المؤلفون ممتنون لمرفق الأساسية التصوير INRA MIMA2 (INRA، UMR1198، جوي-أون-Josas) وإلى موظفي وحدة IERP (UE 0907، INRA، جوي-أون-Josas) للحصول على الرعاية والمرافق الحيوانية. كما نود أن نشكر IH ماذر، MC نيفيل وS. Tooze لتزويدنا antibodie مفيدة جدا.

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

IHC هي طريقة بسيطة نسبيا ومباشر التجريبي لتوطين مستضد في أقسام الأنسجة، والتي تعتمد في المقام الأول على التفاعلات حاتمة الأجسام المضادة المحددة. على الرغم من أن يتم استخدام عدد كبير من البروتوكولات في توطين بروتين من قبل معهد التمويل الدولي، جوهر هذه الإجراءات هو دائ...

الغدة الثديية هي شاذة إفرازات الجهاز الثدييات التي هي لإنتاج الحليب لتغذية الأطفال حديثي الولادة وظيفة الرئيسي. تطوير أنسجة الثدي تحدث بشكل رئيسي بعد الولادة وتتميز عملية فريدة من نوعها فيها ظهارة يغزو سدى المحيطة بها. هذا النسيج يخضع العديد من التغييرات (النمو، والتمايز والانحدار)، وخصوصا خلال حياة الكبار، بالتزامن مع وجود اختلافات في حالة الإنجاب (الشكل 1). بالإضافة إلى التشكل العام للأنسجة، ونسب أنواع مختلفة من الخلايا وكذلك ترتيبها داخل الغدة الثديية تتغير بشكل كبير خلال تطوير 1-5. خلال الحياة الجنينية، وظهارة الثديية مستمد من خطوط حليب الثدي، والتي تم تعريفها من قبل سماكة طفيفة والطبقية من الأديم الظاهر، وبين الصدارة والخلفية أطرافه على كل جانب من خط الوسط حول يوم الجنينية 10.5 (E10.5) (الشكل 1A ).على E11.5، خط الحليب تتكسر إلى اللوحاءات الفردية، والتي تتمركز بشكل متناظر على طول الخط حليب الثدي في مواقع قابلة للتكرار، واللحمة المتوسطة المحيطة يبدأ تتكثف. واللوحاءات تبدأ في الغرق أعمق في الأدمة وتنظم اللحمة المتوسطة الثديية في طبقات متحدة المركز حول برعم الثدي (E12.5-E14.5). اعتبارا من E15.5، ظهارة الثديية، ويبدأ في الانتشار واستطال لتشكيل برعم الرئيسي الذي يدفع من خلال اللحمة المتوسطة الثديية نحو لوحة الدهون. تنبت الأساسي يطور التجويف جوفاء مع الانفتاح على الجلد، والتي تمثلت في تشكيل غمد الحلمة. على E18.5، نمت القناة التمطيط في لوحة الدهون وتشعبت إلى نظام الأقنية مفرغة صغيرة شملت في لوحة الدهون. تم القبض على التنمية أساسا، ويبقى الغدة الثديية البدائية هادئة morphogenetically حتى سن البلوغ. في الجنين الذكر، وتنشيط مستقبلات الاندروجين يؤدي إلى انحطاط البراعم، والتي تختفيقبل E15.5. اعتبارا من E18، توقف تطوير الثديية حتى سن البلوغ 6-9. عند الولادة، والغدة الثديية تؤوي نظام الأقنية بدائية أن يستطيل وفروع ببطء (النمو متساوي القياس). في بداية سن البلوغ، وهياكل كروية يقع على نصائح من القنوات تسمى براعم نهاية طرفية (TEBs)، تتشكل من طبقة خارجية من الخلايا سقف واللب الداخلي متعدد الطبقات من الخلايا (خلايا الجسم). هذه الهياكل هي التكاثري للغاية، والتغلغل في الأنسجة اللحمية المحيطة استجابة لمنبهات الهرمونية. انتشار ضمن نتائج TEBs في استطالة الأقنية، إلى جانب المتفرعة التشكل. هذه العملية تؤدي إلى إنشاء شبكة مفرغة الظهارية الأساسية المنبثقة من الحلمة (الشكل 1B، البلوغ). في ~ بعد 10-12 أسابيع الميلاد، عندما ظهارة غزت لوحة الدهون كلها، توقف توسعها وTEBs تختفي. تطوير الأقنية ثم يخضع لتغيرات ديناميكية، أي successiلقد انتشار والانحدار من الخلايا الظهارية وفقا لدورات داقية 10 (1B الشكل، والكبار). من بداية الحمل، والأنسجة الثديية يخضع النمو المهم والتغيرات المورفولوجية للتحضير لالرضاعة. ظهارة الثديية تتكاثر على نطاق واسع والتفريق، مما يؤدي إلى شبكة انبوبية-السنخية تشعبت للغاية. وفي الوقت نفسه، الخلايا الظهارية الثديية (MECs) تصبح الاستقطاب وقادرة على تجميع وتفرز منتجات الألبان. MECs تنظم في العديد من الهياكل السنخية (عنيبات) التي تحيط بها خلايا عضلية ظهارية مقلص وإدخالها على سدى تتكون من الأنسجة الضامة والدهنية والأوعية الدموية والنهايات العصبية (1B الشكل، والحمل). وعلاوة على ذلك، فإن الجانب القاعدي من MECs على اتصال وثيق مع الغشاء القاعدي (المصفوفة خارج الخلية)، والتفاعلات بين هذين الكيانين تنظيم بإحكام على حد سواء التشكل وظيفة إفرازية ماماراي ظهارة 11-13. كل هذه العمليات تعتمد على العمل من العظة مختلف البيئية، والتي من أهمها hormones14، عوامل نظير الصماوي والمصفوفة خارج الخلية. على سبيل المثال، البروجسترون يدفع اسعة 15 و alveologenesis ذلك، بالاشتراك مع البرولاكتين (PRL)، المتفرعة الجانب 16،17، ويعزز ويحافظ على التفريق بين الحويصلات الهوائية. بالإضافة إلى المنشطات وPRL18، السيتوكينات ومسارات الإشارات المرتبطة بالتنمية وتشارك (WNT والشق مسارات الإشارات) أيضا في التزام النسب الثديية والتنمية 19-21. في نهاية الحمل، وMECs اللمعية تبدأ في إنتاج الحليب الغنية بالبروتين يعرف باسم اللبأ في تجويف الحويصلات الهوائية. بالإضافة إلى ذلك، البروجسترون يعمل على نفاذية الظهارية ومنذ منعطفات ضيقة لا تزال مفتوحة، تم العثور على اللبأ أيضا في مجرى دم الأم. بعد الولادة، ومعمر الذي كان ينتظرذ ظهارة يستغرق ما يقرب من جميع حجم الغدة الثديية، ودرجة عالية من التنظيم (الشكل 2، ظهارة الثديية). يتم تشكيل وحدات إنتاج الحليب، وهي الحويصلات الهوائية (الشكل 2، سنخ)، عن طريق أحادي الطبقة الخلايا الظهارية الثديية الاستقطاب الإفرازية (MESCs)، مع غشاء البلازما قمية من ترسيم التجويف. الحويصلات الهوائية ترتب نفسها في الفصيصات التي تم تجميعها داخل فصوص متصلة القنوات التي تستنزف الحليب إلى الوسط الخارجي (الشكل 2، الفص). تحدث الرضاعة، أي، MESCs تبدأ في إفراز كميات وفيرة من الحليب، ناجمة أساسا عن انخفاض في هرمونات المشيمة (أساسا البروجسترون) (الشكل 1B، الرضاعة). يتم تنشيط جينات بروتين الحليب في دورة الوقت الزمني المحدد بدءا من الحمل إلى الرضاعة 9،22،23، وعلى رأسها ردا على PRL النخامية صدر في وقت الرضاعة. وفي الوقت نفسه، والاتصالات بين MESCs والمصفوفة خارج الخلية كلا تحفيز بروتين الحليب synthesis من خلال الإشارات التي يتم مكتسب من خلال التفاعلات بين integrins الخلوية و laminin 24،25، وقمع موت الخلايا المبرمج في MESCs 26،27. هذه مسارات إشارات تؤدي إلى تنشيط بروتين الحليب المروجين الجين 28 من خلال تفعيل النسخ محددة عوامل 29. الاتصالات خلية خلية مهمة لبعض جوانب التمايز بما في ذلك إنشاء القطبية القمي وإفراز اتجاهي منتجات الألبان أيضا. منعطفات ضيقة وثيقة بسرعة بعد بداية الرضاعة وMESCs تنسق بدقة امتصاص الجزيئات من الدم وكذلك تركيب ونقل وإفراز مكونات الحليب، وذلك استجابة لمتطلبات الغذائية لحديثي الولادة. في وقت الرضاعة، وانكماش خلايا عضلية ظهارية المحيطة الحويصلات الهوائية يحدث استجابة لالأوكسيتوسين ويؤدي إلى قذف اللبن من خلال القنوات وإلى الحلمة. الحليب هو السائل معقد يحتوي على البروتينات (في الغالبكازيين)، والسكريات (اللاكتوز بشكل رئيسي)، والدهون، والمعادن، وكذلك جزيئات النشطة بيولوجيا مثل المناعية A (ايغا)، عوامل النمو والهرمونات. وقد تم تجميع كازيين، وتجميعها في هياكل supramolecular، وهي الكازين المذيلات، نقل على طول مسار إفرازية، ثم أطلق سراحه من قبل إيماس، أي مزيج من التي تحتوي على الكازين الحويصلات الإفرازية (SVS) مع غشاء البلازما قمية من مسك (الشكل 2). يعتمد حركة المرور داخل الخلايا على تبادل المواد بين الأجزاء غشائي وينطوي القابلة للذوبان N-ethylmaleimide-حساس فيوجن (NSF) البروتين مرفق (SNAP) مستقبلات (الفخ) 30،31. تنقسم عائلة البروتينات كمين في الافخاخ حويصلي (الخامس الافخاخ)، موجودة في غشاء الحويصلة، والافخاخ الهدف (تي الافخاخ)، مترجمة على الأغشية الهدف. من خلال فتح سوستة من خلال المجالات ملفوف لفائف، والخامس ور الافخاخ-تجميع لتشكيل مستقر للغاية مجمع حزمة أربعة الحلزون، يشار إلى عشرالبريد مجمع الفخ. هذا المجمع يعزز الانصهار اثنين من طبقات ثنائية الدهون معارضة من قبل تقديمهم تدريجيا الى مقربة 30،32. بعد ذلك، يتم فصل المجمعات كمين من قبل الأدينوزين فسفاتاز جبهة الخلاص الوطني وإعادة تدويرها البروتين محول SNAP وكمين البروتينات عودتها الى مقصورة منشئهم 33. ومن المثير للاهتمام، كل بروتين كمين تكمن أساسا في الأجزاء الخلوية متميزة وكمين الاقتران يمكن أن تسهم في خصوصية الأحداث الانصهار داخل الخلايا 34. وتشير دراسات سابقة إلى أن ما لا يقل عن 23 بروتين (SNAP23) والحويصلة غشاء المرتبطة البروتين 8 (VAMP8)، وsyntaxins (STX) Synaptosomal المرتبطة -7 -12 وتلعب دورا في الكازين إيماس 35،36. كما تم العثور على هذه البروتينات بالتعاون مع الكسر الدهون من الحليب، أي دهن الحليب كريات (MFGs) 37. النموذج السائد الحالي تفترض أن قطرات الدهون حشوية (CLDs) تتشكل من تراكم ل محايدipids (أساسا triacylglycerols واسترات ستيرول) والكوليسترول المستمدة من النظام الغذائي للأم بين اثنين من منشورات من الشبكة الإندوبلازمية (ER) غشاء 38-41. تتشكل CLDs كبيرة، على الأقل جزئيا، من خلال انصهار CLDs أصغر أثناء نقله إلى الجانب قمية من MESCs حيث يتم اطلاق سراحهم كما MFGs (1-10 ميكرون في القطر) التي مهدها، ويجري enwrapped من قبل مسك القمي غشاء البلازما 40-42. الرضاعة تتوقف بعد مفطوم الجراء وMESCs يموت تدريجيا موت الخلايا المبرمج، مما أدى إلى تراجع الأنسجة الثديية إلى حالة البلوغ (الشكل 1B، ارتداد). المناعي (IF) هو أسلوب مختبر تحليلي مشترك المستخدمة في جميع الجوانب تقريبا البيولوجيا، سواء في مجال البحث والتشخيص السريري. IF تقنيات يمكن القيام بها على أقسام الأنسجة (المناعية، IHC) أو الخلية (مناعية، ICC) العينات. يعتمد هذا النهج قوية على استخدام fluorescent-الأجسام المضادة المسماة التي تربط تحديدا (مباشرة أو غير مباشرة) للمستضد من الفائدة، مما يسمح التصور من توزيع الأنسجة من خلال المجهر مضان. يعتمد إشارات مضان في الغالب على نوعية وتركيز الأجسام المضادة والتعامل السليم للعينة. ويرد بروتوكول بسيط المناعي غير المباشر (IIF) للكشف عن منتجات الحليب (كازيين وMFGs) والبروتينات المشاركة في إفراز منتجات الحليب (butyrophilin (BTN1)، كمين البروتينات) على الأبواب المجمدة من الأنسجة الماوس الثديية (الشكل 3). بينما يوفر هذا البروتوكول لمحة IHC كاملة، بدءا من جمع الأنسجة لصورة ما بعد العلاج، تنتقد والخطوات الاختيارية وكذلك بعض التوصيات الفنية وتعرض أيضا ومناقشتها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

يستخدم المناعي غير المباشر لكشف وتحديد البروتينات من الفائدة في الأنسجة. بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة كاملة وبسيطة للكشف المناعي للبروتينات، والفأر المرضعات الغدة الثديية التي يجري اتخاذها كمثال على ذلك. بروتوكول لإعداد عينات الأنسجة، وخاصة فيما يتعلق تشريح الغدة الثديية الماوس، تثبيت الأنسجة وباجتزاء الأنسجة المجمدة، ومفصل. بروتوكول قياسي لأداء المناعي غير المباشر، بما في ذلك خطوة استرجاع مستضد الاختيارية، ويقدم أيضا. وذكر أيضا مراقبة أقسام الأنسجة وصفت وكذلك الحصول على الصور والمعالجات اللاحقة. يعطي هذا الإجراء لمحة كاملة، من مجموعة من الأنسجة الحيوانية لتوطين الخلوية من البروتين. على الرغم من أن هذه الطريقة العامة التي يمكن تطبيقها على عينات الأنسجة الأخرى، فإنه يجب أن تتكيف مع كل نسيج / الابتدائية زوجين الأجسام المضادة التي شملتها الدراسة.

الغدة الثديية هي غدة تحت الجلد تقع على طول هيكل بطني كل من الصدر والبطن في القوارض. يظهر موقع خمسة أزواج من الغدد الماوس أثناء الحمل في الشكل (4). والتشكل من الغدة الثديية يتغير بشكل كبير خلال تطورها، مما يعكس التعديلات الفنية اللازمة للتحضير لالرضاعة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland at JoVE.com

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

بروتوكول المناعي غير المباشر الموضحة في هذه المقالة يسمح للكشف وتوطين البروتينات في الغدة الثديية الماوس. ويرد طريقة الكامل لتحضير عينات الغدة الثديية، لأداء المناعية، لصورة أقسام الأنسجة بواسطة المجهر مضان، وإعادة بناء الصور.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

indirect-immunofluorescence-on-frozen-sections-of-mouse-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

36.4K Views.  INRA.  بروتوكول المناعي غير المباشر الموضحة في هذه المقالة يسمح للكشف وتوطين البروتينات في الغدة الثديية الماوس. ويرد طريقة الكامل لتحضير عينات الغدة الثديية، لأداء المناعية، لصورة أقسام الأنسجة بواسطة المجهر مضان، وإعادة بناء الصور. 

Video: Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

الخلايا الظهارية الثديية شكل الماوس Mammospheres خلال التمايز المولد للبن

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

التغيرات في الغدة الثديية المورفولوجيا واحتمال الاصابة بسرطان الثدي في الفئران

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

التنميط واحدة من الخلايا العضلية الترانسكربتي ماوس الكبار

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

حقن ينترادوكتال لتسليم المخدرات المترجمة إلى ماوس الغدة الثديية

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...