ونود أن نشكر أعضاء المجموعة الأورام أمراض النساء لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وهذا العمل في جزء يدعمها تمويل من الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية، والمجلس الأسترالي للأبحاث، ومعهد السرطان في نيو ساوث ويلز (PST). عضو الكنيست هي المستفيدة من جامعة نيوكاسل الدراسات العليا زمالة أبحاث.

أجريت رعاية الحيوان والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل، وأكد أن قانون نيو ساوث ويلز الحيوان بحوث، نيو ساوث ويلز الحيوان تنظيم البحوث، ورمز الاسترالي لرعاية و استخدام الحيوانات لأغراض علمية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران عن طريق لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان من جامعة نيوكاسل. 1. الوقت التزاوج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزوج 6-8 أسابيع من العمر من الذكور وإناث الفئران فقط قبل نهاية دورة وضح النهار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من الإناث لوجود المقابس المهبلية الصباح الباكر (في أو قبل 08:00)، كل يوم. ويعتبر اليوم من المكونات 0.5 DPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنثى مع المكونات المهبلية في قفص جديد (بدون ذكر) وتسمية تاريخ المكونات. </li></ol> 2. عزل الفأر الجنينية الغدد التناسلية مرتفعات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل embryon الماوسجيم التلال الغدد التناسلية من 15.5 DPC الإناث الحوامل كما هو موضح في 9، مع بعض التعديلات كما هو موضح أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ تشريح قبل الظهر كما في المرة تعتبر الإناث الحوامل للدخول في اليوم التالي من الحمل بعد الظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضحية 15.5 DPC الإناث الحوامل باستخدام خلع عنق الرحم (أو وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية المؤسسية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الماوس على ظهرها على المناديل الورقية الماصة ورش الجانب البطني من البطن مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع جلد البطن السفلي (الجانب البطني) مع ملقط وجعل شق الوحشي باستخدام مقص جراحي، وتمتد من افتتاح البولي التناسلي حتى النهاية لالقفص الصدري. سحب الجلد نحو رأس الحيوان لفضح البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع عضلات البطن مع مقص جراحي لفضح التجويف البريتوني. الاستيلاء على الرحم الحامل مع ملقط فقط فوق عنق الرحم واجراء خفض. الآن رفع الرحم عن طريق الضغط على رس المثانة البولية وقطع في الرباط واسع الرحم تليها تخفيضات في تقاطعات رحمي بوقي الرحم لفصل من المرفق البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرحم في أنبوب 50 مل تحتوي على الجليد الباردة HBSS (هانك المتوازن محلول الملح). غسل الرحم الحامل بلطف مع الجليد الباردة HBSS لإزالة الدم الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الرحم في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS والحفاظ على الجليد. قطع جدار الرحم وإخراج الأجنة. الحفاظ على الأجنة في طبق بيتري جديدة مع HBSS على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء المناديل الورقية المعقمة نظيفة ووضعها على طبق بيتري جديد. رذاذ الايثانول 70٪ على المناديل الورقية. حافظ على الجنين في هذه المناديل الورقية على الجانب الوحشي وقطع عليه من أسفل البطن باستخدام شفرة معقمة في الاتجاه كما يتضح من الخط المنقط في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الجنين على قاعدة الإسفنج العقيمة التي تعلق في العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعه تحت مجهر تشريحي تشريح وقطع بعناية على طول خط الوسط بطني. إزالة الكبد والأمعاء. نظام الماوس البولي التناسلي (الكلى، الحالب، الخصية، WD، والأسهر) الآن يجب أن تكون واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الخصية و WD، ونضع في طبق بتري جديدة مع HBSS، على الجليد. لإخراج WD والخصية، وقطع الأسهر قريبة من حرصه على مجرى البول وخفض الحجز على الجزء السفلي من WD من رسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع الخصيتين وWDS من الأجنة من نفس المجموعة (و يمكن أن يختلف وفقا لخطة تجريبية). </li></ol> 3. ثقافة الجنينية الغدد التناسلية مرتفعات (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة لزراعة التلال الغدد التناسلية الجنينية من خلال استكمال DMEM / F12 مع 10٪ FBS (مصل بقري جنيني)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 1٪ L-الجلوتامين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام لكل بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ لوحة بيتري الطازجة ووضع قطرة صغيرة من المعقم HBSS على ذلك. وضع غشاء البولي المسار حفر (0.881؛ م) على هذا قطرة من HBSS مع سطح ساطع تواجه HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت باستخدام ملقط نظيفة اثنين WDS والغدد التناسلية على الغشاء (على سطحه خشن، التي تواجه أعلى) وإزالة أكبر قدر ممكن من HBSS باستخدام مناديل معقمة / ورقة ماصة. لا تلمس الأنسجة مع ورقة ماصة للرطوبة؛ خلاف ذلك، فإنه سوف يضر الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان أن لا WDS ولا الغدد التناسلية ولمس بعضها البعض. خلاف ذلك، فإنها تلتصق ببعضها البعض أثناء الحضانة لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الغشاء مع الأنسجة في بئر من 24 لوحة جيدا يحتوي على 300 ميكرولتر مستنبت والثقافة لهم في واجهة المتوسطة الهواء. الكثير من مستنبت على النتائج الأغشية في نمو الكيسي من WDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية، في ظل وجود 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم. لتغيير المتوسطة مع ماصة، وإزالة المتوسطة من أول جيدا ثم إضافة 300 ميكرولتر من متوسطة جديدة prewarmed. ملاحظة:لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة على WD التشكل، ويمكن أن يضاف المنشطات الكيميائية و / أو مثبطات في التركيزات المطلوبة لمستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الأنسجة لمدة 3 د. خلال 3 د، WDS محلول التي تم جمعها من 15.5 DPC الجنين تتحول إلى أنابيب الملتوية للغاية (الشكل 3B). إضافة المانع WNT، IWR1، والنتائج في تثبيط WD اللف (الشكل 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحصاد هذه الأنسجة تأخذ طبق بيتري مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. نقل الغشاء مع الغدد التناسلية مثقف وWD إلى لوحة بيتري. فإن غشاء تطفو على برنامج تلفزيوني. اضغط على غشاء لاغراقها في برنامج تلفزيوني واخراج الغدد التناسلية و WD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) O / N عند 4 درجات مئوية أو لمدة 1 ساعة على RT. إذا لزم الأمر، واتخاذ الصور الحقل مشرقة من WDS قبل التثبيت. </li></ol> 4. الجامع جبل المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة الثابتة 3X مع برنامج تلفزيوني-T (PBS + 1٪تريتون X-100) مع هزاز بطيئة، 10 دقيقة لكل منهما، في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الأنسجة في سلسلة متدرجة من الايثانول (25٪، 50٪، 75٪ و 100٪)، و 10 دقيقة لكل منهما، في 4 درجات مئوية، مع بطء هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). في هذه الخطوة، والأنسجة ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية في 75٪ من الإيثانول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتغيير الإيثانول، والحفاظ على الأنسجة دون عائق لمدة 2 دقيقة، والسماح للأنسجة يستقر. إخراج أكبر قدر من طاف وقت ممكن ثم قم بإضافة تركيز أعلى المقبل من الإيثانول. لتجنب أي ضرر للأنسجة، ينبغي للطرف ماصة لا تلمس الأنسجة في أي مرحلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد الجفاف، وترطيب أنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول (100٪، 75٪، 50٪ و 25٪)، و 10 دقيقة لكل منهما، في 4 درجات مئوية، مع هزاز بطيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة مع PBS-T (PBS + 0.1٪ تريتون X-100)، 4X، 20 دقيقة لكل منهما، في RT، مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT مع عازلة تمنع (PBS + 1٪ BSA + 0.2٪ الخالي من الدسم الحليب الجاف مسحوق + 0.3٪ تريتون X-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عملية الشراءص عرقلة، ونقل الأنسجة إلى حل الأجسام المضادة الأولية (المخفف في عرقلة العازلة)، واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). ووصف التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في جدول المواد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وغسل الأنسجة مع PBS-MT (PBS + 2٪ الخالي من الدسم مسحوق الحليب الجاف + 0.5٪ توين-20)، 4X، 30 دقيقة لكل منهما، في RT، مع طيف هزاز (~ 30 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد هذه الخطوة الغسيل، إضافة الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 250 (هذه الخطوة تحتاج الأمثل لأجسام مضادة الفردية) في المخزن الحجب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT، مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الآن فصاعدا حفاظ على الأنسجة مغطاة بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء كما وصفت الأجسام المضادة الثانوية مع fluorophores الحساسة للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة 3X مع برنامج تلفزيوني-T (PBS + 0.1٪ توين-20)، 30 دقيقة لكل منهما، مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشرائح لتركيب الأنسجة الملون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهذا، وقطع زلات غطاء زجاجيإلى شرائح رقيقة باستخدام قلم الماس والعصا قطعتين أحدهما على الآخر على شريحة زجاجية باستخدام المينا الأظافر. جعل اثنين من الحدود والأنسجة مكان ما بين هذه الحدود البلدين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة دابي تحتوي المتوسطة المتزايدة وضعت على زلة غطاء. تطبيق المينا الأظافر في زوايا الغطاء زلة لإصلاحه إلى الشريحة. ملاحظة: الأنسجة هي الآن جاهزة للتصوير. تخزين هذه الشرائح في -20 درجة مئوية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian/epididymal+duct,+more+twists+and+turns.">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li><li>Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+normal+and+abnormal+development+of+the+Wolffian/epididymal+duct+by+using+transgenic+mice.">Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice.</a> Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).</li><li>Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt9b+plays+a+central+role+in+the+regulation+of+mesenchymal+to+epithelial+transitions+underlying+organogenesis+of+the+mammalian+urogenital+system.">Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system.</a> Dev Cell. 9, 283-292 (2005).</li><li>Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Wnt/&#946;catenin+signalling+is+essential+for+epididymal+coiling.">Epithelial Wnt/&#946;catenin signalling is essential for epididymal coiling.</a> Dev Biol. 412, 234-249 (2016).</li><li>Murashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+androgen+signaling+in+Wolffian+duct+stabilization+and+epididymal+cell+differentiation.">Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation.</a> Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).</li><li>Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+In+Vitro+Culture:+What+Have+We+Learned+about+Early+Kidney+Development?.">Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?.</a> Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).</li><li>Hirashima, T., Adachi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+the+Quantification+of+Whole-Tissue+Immunofluorescence+Images+Obtained+at+Single-Cell+Resolution+during+Murine+Tubular+Organ+Development.">Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development.</a> PLoS One. 10, 0135343 (2015).</li><li>Chan, W. Y., Blomberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Development:+Methods+and+Protocols.">Germline Development: Methods and Protocols.</a> Methods Mol Biol. 825, (2012).</li><li>Karner, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tankyrase+Is+Necessary+for+Canonical+Wnt+Signaling+During+Kidney+Development.">Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development.</a> Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).</li><li>Traykova-Brauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+versatile+system+for+acute+and+chronic+modulation+of+renal+tubular+function+in+transgenic+mice.">An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice.</a> Nat Med. 14, 979-984 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نظام الثقافة الجهاز لديه العديد من المزايا على خلية نظام الثقافة التقليدية. هذا النظام يحتفظ العلاقات الهيكلية الأصلية والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. أنه يحاكي في أنظمة الجسم الحي ويعطي معلومات أكثر دقة من دراسات ثقافة الخلية حيث العامل المتخصصة ...

الجهاز التناسلي الذكري يتكون أساسا من الخصية، موقع لتطوير الخلايا الجرثومية والتمايز، ونظام الأقنية معقدة ما هو مطلوب للنضوج، والنقل، وتخزين الحيوانات المنوية. البربخ هو الجهاز الأنبوبي الذي يصل الخصية مع الأسهر وتشارك بشكل رئيسي في تطوير ما بعد الخصية ونضوج الخلايا الجرثومية 1. البربخ الماوس الكبار ملفوف غاية تتطور من بسيطة ومباشرة أنبوب السلائف، قناة وولف (WD) 1. بنية معقدة وملفوف من البربخ هو ضروري للحيوانات المنوية لاكتساب القدرة على تخصيب خلايا الإناث الجرثومية 2. كيف هذا الجهاز ضروري لخصوبة الرجال يتطور ويحصل في شكل ليست مفهومة جيدا. وقد ثبت مختلف مسارات الإشارات إلى أن تشارك في تطوير WD مثل إشارات Wnt مسار 3،4 والاندروجين إشارات الطريق 5. وقد أنشأت عملنا مؤخرا شرط بالanced WNT يشير لWD اللف خلال تطوير ما قبل الولادة (4). ومع ذلك، هناك حاجة مزيد من الدراسات لفهم الآليات التي تشارك في اللف بعد الولادة بربخي، تمايز الخلايا، والاتصالات خلية إلى خلية داخل الظهارة بربخي ومع خلايا الخلالية. وقد ثبت نماذج الماوس المعدلة وراثيا ليكون أداة قوية لتحديد / التحقق من الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور والمرض من أجهزة الجسم المختلفة 6. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق، وهناك قيود كبيرة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك النمط الظاهري غير متوقع من المسوخ الماوس المستهدفة فيما يتعلق وظيفة الجين يفترض، وليس النمط الظاهري في المسوخ فارغة في بعض الموديلات، تأثير العوامل الوراثية والبيئية، والعمل المكثف و عملية تطوير نماذج الماوس تستغرق وقتا طويلا. ولذلك، فإن تفسير أهمية النتائج فقط من مودى وراثيانماذج الماوس fied ليست دائما واضحة 6. هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام في نظام الثقافة الجهاز المختبر الذي يعطي لنا المرونة اللازمة لمعالجة مسارات إشارات متعددة في الوقت الحقيقي في ظروف الثقافة التي تسيطر عليها. نظام الثقافة الجهاز هو دور أساسي في فهم علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من أجهزة كاملة 7. وعلاوة على ذلك، والتصوير الأجهزة كلها ملطخة الأجسام المضادة fluorophore المسمى تمكننا من تصور علامات الاهتمام في سياق ثلاثي الأبعاد، كما هو موجود في الجسم الحي، وبالتالي توفير فهم أفضل لشكل الجهاز، وهيكل، وظيفة 8. هنا، التي وصفناها الطرق لعزل الماوس التلال الغدد التناسلية الجنينية، في المختبر الثقافة وجبل بأكمله المناعي التصوير WDS، التي يمكن تطبيقها للرد على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة التشكل من أجهزة أنبوبي مثل WDS. في هذا البروتوكول، ونحنمعزولة الماوس الجنينية التلال البولي التناسلي من 15.5 يوم تال للجماع (DPC) السدود الحوامل ومثقف منهم لمدة 3 د تليها المناعية للعلامة الظهارية خلية (cytokeratin 8، CK8)، علامة تكاثر الخلايا (الفوسفات-هيستون 3، PH3) ونشطة βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&amp;nbsp; Australia</td><td>SH30034.02</td><td>10% FBS used in culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30034.01</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% concentration used</td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch&amp;nbsp;</td><td>Whatman, USA</td><td>110409</td><td>Membrane (0.8 &amp;micro;m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma, USA</td><td>10161-5mg</td><td>100 &amp;micro;M concentration used</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences, USA</td><td>15710</td><td>16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC - wear gloves and cannot&lt;br/&gt; be disposed of in the sink</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td><td>Very viscous, careful while dispensing</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>465-500g</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cytokeratin8/Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td><td>TROMA-I</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>active &amp;beta;catenin&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology,&amp;nbsp; USA</td><td>D13A1</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>phospho-Histone 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa488 Goat anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>111-545-047</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&amp;nbsp; USA</td><td>112-585-072</td><td>1:250 in blocking buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>242-500ml</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>n-Propyl galate</td><td>Sigma, USA</td><td>2370</td><td>-</td></tr><tr><td>2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>2225-500ml</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Cover Slips (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td>CS24501GP</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organ culture and whole mount immunofluorescence staining of mouse wolffian ducts

التشكل البوق هو شرط أساسي لتنمية معظم أجهزة الثدييات، بما في ذلك الجهاز التناسلي الذكري. البربخ، جزءا لا يتجزأ من الجهاز التناسلي الذكري، هو المسؤول عن تخزين الحيوانات المنوية، والنضج، والنقل. البربخ الكبار هو أنبوب ملفوف جدا أن يتطور من السلائف الجنينية بسيطة ومباشرة والمعروفة باسم قناة وولف (WD). اللف السليم من البربخ هو ضروري لخصوبة الرجال، كما الحيوانات المنوية في الخصية غير قادرين على تخصيب بويضة. ومع ذلك، فإن الآلية المسؤولة عن التنمية بربخي واللف لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق الثقافة الجهاز والتصوير كله. في هذه الدراسة، ونحن تصف نظام الثقافة في المختبر، وكله بروتوكول المناعي جبل لتصور أفضل لعملية WD اللف والتنمية، والتي يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أجهزة الأنبوبية الأخرى.

خلال التنمية، وWD يخضع لتغيرات كبيرة حيث يتم تحويل أنبوب بسيط ومستقيم إلى قناة معقدة للغاية وملفوف. استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، WDS يخضع لعملية تحول مماثل في ظروف الثقافة. هنا نحن أظهرت النتائج من WDS تربيتها لمدة 3 د (الشكل 3). لتشريح الآليات الجزيئية المشا?...

Watch this Scientific Journal Video about Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts at JoVE.com

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Views.  University of Newcastle.  ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز. 

Video: Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

باستخدام<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Cancer Research

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

<meta charset="utf8"></head><body>تصوير ثلاثي الأبعاد للعضيات لدراسة التكوين السمبي الأولي أثناء تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

تصوير ثلاثي الأبعاد للعضيات لدراسة التكوين السمبي الأولي أثناء تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genetics

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscience

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Biology

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

باستخدام

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

تصوير ثلاثي الأبعاد للعضيات لدراسة التكوين السمبي الأولي أثناء تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي

تصوير ثلاثي الأبعاد للعضيات لدراسة التكوين السمبي الأولي أثناء تكوين الأعضاء خارج الجسم الحي

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية