Name: peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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Gli autori vorrebbero riconoscere il finanziamento dal Giappone Scienza e della Tecnologia Agenzia esplorativa di ricerca per la tecnologia avanzata (JST-ERATO), la New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO), e la Croce-ministeriale strategico del programma per la promozione dell&#39;innovazione (SIP), il Giappone .

1. preparazione di formulazioni Peptide-Based <ol><li> Preparare soluzioni di ciascun peptide come segue: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml o 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) e (BP100) 2 K 8 (70 mM). Pesare la quantità necessaria di ciascun peptide in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere acqua ultrapura autoclavato per sciogliere il peptide. Mescolare bene pipettando ripetutamente fino ad ottenere una soluzione limpida. </li><li> Amplifica e purificare il DNA plasmide (pDNA), a doppia elica del DNA (dsDNA) e l&#39;RNA a doppio filamento (dsRNA) secondo metodologie molecolari standard. In provette da 1,5 ml microcentrifuga, fare soluzioni di riserva con una concentrazione di 1 mg / ml (PDNA e dsDNA) o 400 Nm (dsRNA). </li><li> Preparare la soluzione proteica magazzino con una concentrazione di 7 pM, sciogliendo 1 mg di proteina (es., Alcool deidrogenasi, ADH) polvere in 1 ml di soluzione di carbonato di sodio (0,1 M, pH 9). Etichetta la proteina con FLe sonde luorescent come la rodamina B (RhB) secondo protocolli standard per consentire la visualizzazione microscopica della proteina consegnato nelle cellule. </li><li> Unire rispettivi componenti in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. <ol><li> Per le formulazioni peptide-PDNA mira il citoplasma, aggiungere 6,4 ml di (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 20 ml di pDNA (1 mg / ml) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 773,6 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. Utilizzare il costrutto pDNA progettata per l&#39;espressione nucleare (P35S-RLuc-NOS, tabella 1). </li><li> Per le formulazioni peptide-PDNA mira i mitocondri, aggiungere 6,6 ml di Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) a 20 ml di pDNA (1 mg / ml) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C e aggiungere 2,4 ml di BP100 (1 mg / ml). Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 256; C per altri 15 min. Aggiungere 771 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. Utilizzare il costrutto pDNA progettata per l&#39;espressione mitocondriale (pDONR-COX2: rluc, Tabella 1). </li><li> Per le formulazioni peptide-dsDNA, aggiungere 5,1 ml di (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) a 8 ml di dsDNA (1 mg / ml) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 786,9 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. </li><li> Per le formulazioni peptide-dsRNA, aggiungere 50 ml di (KH) 9 -BP100 (800 nm) a 50 ml di dsRNA (400 Nm) e mescolare bene pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 700 ml di acqua RNase-free per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. </li><li> Per le formulazioni peptide-proteina, aggiungere 16 ml di (BP100) 2 K 8 (70 micron) a 16 ml di ADH (7 micron) e mescolareben pipettando. Lasciare il composto si stabilizzi per 15 minuti a 25 ° C. Aggiungere 768 ml di acqua ultrapura autoclavato per diluire la soluzione ad un volume finale di 800 microlitri. </li></ol></li><li> Lasciare le formulazioni di stabilizzarsi per 15 min a 25 ° C. </li></ol> 2. Caratterizzazione di formulazioni Peptide-Based <ol><li> Trasferire ogni soluzione (800 ml) in una vaschetta per dispersione della luce dinamica (DLS) analisi. Determinare il diametro e polidispersità indice idrodinamico di complessi formati con un Nanosizer zeta, utilizzando un 633 nm laser He-Ne a 25 ° C con un angolo di rilevamento retrodiffusione di 173 °. </li><li> misurazioni seguente formato, trasferire ciascuna soluzione (800 ml) in una cella capillare piegato per misure potenziali zeta a parametri di default di costante dielettrica, indice di rifrazione e la viscosità dell&#39;acqua a 25 ° C. </li><li> Osservare un piccolo volume di soluzione complessa, utilizzata per l&#39;analisi DLS, mediante microscopia a forza atomica (AFM). Cassetta 10 ml di soluzione complessa sulla superficie spaccati appena esposto di un foglio di mica e lasciare la mica all&#39;aria secca durante la notte in un piatto di plastica coperto petri. </li><li> Acquisire un&#39;immagine dei complessi in aria a 25 ° C utilizzando un cantilever silicio con costante elastica di 1,3 N / m in modalità 27,28 maschiatura. </li></ol> 3. L&#39;infiltrazione di foglie delle piante <ol><li> Utilizzare 3 settimane vecchi impianti terreno coltivati (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 o pioppo 26). Trasfezione almeno 3 foglie per servire come triplice copia per la quantificazione dell&#39;espressione genica o la consegna di proteine. </li><li> Caricare un 1 ml siringa di plastica senza ago con 100 ml di soluzione completa per la trasfezione di una foglia. Posizionare la punta della siringa sulla superficie abassiale della foglia. </li><li> Premere la punta della siringa contro la foglia leggermente spingere il pistone della siringa lentamente esercitando una contropressione con l&#39;ibarretta NDICE di una mano lattice guantata dal lato opposto. infiltrazione successo può osservare come la diffusione di una zona impregnato d&#39;acqua nella foglia. Etichettare le foglie infiltrati per facilitarne l&#39;identificazione. </li><li> Incubare la foglia transfettate per durate ottimizzati dopo infiltrazione con peptide-pDNA (12 ore), il peptide-dsDNA (12 ore), il peptide-dsRNA (9-48 ore) e peptide-proteina (6 ore) formulazioni nelle seguenti condizioni: 16 luce hr / 8 ore buio a 22 ° C per A. thaliana e pioppo, o 24 ore di luce costante a 29 ° C per N. benthamiana. </li></ol> 4. Valutazione di Transfection efficienza <ol><li> Asportare l&#39;intera foglia transfettate di impianti più piccoli (ad es., A. thaliana), o una sezione di 1 cm 2 della regione infiltrato per impianti più grandi (ad es., N. benthamiana). </li><li> Per gli esperimenti di trasfezione utilizzando Renilla luciferasi (Rluc) giornalista vettore, determinare il transfectioefficienza n quantitativamente utilizzando un kit di Rluc Assay. <ol><li> Mettere ogni foglia escissa o sezione foglia in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 100 ml di 1 × Rluc Assay Lysis Buffer per provetta. Allo stesso modo, preparare lisati di foglie di controllo non transfettate (triplice copia). </li><li> Macinare la foglia con un pestello omogeneizzazione e incubare il lisato risultante a 25 ° C per 6 - 10 ore. </li><li> Centrifugare il lisato a 12.470 × g in una microcentrifuga per 1 min. Trasferimento 20 ml di lisato eliminato ad un bene in una micropiastra a 96 pozzetti, e utilizzare il volume rimanente per la quantificazione della concentrazione totale di proteine ​​utilizzando un kit di test BCA Protein secondo il protocollo del produttore. </li><li> Aggiungere 100 ml di 1 × Rluc Assay Substrate (diluito con il tampone Rluc Assay) nel pozzo e mescolare lentamente pipettaggio. Posizionare la micropiastra in un lettore di micropiastre multimodale e avviare la misurazione. </li><li> Sottrarre la luminescenza di fondo (media del non-trasfettate triplice copia) dalla luminescenza di ogni campione sperimentale. Calcolare il rapporto di fotoluminescenza (unità di luce relativa, RLU) per la quantità di proteina (mg). </li></ol></li><li> Per gli esperimenti di trasfezione utilizzando verde proteina fluorescente (GFP) vettore giornalista o la proteina fluorescente (ad es., ADH-RhB), osservare la fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. <ol><li> Tagliare i bordi di una foglia intera (per facilitare la rimozione di spazi aerei), mentre una foglia sezionata può essere utilizzato così com&#39;è. Rimuovere lo stantuffo di una siringa da 10 ml e posizionare ogni sezione escissa foglia o foglia nella siringa. </li><li> Sostituire il pistone e spingere delicatamente sul fondo della siringa senza schiacciare la foglia. Attingere l&#39;acqua nella siringa fino a circa mezzo pieno. </li><li> Puntare la siringa verso l&#39;alto e spingere lo stantuffo per eliminare l&#39;aria dalla siringa attraverso la punta. Coprire la punta della siringa e tirare lentamente lo stantuffo per espellere l&#39;aria dal leaf. Ripetere questa operazione più volte fino a quando la foglia appare traslucido. </li><li> Coprire la superficie di un vetrino da microscopio con nastro adesivo. Tagliare un&#39;area quadrata sul nastro abbastanza grande per accogliere il campione foglia con una lama, e sbucciare il pezzo quadrato di nastro adesivo fuori con le pinze per creare una camera di campione. Il nastro servirà come distanziale fra il vetrino e coprioggetto. </li><li> Posizionare la foglia nella camera con la superficie abaxial rivolta verso l&#39;alto e riempire la zona di camera rimanente con acqua. Sigillare la foglia all&#39;interno della camera con vetrino coprioggetti e fissare i bordi del coprioggetto con nastro adesivo. </li><li> Esaminare il campione foglia utilizzando il microscopio confocale a scansione laser sotto un obiettivo 40X o di un obiettivo ad immersione 63X acqua. GFP o RhB fluorescenza possono essere visualizzate a lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 488 nm o 555 nm, rispettivamente. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).</li><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+transformation+technology+development+for+commercial+event+generation.">Maize transformation technology development for commercial event generation.</a> Front. Plant Sci. 5, 379 (2014).</li><li>Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+transfers+extremely+long+T-DNAs+by+a+unidirectional+mechanism.">Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism.</a> J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).</li><li>Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L., Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+wheat+(Triticum+spp.).">Transgenic wheat (Triticum spp.).</a> Transgenic Crops I. , 14-36 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Passaggi critici all&#39;interno del protocollo che sono stati identificati empiricamente sono discussi. Con l&#39;infiltrazione della siringa, le formulazioni a base di peptidi vengono introdotti gli spazi aerei all&#39;interno del foglio della pianta attraverso gli stomi. Per garantire l&#39;assimilazione massima della soluzione, il processo di infiltrazione deve essere effettuata quando le piante sono in condizioni favorevoli alla stomi ie., Dotate di acqua sufficiente e durante il periodo di luce. Per quanto riguarda la preparazione di complessi trasfezione, per formulazioni che coinvolgono una combinazione di due peptidi (consegna DNA mitocondriale targeting), la sequenza per aggiunta di ciascun componente è cruciale e non dovrebbe essere invertito. Ci sono molte modifiche plausibili alla procedura. Un&#39;altra opzione per l&#39;infiltrazione di cellule vegetali è l&#39;uso di infiltrazione sotto vuoto, che è in grado di introdurre la soluzione complesso in piante intere e / o tessuti parziali inclusimeristemi apicali. Per questa procedura alternativa, piantine vengono immersi nella soluzione di trasfezione, e in base alla pressione generata dal vuoto, i complessi peptide-carico vengono forzati attraverso gli stomi e nelle cellule vegetali (Yoshizumi, T., dati non pubblicati). Espressione genica transitoria, sulla base di studi utilizzando cellule animali, ha dimostrato di aumentare con più elevate concentrazioni di DNA 29-31. È importante notare che il rapporto di peptide di DNA influisce sulle proprietà biofisiche (dimensioni, carica superficiale) di complessi (figura 4), che influenza l&#39;efficienza di trasfezione; di conseguenza, il rapporto ottimale deve essere mantenuta anche con una maggiore concentrazione di DNA. Uno dei principali vantaggi nell&#39;uso di peptidi come agente di consegna gene / proteina è che la sua sequenza è suscettibile di sintonizzazione ad espletare una funzione desiderata. Ad esempio, il dominio mitocondriale targeting del peptide carrier descritto in questo Study possono essere sostituiti con sequenze cloroplastici o perossisomiali targeting per la localizzazione di questi organelli. Mentre trasformazione cloroplasto è possibile in diverse piante usando biolistics 32-34, né l&#39;Agrobacterium né il metodo biolistic potrebbe introdurre geni nei mitocondri o altri organelli oltre il nucleo (Tabella 2). Non ci sono limitazioni host-gamma rigidi per trasfezione peptide-based, a differenza del metodo basata su Agrobacterium (Tabella 2). Finora, formulazioni per la trasfezione di A. thaliana, N. benthamiana e pioppo sono stati ottimizzati (tabella 1), ma il metodo può essere applicato anche per la Nicotiana tabacum, pomodoro cultivar Micro-Tom, il riso (sulla base di esperimenti preliminari), e altre piante mono e dicotiledoni. Finora, non vi è alcun limite noto dimensioni transgene quando peptidi sono utilizzati unvettori s trasfezione. Al contrario, grandi molecole di DNA sono stati trovati per ridurre l&#39;efficienza di trasformazione di Agrobacterium metodi mediata 35,36, ed un limite superiore per dimensione per transgeni di circa 200 kb è stato segnalato 37-39. Utilizzando biolistics, invece, grandi frammenti di DNA possono essere tranciate durante la preparazione o la consegna in piante 38. Sebbene nessun limite superiore è stato determinato per la trasformazione biolistica finora, vincoli fisici sono stati trovati per limitare le dimensioni di DNA che possono essere trasferiti a molto meno di 150 kb 40. I principali vantaggi di utilizzare il sistema di peptide-based per il trasferimento di geni rispetto agli approcci esistenti che impiegano sia Agrobacterium o bombardamento microproiettili, di cui sopra, sono riassunti nella tabella 2. Esistono alcune limitazioni per questo metodo così com&#39;è. In primo luogo, mirato consegna di pDNA di organelli specifici, come l&#39;mitochondria, è stato dimostrato possibile da una semplice combinazione di sequenze cellule penetrante e organello transito DNA-binding sebbene l&#39;efficienza era basso. espressione del transgene potrebbe essere rilevato, mediante microscopia confocale, solo in una piccola popolazione di mitocondri all&#39;interno delle cellule. Quindi, sono necessarie ulteriori modifiche: (i) migliorare la traslocazione di più complessi attraverso la membrana cellulare / organelli, e (ii) migliorare la dissociazione e trasferimento di pDNA dal peptide carrier nel organello di destinazione per l&#39;espressione. In secondo luogo, con questo sistema di consegna DNA, l&#39;espressione transiente dei geni reporter esogeni stata ottenuta con successo nel compartimento citosolico e mitocondriale di cellule. incorporazione stabile e l&#39;espressione dei geni introdotti nel genoma centrale nucleare / organelli non sono stati ancora stabilito, tuttavia, per l&#39;assenza di opportune strategie di selezione. Pur riconoscendo che ci sono aree di miglioramento o ulteriori dviluppo, la strategia peptide derivato da qui descritto rimane una tecnica semplice e versatile che ha aperto la strada per la consegna dei vari carichi in diversi tipi di piante.

Plant genetic engineering is conventionally used for transferring beneficial traits to plants. In recent years, this technology has been applied to convert plants into bio-factories for the production of pharmaceutically important and commercially valuable proteins, many of which cannot be chemically synthesized and are very costly to produce using animal or microbial systems1. By the introduction of new genes, the plant's own metabolism can be manipulated for the production of various biopharmaceuticals like antibodies, metabolic enzymes, hormones, antigens or vaccine2.
Established gene transfer technologies for plants are the Agrobacterium-mediated delivery3, bombardment with DNA-coated microprojectiles (biolistics)4, and electroporation5 or polyethylene glycol6 treatment of protoplasts. Techniques requiring protoplasts are generally avoided because they are time-consuming, cumbersome and yield inconsistent results7. As a result, virtually all plant modification work at present utilizes either Agrobacterium or microprojectiles for gene transfer. The Agrobacterium method is more extensively used but not applicable to many economically important plant species. Meanwhile, microprojectile bombardment is more versatile due to a broad range of susceptible plants but requires specialized equipment and often causes severe tissue damage. Furthermore, these methods involve either a random (biolistics) or complex (Agrobacterium) delivery mechanism and have variable transformation rates8. Hence, a novel plant transformation technology that is simple yet effective, and applicable to different plant types is required.
Currently, plants are subjected to genetic modification primarily by the delivery of exogenous DNA encoding a desired trait, rather than by direct delivery of a target protein. The higher stability of DNA over proteins is a prime advantage; nevertheless, potential problems associated with DNA delivery include the random insertion of exogenous DNA into the plant genome and unintended transmission of antibiotic resistance genes to pathogenic bacteria via horizontal gene transfer9. For genome-editing purposes, the ability to edit plant genomes without introducing foreign DNA into cells may circumvent regulatory concerns related to genetically modified plants. Thus, an alternative DNA-free strategy for the modification of plants by direct delivery of protein will be able to cater to these needs.
Here we introduce a peptide-based system, originally developed for human gene therapy10-14, for the targeted delivery of exogenous genes or proteins in intact plants. Peptides are able to protect DNA from nuclease degradation and can mediate gene transfer across cell as well as organellar membranes15-17. They also have diverse and tunable properties besides being non-cytotoxic18-20. More importantly, with the use of peptides, genes can be precisely targeted to intracellular organelles such as the mitochondria21 or plastids (chloroplasts)22 for expression-a task not achievable by biolistic or Agrobacterium-mediated transformation. Depending on the cargo type, this new plant modification technology can be exploited to deliver proteins23 and either express (plasmid21,24 or double-stranded DNA25) or down-regulate (double-stranded RNA26) specific genes within the plant, throughout its cytosolic space24-26 or within a specific organellar compartment21. The designed carrier peptides consist of a cationic domain in the form of either polylysine (K8) or polylysine-co-histidine (KH)9 for binding and/or condensation of negatively-charged cargoes, which is conjugated to cell penetrating (BP100 peptide) or mitochondria transit (Cytcox peptide) sequences.

<table><tbody><tr><td>(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt;-BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KHKHKHKHKHKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-K&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYLKKLFKKIL-&lt;br/&gt; KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)&lt;sub&gt;9&lt;/sub&gt; peptide</td><td>Custom-synthesized by RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequence: MLSLRQSIRFFKKHKHKH-&lt;br/&gt; KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS and P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp and pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of cox2 mitochondrial-specific promoter (Ref: Chuah &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-amplified from pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Encodes green fluorescent protein and Renilla luciferase genes, respectively, under the control of CaMV 35S constitutive promoter (Ref: Lakshmanan &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of green fluorescent protein (Ref: Numata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>For RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase (Ref: Numata &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt; Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml and 10 ml Plastic Syringes</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Flat-Bottom Plate</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>No. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>For excision of leaves into 1-cm diameter disks</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>Folded Capillary Cell</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Stainless pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenization Pestle</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&amp;reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri Dish</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B Isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Blade and Handle</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Stainless steel No. 14 (blade), No. 3L (handle)</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Tip Cap</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide-derived method to transport genes and proteins across cellular and organellar barriers in plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Una serie di carichi di acidi nucleici e proteine ​​sono state introdotte con successo in diversi impianti che utilizzano i peptidi studiati come vettori di consegna. Interazioni elettrostatiche tra peptidi cationici e carichi caricati negativamente portato alla formazione di complessi trasfezione che può essere infiltrato direttamente in pianta foglie con una siringa senza ago (Figura 1). Formulazioni ottimizzate (empiricamente determinati in questi studi 21,23-26) per la trasfezione di cellule vegetali sono elencati nella Tabella 1, in cui è rappresentata ciascuna tipologia della vasta gamma di carichi trasportati (pDNA, dsDNA, dsRNA e proteine). I diametri medi di tutte le formulazioni basati su peptidi erano nella gamma approssimativa di 150 - 300 nm. Sulla base di analisi di DLS, tutte le formulazioni visualizzati polidispersità relativamente bassa dimensione, indicando che gli aggregati del peptide-carico formate hanno una distribuzione uniforme dimensioni. Le morfologie dicomplessi tra peptide e pDNA (Figura 2A) o proteine (Figura 2B), in mica, sono state ripreso mediante AFM. Omogenei complessi globulari sono stati osservati per entrambe le combinazioni peptide-PDNA e peptide-proteina, in accordo con i dati derivati ​​dalla misurazione DLS. In termini di potenziale zeta di complessi (Tabella 1), pDNA- e complessi dsDNA-derivati avuto oneri netti di superficie negativa mentre complessi dsRNA basati avevano una carica superficiale quasi neutro. complessi peptide-proteina, d&#39;altra parte, sono state caricate positivamente. Le efficienze di peptide-pDNA e formulazioni del peptide-dsDNA nel mediare la trasfezione di A. thaliana o N. benthamiana come sistemi modello di piante sono stati valutati quantitativamente e qualitativamente. Il saggio di espressione genica RLuc è stato impiegato per la quantificazione dei livelli di espressione genica (Tabella 1), quindi per questo esperimento pDNA odsDNA codificante il gene RLuc deve essere utilizzato per complessazione con i rispettivi peptidi carrier. Utilizzando la (KH) 9 -BP100 / formulazione pDNA, consegna nucleare mirata ed espressione di pDNA può essere realizzato, dopo un periodo di incubazione di 12 ore, con una RLU / Valore mg stimato di circa 1 × 10 5. Per la consegna mitocondriale-mirata ed espressione di pDNA, una combinazione di peptidi, Cytcox- (KH) 9 e BP100, è necessario per la formazione del complesso. Con lo stesso periodo di incubazione ottimizzata di 12 ore, tuttavia, un livello molto più basso di trasfezione (circa 1 × 10 3 RLU / mg) è stato raggiunto. Nel frattempo, è stato richiesto simile periodo di incubazione (12 ore) e il livello di espressione genica (circa 1 × 10 3 RLU / mg) / registrata per i complessi dsDNA-based, anche formulata utilizzando il (KH) 9 -BP100 peptide. valutazioni qualitative di espressione genica sono stati eseguiti da osservazione microscopica diretta di foglie trattati con complessi preparEd usando pDNA o dsDNA codificante il gene reporter GFP. In cellule trasfettate con i complessi non mirati peptide-PDNA, diffondere fluorescenza verde in corrispondenza con l&#39;espressione della GFP è stato chiaramente osservato e ha trovato di localizzare nel citoplasma (Figura 3A). chiare differenze nel modello di localizzazione di fluorescenza GFP sono stati evidenti in cellule infiltrate con complessi peptide-PDNA mitocondriali mirati. Qui, puntiformi fluorescenza verde che colocalize con la macchia mitocondriale era visibile, confermando la specificità dell&#39;espressione genica esclusivamente nel compartimento mitocondriale di cellule (Figura 3B). Nel caso di formulazioni peptide-proteina, coniugazione del carico proteine ​​(ADH) per un fluoroforo (FR) permetterà la visualizzazione della proteina erogata nel compartimento intracellulare. Nel giro di un breve periodo di incubazione di 6 ore, è stato trovato per essere distribuito in tutto ADH-RhB proteine ​​(blu)citoplasma e vacuolo di cellule infiltrate (Figura 3C). Nel frattempo, rapida ed efficace down-regolazione dell&#39;espressione genica potrebbe essere realizzato in diversi impianti che utilizzano formulazioni peptide-dsRNA. Nel primo esperimento, foglia A. thaliana è stato infiltrato con peptide-dsRNA Complessi di mettere a tacere il gene calcone sintasi (CHS) responsabile di antociani (pigmento rosso) biosintesi in condizioni di siccità. La differenza nella comparsa di A. thaliana lascia in condizioni normali (Figura 3D, a) e le condizioni di siccità (Figura 3D, b) ha fornito un facile mezzo per valutare CHS silenziamento utilizzando la formulazione peptide-dsRNA ottimizzata (freccia 1 indica la regione infiltrato). Nel secondo esperimento, complessi peptide-dsRNA sono stati infiltrati nelle foglie di transgenico A. thaliana che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP). Un apparente riduzione della espressione YFP potrebbe essere visto nelle cellule epidermiche 9 ore post-trasfezione (Figura 3E, F). L&#39;efficacia della formulazione nell&#39;espressione genica down-regolazione in un sistema diverso impianto (pioppo, 12 hr dopo la trasfezione) è stato inoltre verificato (figura 3G, H). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Figura 1: Formulazioni Peptide-based per la consegna di acidi nucleici e proteine in carichi piante viventi. I peptidi carrier progettati sono costituiti da policationi coniugati con penetrante cellulare o sequenze di transito organellari. Policationi consentono vincolanti e / o condensa di carichi carica negativa così come fuga dal vano endosomal seguente internalizzazione nelle cellule. Consegna delle merci nelle cellule e, successivamente, a organelli specifici è mediata da sequenze di cellule penetrante e sequenze di transito organellari, rispettivamente. I vari carichi che potrebbero essere successfully erogato nella pianta includono acidi nucleici come pDNA, dsDNA e dsRNA, nonché proteine ​​modello come albumina di siero bovino (BSA), alcol deidrogenasi (ADH) e citrino (una variante della proteina fluorescente gialla). Molecole bioattive sono in grado di formare complessi trasfezione con coniugati peptide tramite interazioni elettrostatiche, che vengono introdotti in foglie delle piante da siringa infiltrazione. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Figura 2: morfologie del Formulazioni Peptide-base. (A) AFM ampiezza immagine di (KH) 9 -BP100 formulazione / pDNA a N / P 0.5. (B) Altezza immagine AFM di (BP100) 2 K 8 / formulazione ADH a molare ratio 10. riprodotto con permesso da fonti pubblicate 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Figura 3: Valutazione della microscopica Transfection efficienze usando formulazioni Peptide-based ottimizzati. (A) espressione citosolico GFP (green), chiaramente distinto da autofluorescenza cloroplasto (rosso), è stato osservato nelle cellule del mesofillo spugnoso di A. thaliana foglie infiltrato con (KH) 9 formulazione -BP100 / pDNA (N / P 0,5; 12 ore ). (B) l&#39;espressione della GFP (verde) è stato rilevato nei mitocondri (rosso) nelle cellule epidermiche di foglia di A. thaliana infiltrati con Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulazione pDNA (N / P 0,5 per ogni peptidee; 12 ore). immagini ingrandite di mitocondri con espressione GFP sono mostrati nel pannello estrema destra. (C) Consegna di ADH-RhB (blu) nelle cellule del mesofillo spugnoso di A. thaliana foglie mediata da (BP100) 2 K 8 in un rapporto molare di peptidi / proteine 10, visualizzate 6 ore post-infiltrazione. (D) foglie A. thaliana prima (a) e dopo (b) il trattamento con (KH) 9 -BP100 / formulazione dsRNA (rapporto molare 2; 48 ore), che ha portato alla soppressione della via di biosintesi delle antocianine. Una formulazione analoga contenente GFP5 dsRNA stato infiltrato nella foglia come controllo negativo (c). Frecce 1 e 3 indicano l&#39;area infiltrati mentre le frecce 2 e 4 indicano la zona non infiltrata all&#39;interno della foglia. (E) A. thaliana lascia esprimere la proteina fluorescente gialla (YFP) e (F) la fluorescenza YFP diminuita dopo infiltrazione con<html> (KH) 9 -BP100 / formulazione dsRNA (rapporto molare 2; 9 ore). (G) foglie di pioppo transgenici che esprimono la proteina fluorescente gialla (YFP) e (H) la diminuzione YFP fluorescenza dopo infiltrazione con (KH) 9 formulazione -BP100 / dsRNA (rapporto molare 2; 12 ore). Riprodotto con il permesso di fonti pubblicate 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Figura 4: Variazione Peptide-to-DNA (N / P) Rapporto e l&#39;effetto sulle proprietà biofisiche di complessi. Con l&#39;aumento del peptide al rapporto di DNA, le formulazioni a base di peptidi diminuiscono in termini di dimensioni, mentre il loro valore di transizione zeta-potenziale da negativo a positivo./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabella 1: caratterizzazione e valutazione di diverse formulazioni del peptide-based. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.</a> <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabella 2: un confronto di peptide-based e altre tecnologie esistenti DNA di consegna per le Piante intatto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.</a>

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Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

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Research

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Genetics

10.5K Views.  RIKEN Center for Sustainable Resource Science. Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

Video: Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ricerca

Ambiente

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Biochimica

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Chimica

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

Una cellula-cellula Macromolecole saggio di trasporto In Planta Utilizzando Bombardamento Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Biologia

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Immunologia e infezioni

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Somministrazione di molecole nelle piante utilizzando un dispositivo di infusione diretta

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

Autore in primo piano: Dispositivo di infusione diretta per la somministrazione di molecole nelle piante  

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Dispositivo di infusione diretta per la consegna di molecole nelle piante

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Co-espressione delle proteine chimeriche fluorescenti Fusion Multiple in modo efficiente nelle piante

Una cellula-cellula Macromolecole saggio di trasporto In Planta Utilizzando Bombardamento Biolistic

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ricombinanti

Ottimizzazione e utilizzo di

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Dispositivo di infusione diretta per la consegna di molecole nelle piante

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine ​​Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

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Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Ottimizzazione e utilizzo di

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys

Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria

Dispositivo di infusione diretta per la consegna di molecole nelle piante

Peptide di derivazione Metodo di Trasporto geni e proteine Attraverso cellulari e barriere organelli in Piante

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ricombinanti