berry quality traits.

Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

Ricerca

Genetica

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the others contain 5&#39; monophosphate generated post-transcriptionally (processed transcripts). To discriminate between the two types of transcripts, several strategies have been developed, and most of them depend on presence/absence of 5&#39; triphosphate. However, the triphosphate at primary 5&#39; termini is unstable, and it hinders a clear discrimination of the two types of transcripts. To systematically differentiate and map the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion, we have developed a circular RT-PCR (cRT-PCR)-based strategy by combining cRT-PCR, RNA 5&#39; polyphoshpatase treatment, quantitative RT-PCR (RT-qPCR), and Northern blot. As an improvement, this strategy includes an RNA normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate.
In this protocol, the enriched mitochondrial RNA is pre-treated by RNA 5&#39; polyphosphatase, which converts 5&#39; triphsophate to monophosphate. After circularization and reverse transcription, the two cDNAs derived from 5&#39; polyphosphatase-treated and non-treated RNAs are normalized by maize 26S mature rRNA, which has a processed 5&#39; end and is insensitive to 5&#39; polyphosphatase. After normalization, the primary and processed transcripts are discriminated by comparing cRT-PCR and RT-qPCR products obtained from the treated and non-treated RNAs. The transcript termini are determined by cloning and sequencing of the cRT-PCR products, and then verified by Northern blot.
By using this strategy, most steady-state transcripts in maize mitochondrion have been determined. Due to the complicated transcript pattern of some mitochondrial genes, a few steady-state transcripts were not differentiated and/or mapped, though they were detected in a Northern blot. We are not sure whether this strategy is suitable to discriminate and map the steady-state transcripts in other plant mitochondria or in plastids.

We present a circular RT-PCR-based strategy by combining circular RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5&#39; polyphosphatase-treatment, and Northern blot. This protocol includes a normalization step to minimize the influence of unstable 5&#39; triphosphate, and it is suitable for discriminating and mapping the primary and processed transcripts stably accumulated in maize mitochondrion.

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CrispR-Cas9-Mediato Genome Editing nel Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video