Die Autoren möchten die Finanzierung anzuerkennen aus Japan Science and Technology Agency Exploratory Research für Advanced Technology (JST-ERATO), die Neue Energie und Industrial Technology Development Organization (NEDO) und Cross-Minister Strategic Innovation Promotion Program (SIP), Japan .

1. Herstellung von Peptidbasierte Formulierungen <ol><li> Vorbereitung Stammlösungen von jedem Peptid , wie folgt: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml oder 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) und (BP100) 2 K 8 (70 &amp; mgr; M). Wiegen Sie die erforderliche Menge eines jeden Peptids in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und autoklavierten Reinstwasser, um das Peptid aufzulösen. Gut mischen durch wiederholtes Pipettieren, bis eine klare Lösung erhalten wird. </li><li> Amplifizieren, und die Plasmid-DNA (pDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und doppelsträngige RNA (dsRNA) nach Standardmethoden Molekular reinigen. In 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Stammlösungen mit einer Konzentration von 1 mg / ml (pDNA und dsDNA) oder 400 nM (dsRNA) zu machen. </li><li> Bereiten Sie die Protein - Stammlösung mit einer Konzentration von 7 uM, die durch Lösen von 1 mg des Proteins (z. B., Alkohol - Dehydrogenase, ADH) Pulver in 1 ml Natriumcarbonat - Lösung (0,1 M, pH 9). Beschriften Sie das Protein mit fluorescent Sonden wie Rhodamin B (RhB) Standardprotokollen nach mikroskopische Visualisierung der in die Zellen geliefert Protein zu ermöglichen. </li><li> Kombinieren der jeweiligen Komponenten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Für Peptid-pDNA Formulierungen in das Zytoplasma Targeting, fügen 6,4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 773,6 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie das pDNA Konstrukt , das für Kernexpression (P35S-RLuc-tnos, Tabelle 1). </li><li> Für Peptid-pDNA Formulierungen die Mitochondrien - Targeting, fügen 6,6 ul Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren und dann 2,4 ul BP100 (1 mg / ml) hinzufügen. Lassen Sie die Mischung für 15 min bei 25 zur Stabilisierung6; C für weitere 15 min. Hinzufügen 771 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie die pDNA - Konstrukt für mitochondriale Expression entworfen (pDONR-cox2: Rluc, Tabelle 1). </li><li> Für Peptid-dsDNA Formulierungen, fügen 5,1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) auf 8 ul dsDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 786,9 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. </li><li> Für Peptid-dsRNA Formulierungen, fügen Sie 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) zu 50 ul dsRNA (400 nM) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser, die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. </li><li> Für Peptid-Protein - Formulierungen, fügen Sie 16 ul (BP100) 2 K 8 (70 &amp; mgr; M) bis 16 &amp; mgr; l von ADH (7 uM) und mischengut durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 768 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. </li></ol></li><li> Erlauben die Formulierungen für 15 min bei 25 ° C zu stabilisieren. </li></ol> 2. Charakterisierung von Peptid-basierte Formulierungen <ol><li> Bringen Sie jede Lösung (800 ul) in eine Küvette für dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse. Bestimmen den hydrodynamischen Durchmesser und Polydispersitätsindex von gebildeten Komplexe mit einem zeta Nanosizer, mit einem 633 nm He-Ne-Laser bei 25 ° C mit einem Backscatter-Erfassungswinkel von 173 °. </li><li> Folgende Größenmessungen, übertragen jede Lösung (800 ul) in eine gefaltete Kapillarzelle zum Zeta-Potential-Messungen an Standardparameter der Dielektrizitätskonstante, Brechungsindex und der Viskosität von Wasser bei 25 ° C. </li><li> Beobachten eines kleinen Volumens von komplexen Lösung für DLS-Analyse verwendet, durch Rasterkraftmikroskopie (AFM). Kaution 10 ul-Komplex-Lösung auf die frisch freigelegten gespaltenen Oberfläche eines Glimmerplättchen und lassen Sie die Glimmer trocken über Nacht in einer bedeckten Petrischale aus Kunststoff an der Luft. </li><li> Erwerben Sie ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 ° C , um einen Silizium - Cantilever mit mit einer Federkonstante von 1,3 N / m in Tapping - Modus 27,28. </li></ol> 3. Einschleusung von Pflanzenblätter <ol><li> Verwenden Sie 3 Wochen alten Boden gewachsenen Pflanzen (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 oder Pappel 26). Transfizieren mindestens 3 Blätter als dreifacher Ausführung für die Quantifizierung von Genexpression oder Proteinabgabe zu dienen. </li><li> Laden einer 1 ml Kunststoffspritze nadel mit 100 ul komplexe Lösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie die Spitze der Spritze auf der abaxial Oberfläche des Blattes. </li><li> Drücken Sie die Spritzenspitze gegen das Blatt leicht und drücken Sie den Spritzenkolben langsam, während ein Gegendruck mit dem i ausübtndex Finger eines Latex-Handschuh von der gegenüberliegenden Seite. Erfolgreiche Infiltration kann als die Ausbreitung eines mit Wasser getränkten Bereich in dem Blatt zu beobachten. Beschriften Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung. </li><li> Inkubieren der transfizierten Blatt für optimierte Dauern folgende Infiltration mit Peptid-pDNA (12 h), Peptid-dsDNA (12 h), Peptid-dsRNA (9-48 h) und Peptid-Protein (6 h) Formulierungen unter den folgenden Bedingungen: 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 22 ° C für A. thaliana und Pappel oder 24 - Stunden - Dauerlicht bei 29 ° C für N. benthamiana. </li></ol> 4. Beurteilung der Transfektionseffizienz <ol><li> Excise die ganze transfizierten Blatt von kleineren Anlagen (z. B. A. thaliana) oder eine 1 cm 2 Abschnitt des infiltrierten Bereich für größere Anlagen (z. B. N. benthamiana). </li><li> Für Experimente Transfektion Renilla - Luciferase (Rluc) Reportervektor verwendet, bestimmen die transfection Effizienz ein Rluc Assay Kit quantitativ verwenden. <ol><li> Legen Sie jedes Blatt herausgeschnitten oder Blattabschnitt in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l 1 × Rluc Assay Lysepuffer pro Röhrchen. Auf die gleiche Weise, bereiten Lysaten von nicht transfizierten Kontrollblätter (dreifach). </li><li> Grind das Blatt eine Homogenisierung zerstoßen und Inkubation des resultierenden Lysat bei 25 ° C für 6 bis 10 Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.470 × g in einer Mikro für 1 min. Transfer 20 &amp; mgr; l des geklärten Lysat auf eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, und verwenden die verbleibende Volumen für die Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration eines BCA Protein Assay Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> 100 l 1 × Rluc Assay Substrat (verdünnt, um die Rluc Testpuffer verwendet wird) in den Brunnen und mischen durch langsame Pipettieren. Legen Sie die Mikrotiterplatte in einem Multimode-Mikroplatten-Reader und initiieren Messung. </li><li> Ziehen Sie den Hintergrund Lumineszenz (Mittelwert der keinn-transfizierten dreifacher Ausfertigung) von jeder Lumineszenz der Versuchsprobe. Berechnen des Verhältnisses von Photolumineszenz (relative light units, RLU) zu der Menge an Protein (mg). </li></ol></li><li> Für Transfektionsexperimente grün fluoreszierende Protein (GFP) Reportervektor mit oder fluoreszenzmarkierten Protein (z. B. ADH-RhB), beobachten die Fluoreszenz eines konfokalen Laser - Scanning - Mikroskop. <ol><li> Schneiden Sie die Ränder eines ganzen Blattes (die Entfernung von Lufträumen zu unterstützen), während eine geschnittene Blatt kann verwendet werden, wie es ist. Entfernen Sie den Kolben aus einer 10-ml-Spritze und legen jeweils herausgeschnitten Blatt oder Blattabschnitt in der Spritze. </li><li> Setzen Sie den Kolben und drücken Sie sie sanft auf den Boden der Spritze ohne das Blatt zerdrücken. Zeichnen Sie Wasser in die Spritze, bis es etwa die Hälfte gefüllt ist. </li><li> Richten Sie die Spritze nach oben und drücken in der Kolben Luft aus der Spritze durch die Spitze zu entfernen. Decken Sie die Spitze der Spritze und ziehen Sie den Kolben langsam nach unten Luft aus dem lea zu vertreibenf. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis das Blatt durchscheinend erscheint. </li><li> Bedecken die Oberfläche eines Objektträgers mit einem Klebeband. Schneiden Sie eine quadratische Fläche auf dem Band groß genug, um die Blattprobe unter Verwendung einer Klinge aufzunehmen, und ziehen Sie das Quadrat Stück Klebeband mit einer Pinzette aus einer Probenkammer zu schaffen. Das Band wird als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas dienen. </li><li> Legen Sie das Blatt in der Kammer mit dem abaxial Oberfläche nach oben zeigt und füllen die verbleibende Kammerbereich mit Wasser. Dichten Sie das Blatt in der Kammer mit einem Deckglas und sichern Sie die Kanten des Deckglases mit Klebeband. </li><li> Überprüfen Sie die Blattprobe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40X-Objektiv oder ein 63X Wasserimmersionsobjektiv verwendet wird. GFP oder RhB Fluoreszenz kann bei Anregungswellenlängen von 488 nm bzw. 555 nm bzw. sichtbar gemacht werden. </li></ol></li></ol>

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	<li>Altman, A., Hasegawa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , (2011).</li><li>Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+farming:+systems+and+products.">Plant molecular farming: systems and products.</a> Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-velocity+microprojectiles+for+delivering+nucleic+acids+into+living+cells.">High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.</a> Nature. 327, 70-73 (1987).</li><li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation.">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).</li><li>Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transformation+of+plant+protoplasts+with+Ti-plasmid+DNA.">In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA.</a> Nature. 296, 72-74 (1982).</li><li>Birch, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation:+problems+and+strategies+for+practical+application.">Plant transformation: problems and strategies for practical application.</a> Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).</li><li>Newell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+technology.+Developments+and+applications.">Plant transformation technology. Developments and applications.</a> Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).</li><li>Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+gene+transfer+from+transgenic+plants+to+terrestrial+bacteria--a+rare+event?.">Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event?.</a> FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).</li><li>Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+25,+Engineering+peptide-based+carriers+for+drug+and+gene+delivery.">Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery.</a> Engineering in Translational Medicine. , 667-689 (2014).</li><li>Nitta, S., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolymer-based+nanoparticles+for+drug/gene+delivery+and+tissue+engineering.">Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).</li><li>Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(amino+acid)s/polypeptides+as+potential+functional+and+structural+materials.">Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials.</a> Polym. J. 47, 537-545 (2015).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+delivery+systems+of+bioactive+molecules.">Silk-based delivery systems of bioactive molecules.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).</li><li>Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+silk+protein-based+gene+delivery+systems.">Bioengineered silk protein-based gene delivery systems.</a> Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).</li><li>Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+nanocarrier+for+macromolecule+delivery+in+living+cells.">Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells.</a> IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).</li><li>Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+peptide+Bp100+as+a+cell-penetrating+tool+for+the+chemical+engineering+of+actin+filaments+within+living+plant+cells.">Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells.</a> ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).</li><li>Numata, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+gene+carriers+with+cell+membrane+destabilizing+peptides.">Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides.</a> Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).</li><li>Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+mediated+by+recombinant+silk+proteins+containing+cationic+and+cell+binding+motifs.">Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs.</a> J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).</li><li>Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silk-based+nanocomplexes+with+tumor-homing+peptides+for+tumor-specific+gene+delivery.">Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery.</a> Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).</li><li>Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+silk-based+gene+carriers+for+tumor+cell-specific+delivery.">Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery.</a> Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).</li><li>Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+introduction+into+the+mitochondria+of+Arabidopsis+thaliana+via+peptide-based+carriers.">Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers.</a> Sci. Rep. 5, 7751 (2015).</li><li>Numata, K., Yoshizumi, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+transformation+method.">Plant transformation method.</a> Patent. , (2015).</li><li>Ng, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+in+intact+plants+via+fusion+peptides.">Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides.</a> PLoS ONE. 11, e0154081 (2016).</li><li>Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+gene+delivery+into+plant+cells+using+designed+peptide+carriers.">Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers.</a> Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).</li><li>Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+introduction+into+intact+plants+using+peptide-DNA+complexes.">Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes.</a> Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).</li><li>Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+gene+silencing+in+plants+via+synthetic+dsRNA+and+carrier+peptide.">Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+degradation+processes+of+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric+acid]+single+crystals+revealed+by+atomic+force+microscopy:+effects+of+molecular+weight+and+second-monomer+composition+on+erosion+rates.">Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates.</a> Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).</li><li>Numata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biopolyester+depolymerase+on+silicon+wafer+and+poly[(R)-3-hydroxybutyric+acid]+single+crystal+revealed+by+real-time+AFM.">Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM.</a> Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).</li><li>Kawai, S., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+procedure+for+DNA+transfection+with+polycation+and+dimethyl+sulfoxide.">New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).</li><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+transfection+by+physical+concentration+of+DNA+at+the+cell+surface.">Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface.</a> Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).</li><li>Boynton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+transformation+in+Chlamydomonas+with+high+velocity+microprojectiles.">Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles.</a> Science. 240, 1534-1538 (1988).</li><li>Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastid+transformation.">Plastid transformation.</a> Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).</li><li>Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transformation+of+plastids+in+higher+plants.">Stable transformation of plastids in higher plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).</li><li>Liu, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+plant+mutants+with+large+genomic+DNA+fragments+by+a+transformation-competent+artificial+chromosome+vector+accelerates+positional+cloning.">Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).</li><li>Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shorter+T-DNA+or+additional+virulence+genes+improve+Agrobactrium-mediated+transformation.">Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation.</a> Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritischen Schritte in dem Protokoll, die empirisch diskutiert wurden identifiziert. Durch die Spritze Infiltration, die Peptid-basierten Formulierungen werden in die Lufträume im Inneren der Pflanze Blatt durch die Spaltöffnungen eingeführt. Um eine maximale Aufnahme der Lösung zu gewährleisten, sollte der Infiltrationsverfahren durchgeführt werden , wenn die Pflanzen unter Bedingungen, die zur Öffnung der Stomata dh förderlich sind., Versehen mit ausreichend Wasser und während der Lichtperiode. Im Hinblick auf die Herstellung von Transfektionskomplexen für Formulierungen, die eine Kombination von zwei Peptiden (für mitochondrialen DNA-Zielliefer) umfassen, wobei die Reihenfolge für die Zugabe der einzelnen Komponenten ist entscheidend und nicht invertiert werden sollte. Es gibt viele plausible Änderungen an dem Verfahren. Eine andere Möglichkeit für das Eindringen von Pflanzenzellen ist die Verwendung von Vakuuminfiltration, die die komplexe Lösung zu ganzen Pflanzen einzuführen ist in der Lage und / oder Teilgeweben, einschließlichApikalmeristemen. Für diese alternativen Verfahren werden Sämlinge in der Transfektionslösung eingetaucht, und basierend auf dem Druck, der durch das Vakuum erzeugt wird, die Peptid-Fracht Komplexe werden durch die Stomata und in die Pflanzenzellen (Yoshizumi, T., nicht veröffentlichte Daten) gezwungen. Transient Genexpression, basierend auf Studien an tierischen Zellen wurde mit höheren DNA - Konzentrationen von 29 bis 31 zu erhöhen gezeigt. Es ist wichtig zu beachten , dass das Verhältnis von Peptid zu DNA , die die biophysikalischen Eigenschaften beeinflusst (Größe, Oberflächenladung) von Komplexen (Abbildung 4), die Transfektionseffizienz beeinflusst; Daher muss das optimale Verhältnis auch bei erhöhter DNA-Konzentration gehalten werden. Einer der Hauptvorteile in Peptide als ein Gen / Protein-Zusteller ist, dass seine Sequenz zum Einstellen zugänglich ist, eine gewünschte Funktion zu erfüllen. Zum Beispiel beschrieb der mitochondrialen-Targeting-Domäne des Trägerpeptid in diesem Gestüty kann mit Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Sequenzen für die Lokalisierung zu dieser Organellen ersetzt werden. Während Chloroplast - Transformation in mehrere Anlagen möglich ist , unter Verwendung Biolistik 32-34 weder das Agrobacterium noch der biolistischen Methode könnte Gene in die Mitochondrien oder anderen Organellen neben dem Kern (Tabelle 2) einzuführen. Es sind keine starren Wirtsbereich Einschränkungen für Peptid-basierende Transfektion, im Gegensatz zu dem Agrobacterium basierende Verfahren (Tabelle 2). Bisher Formulierungen für die Transfektion von A. thaliana, N. benthamiana und Pappel optimiert wurden (Tabelle 1), aber das Verfahren kann auch für Nicotiana tabacum verwendet werden, Tomatenzüchtung Micro-Tom, Reis (basierend auf Vorversuchen) und andere mono- und dikotyle Pflanzen. Bisher gibt es keine bekannte Beschränkung in Transgen Größe, wenn Peptide ein verwendet werdens Transfektionsvektoren. Im Gegensatz dazu wurden große DNA - Moleküle wurden für die Transgene von etwa 200 kb wurde 37-39 berichtet die Transformationseffizienz von Agrobacterium -vermittelte Methoden 35,36 und eine obere Größenbegrenzung zu reduzieren gefunden. Verwendung von Biolistik, andererseits, große DNA - Fragmente können 38 während der Herstellung oder Lieferung in Pflanzen geschert werden. Obwohl keine obere Grenze hat für biolistische Transformation bisher physikalische Zwänge wurden , um die Größe der DNA zu beschränken gefunden , die übertragen werden kann , um viel weniger als 150 kb 40 bestimmt. Die Hauptvorteile der Verwendung des Peptid-basierten System für den Gentransfer im Vergleich zu bestehenden Ansätze entweder Agrobacterium oder Mikroprojektilbeschuss verwendet wird , oben erläutert, sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Einige Einschränkungen gibt es für dieses Verfahren, wie es steht. Erstens gezielte Abgabe von pDNA auf spezifische Organellen, wie dem mitochondria, wurde durch eine einfache Kombination von DNA-bindenden, zellpenetrierenden und Organell-Transitsequenzen möglich erwiesen, obwohl der Wirkungsgrad niedrig war. Transgen-Expression konnte festgestellt werden, durch konfokale Mikroskopie, nur in einer kleinen Population von Mitochondrien in den Zellen. Daher sind weitere Modifikationen notwendig: (i) Förderung der Translokation von mehr Komplexe durch die Zelle / Organell-Membran, und (ii) zur Expression der Dissoziation und die Übertragung von pDNA aus dem Trägerpeptid in das Ziel Organell verbessern. Zweitens wurde die transiente Expression von exogener Reportergene unter Verwendung dieses DNA-Abgabesystem, erfolgreich in den zytosolischen und mitochondrialen Kompartiment von Zellen erreicht. Stabile Inkorporation und die Expression der eingeführten Gene in der Pflanze Kern / Organell-Genoms noch nicht jedoch festgestellt worden ist, aufgrund des Fehlens von geeigneten Selektionsstrategien. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es Bereiche für Verbesserungen oder weitere development, das Peptid abgeleitete Strategie beschrieben hier bleibt eine einfache und vielseitige Technik, die den Weg für die Lieferung verschiedener Ladungen in verschiedene Pflanzenarten geebnet hat.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2358">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(KH)9-BP100 peptide</td>
			<td style="width:355px;">Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH- 
			KHKKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">(BP100)2-K8 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- 
			KYLKKKKKKKK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP100 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: KKLFKKILKYL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cytcox-(KH)9 peptide</td>
			<td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- 
			KHKHKHKHKHKH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP5 siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHS siRNA</td>
			<td style="width:355px;">N/A</td>
			<td style="width:315px;">N/A</td>
			<td style="width:1235px;">For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL and 10 mL Plastic Syringes</td>
			<td>TERUMO Corporation</td>
			<td>SS-01T, SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>151212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">96-Well Flat-Bottom Plate</td>
			<td>Asahi Glass Co., Ltd.</td>
			<td>3860-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Adhesive Tape</td>
			<td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>No. 835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Alcohol Dehydrogenase</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">A-7011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Seiko Instruments Inc.</td>
			<td>SPI3800, SPA 300HV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>AFM5300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cantilever</td>
			<td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td>
			<td>K-A102001593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cork Borer</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td>Z165220</td>
			<td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coverslip</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">C02261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cuvette</td>
			<td style="width:355px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:315px;">759116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Folded Capillary Cell</td>
			<td style="width:355px;">Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forceps</td>
			<td style="width:355px;">Shimizu Akira Inc.</td>
			<td style="width:315px;">Stainless pincet 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Homogenization Pestle</td>
			<td>Ieda Trading Corp.</td>
			<td style="width:315px;">9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mica</td>
			<td>Nisshin EM Co., Ltd.</td>
			<td style="width:315px;">LC23Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td style="width:315px;">BKA46472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices Corporation</td>
			<td style="width:315px;">Spectra MAX M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Microscope Slide</td>
			<td style="width:355px;">Matsunami Glass Ind., Ltd.</td>
			<td>S011120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette</td>
			<td style="width:355px;">Eppendorf Research&#174; plus</td>
			<td>3120000909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Pipette Tips</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Plastic Petri Dish</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>1-7484-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Renilla Luciferase Assay Kit</td>
			<td>Promega corporation</td>
			<td>E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Rhodamine B Isothiocyanate</td>
			<td style="width:355px;">Sigma-Aldrich Co., LLC.</td>
			<td style="width:315px;">283924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNase-Free Water</td>
			<td style="width:355px;">Qiagen</td>
			<td style="width:315px;">129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>199-01585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Surgical Blade and Handle</td>
			<td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td>
			<td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Syringe Tip Cap</td>
			<td>Musashi Engineering Inc.</td>
			<td>NC-3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Weighing Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Zeta Potentiometer</td>
			<td>Malvern Instruments, Ltd.</td>
			<td>Zetasizer Nano-ZS</td>
			<td style="width:1235px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Ein Array von Nukleinsäure und Protein Ladungen wurden erfolgreich in verschiedene Pflanzen eingebracht, die entworfen Peptide als Zuführungsvektoren verwendet wird. Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen kationischen Peptiden und negativ geladenen Ladungen führte zur Bildung von Transfektionskomplexen , die direkt in die Pflanzen infiltriert werden können Blätter eine nadellose Spritze (Abbildung 1). Optimierte Formulierungen (empirisch in diesen Studien bestimmt 21,23-26) für die Transfektion von Pflanzenzellen sind in Tabelle 1 aufgeführt, wobei jeder Typ der Vielzahl von gelieferten Ladungen (pDNA, dsDNA, dsRNA und Protein) dargestellt wird. Die mittleren Durchmesser aller peptidbasierten Formulierungen wurden in ungefähren Bereich von 150 bis 300 nm. Basierend auf DLS-Analyse zeigten alle Formulierungen relativ geringe Größe Polydispersitäten, was darauf hinweist, dass die gebildeten Peptid-Fracht-Aggregate eine einheitliche Größenverteilung aufweisen. Die MorphologienKomplexe zwischen Peptid und pDNA (2A) oder Protein (2B), auf Glimmer wurden durch AFM abgebildet. Homogene globuläre Komplexe wurden mit den Daten von DLS-Messungen für beide Peptid-pDNA und Peptid-Protein-Kombinationen in Übereinstimmung beobachtet. In Bezug auf das Zetapotential von Komplexen (Tabelle 1), pDNA- und dsDNA abgeleitete Komplexe hatten negative Nettooberflächenladungen während dsRNA-basierte Komplexe eine nahezu neutrale Oberflächenladung hatte. Peptid-Protein-Komplexe, auf der anderen Seite, wurden positiv geladen. Die Wirkungsgrade von Peptid-pDNA und Peptid-dsDNA Formulierungen in der Transfektion von A. thaliana oder N. benthamiana als Modellpflanze Systeme Vermittlung wurden als qualitativ quantitativ als auch bewertet. Rluc Genexpression Assay für die Quantifizierung von Genexpressionsniveaus (Tabelle 1), daher für dieses Experiment verwendet wurde , oder pDNAdsDNA Rluc-Gen kodiert, müssen zur Komplexierung mit den jeweiligen Träger Peptide verwendet werden. Mit dem (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung kann nuklear gezielte Abgabe und Expression von pDNA erreicht werden, nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden mit einem geschätzten RLU / mg - Wert von etwa 1 × 10 5. Für mitochondriale-zielgerichtete Abgabe und Expression von pDNA, eine Kombination von Peptiden, Cytcox- (KH) 9 und BP100, wird für die Komplexbildung erforderlich ist . Mit der gleichen optimierten Inkubationszeit von 12 Stunden jedoch eine viel niedrigere Niveau der Transfektion (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erreicht. Inzwischen ähnliche Inkubationszeit (12 h) und Gen - Expressionsniveau (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erforderlich / aufgezeichnet für dsDNA-Komplexen, auch die (KH) 9 -BP100 Peptid formuliert werden. Qualitative Bewertung der Genexpression wurden durch direkte mikroskopische Beobachtung der Blätter mit Komplexe prepar behandelt durchgeführted mit pDNA oder dsDNA kodiert, das GFP-Reporter-Gen. In Zellen , die mit Nicht-Zielpeptid-pDNA - Komplexen transfiziert, diffundieren grüne Fluoreszenz mit entsprechenden GFP - Expression deutlich beobachtet wurde und die in das Cytosol (3A) zu lokalisieren. Deutliche Unterschiede in der Lokalisation Muster der GFP-Fluoreszenz waren in Zellen offensichtlich mitochondrialen gezielte Peptid-pDNA Komplexe infiltriert mit. Hier punctate grüne Fluoreszenz , die mit der mitochondrialen stain colokalisieren sichtbar war, was die Spezifität der Genexpression ausschließlich in der mitochondrialen Kompartiment von Zellen (3B) bestätigt. Im Fall von Peptid-Protein-Formulierungen, Konjugation des Proteins Ladung (ADH) mit einem Fluorophor (RhB) wird die Visualisierung des gelieferten Protein im intrazellulären Kompartiment ermöglichen. Innerhalb einer kurzen Inkubationszeit von 6 Stunden, ADH-RhB Protein (blau) wurde festgestellt, überall verteilt werdendas Cytosol und Vakuole von infiltrierten Zellen (3C). unter Verwendung von Peptid-dsRNA Formulierungen Inzwischen konnte eine schnelle und effiziente Herunterregulation der Genexpression in verschiedenen Anlagen durchgeführt werden. Im ersten Experiment, A. thaliana Blatt wurde mit dem Peptid-dsRNA infiltriert Komplexe der Chalkon - Synthase - Gen (CHS) verantwortlich für Anthocyan (rotes Pigment) Biosynthese unter Dürrebedingungen zum Schweigen zu bringen. Der Unterschied im Auftreten von A. thaliana Blätter unter normalen (3D, a) und Trockenheit (3D, b) ein einfaches Mittel vorgesehen CHS zu bewerten Silencing die optimierte Peptid-dsRNA - Formulierung unter Verwendung von (Pfeil 1 zeigt die infiltriert region). In dem zweiten Experiment wurden Peptid-dsRNA - Komplexe wurden in den Blättern von transgenen A. thaliana infiltriert gelb fluoreszierendes Protein exprimieren (YFP). Eine scheinbare Reduktion der YFP-Expression konnte in den epidermalen Zellen 9 h p zu sehenOst-Transfektion (3E, F). Die Wirksamkeit der Formulierung in Herunterregulierung der Genexpression in einem anderen Anlagensystem (Pappel, 12 h nach der Transfektion) wurde ebenfalls nachgewiesen (Abbildung 3G, H). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Abbildung 1: Peptid-basierte Formulierungen für die Lieferung von Nukleinsäure und Protein Cargoes in lebenden Pflanzen. Die entworfenen Träger Peptide bestehen aus Polykationen zu Zelle eindringende oder organellären Transitsequenzen konjugiert. Polykationen ermöglichen Bindung und / oder Kondensation von negativ geladenen Ladungen sowie Flucht aus dem endosomalen Kompartiment in Zellen nach Verinnerlichung. Lieferung von Ladungen in die Zellen und anschließend auf spezifische Organellen wird durch Zelle eindringende Sequenzen und Organell-Transitsequenzen vermittelt sind. Verschiedene Ladungen, die successfu sein könntelly in die Anlage geliefert umfassen Nukleinsäuren wie pDNA, dsDNA und dsRNA sowie Modellproteine ​​wie Rinderserumalbumin (BSA), Alkoholdehydrogenase (ADH) und Citrin (eine Variante von gelb fluoreszierendes Protein). Bioaktive Moleküle können Transfektionskomplexe mit Peptidkonjugaten über elektrostatische Wechselwirkungen zu bilden, die in Pflanzen eingeführt werden Blätter mit einer Spritze Infiltration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Abbildung 2: Morphologien der Peptid-basierte Formulierungen. (A) AFM Amplitudenbild von (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung bei N / P 0,5. (B) AFM Höhenbild von (BP100) 2 K 8 / ADH Formulierung bei Molaren Ratio 10. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die mikroskopische Beurteilung von Transfektionseffizienzen Peptid-basierte Formulierungen unter Verwendung optimiert. (A) Cytosolic GFP - Expression (grün), deutlich von Chloroplasten - Autofluoreszenz (rot), wurde in den Schwammparenchym Zellen von A. thaliana beobachtet Blätter infiltriert mit (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5; 12 h ). (B) die GFP - Expression (grün) wurde in den Mitochondrien (rot) in den epidermalen Zellen von A. thaliana leaf infiltriert mit Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5 für jede peptid detektierte; 12 h). Vergrößerte Bilder von Mitochondrien mit GFP-Expression sind im äußersten rechten Bereich angezeigt. (C) Lieferung von ADH-RhB (blau) in die Schwammparenchym Zellen von A. thaliana Blätter durch (BP100) 2 K 8 in einem Peptid / Protein - Molverhältnis von 10, visualisiert 6 Stunden nach der Infiltration vermittelt. (D) A. thaliana leaf vor (a) und nach (b) Behandlung mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA - Formulierung (Molverhältnis 2; 48 h), die bei der Unterdrückung der Anthocyan - Biosynthesewegs geführt. Eine ähnliche Formulierung GFP5 dsRNA enthielt , wurde in das Blatt als negative Kontrolle (c) infiltriert. Pfeile 1 und 3 zeigen den infiltrierten Bereich, während Pfeile 2 und 4, um die nicht-infiltrierten Bereich innerhalb des Blattes an. (E) A. thaliana verlässt folgende Infiltration gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (F) , um die verminderte YFP - Fluoreszenz zum Ausdruck mit<html> (KH) 9 -BP100 / dsRNA - Formulierung (Molverhältnis 2; 9 h). (G) Transgenic Pappel Blätter gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (H) die verminderte YFP - Fluoreszenz folgende Infiltration mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA Formulierung exprimieren (Molverhältnis 2; 12 h). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Abbildung 4: Variation in Peptid-zu-DNA (N / P) Verhältnis und die Auswirkung auf die biophysikalischen Eigenschaften von Komplexen. Mit zunehmender Peptid zu DNA-Verhältnis, Peptid-basierten Formulierungen Abnahme der Größe, während deren Zeta-Potentialwerte Übergang von negativ zu positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabelle 1: Charakterisierung und Bewertung verschiedener Peptid-basierte Formulierungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabelle 2: Ein Vergleich von Peptid-basierten und anderen vorhandenen DNA - Delivery - Technologien für Intact Pflanzen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

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Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Aufrufe.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Serie: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Forschung

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

Analyse von Cap-bindende Proteine ​​in menschlichen Zellen zu Physiologische Sauerstoffbedingungen ausgesetzt

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can potentially increase risk of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). Electroencephalography (EEG) and electrocardiography (ECG) are widely used clinical diagnostic tools to monitor for abnormal brain and cardiac rhythms in patients. Here, a technique to simultaneously record video, EEG, and ECG in mice to measure behavior, brain, and cardiac activities, respectively, is described. The technique described herein utilizes a tethered (i.e., wired) recording configuration in which the implanted electrode on the head of the mouse is hard-wired to the recording equipment. Compared to wireless telemetry recording systems, the tethered arrangement possesses several technical advantages such as a greater possible number of channels for recording EEG or other biopotentials; lower electrode costs; and greater frequency bandwidth (i.e., sampling rate) of recordings. The basics of this technique can also be easily modified to accommodate recording other biosignals, such as electromyography (EMG) or plethysmography for assessment of muscle and respiratory activity, respectively. In addition to describing how to perform the EEG-ECG recordings, we also detail methods to quantify the resulting data for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability, which we demonstrate in an example experiment using a mouse with epilepsy due to Kcna1 gene deletion. Video-EEG-ECG monitoring in mouse models of epilepsy or other neurological disease provides a powerful tool to identify dysfunction at the level of the brain, heart, or brain-heart interactions.

Here, we present a protocol to record brain and heart bio signals in mice using simultaneous video, electroencephalography (EEG), and electrocardiography (ECG). We also describe methods to analyze the resulting EEG-ECG recordings for seizures, EEG spectral power, cardiac function, and heart rate variability.

Gleichzeitige Video-EEG-EKG Monitoring Neurocardiac Dysfunktion in Mausmodellen der Epilepsie zu identifizieren

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

Eine Bioinformatik-Pipeline zur genauen und effizienten Analyse der MicroRNA-Transkriptome in Pflanzen

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen