وقد دعم هذا العمل منح من أكاديمية فنلندا [315948، 314387 إلى ن.ك.]؛ مؤسسة سيغريد جوسليوس [إلى ن.ك.، ج.ت]؛ مؤسسة إميل آلتونن [إلى J.-A.M، T.L.]؛ برنامج توركو للدكتوراه في الطب الجزيئي [S.C-M., O.].

تمت صيانة فئران المختبرات وجميع التجارب على الحيوانات وفقًا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة لرعاية واستخدام المختبرات في جامعة توركو.
1. إعداد الأنابيب seminiferous للميكروفيسيكشن
<ol><li>التضحية الماوس الذكور الكبار (≥8 أسابيع من العمر, الخصية 80-120 ملغ اعتمادا على سلالة والعمر) عن طريق CO2 الاختناق تليها خلع عنق الرحم. ملاحظة: يجب أن يكون الماوس ناضجًا جنسيًا ، ويفضل أن يكون عمره 8 أسابيع على الأقل. يختلف نمط الترانسيليومين للفئران اليافعة عن البالغين لأن موجة الظهارة شبه المنيفيرة لم يتم إنشاؤها بالكامل بعد ، وتوقيت الموجة الأولى من تكوين الحيوانات المنوية متميز21،22. عدم وجود الحيوانات المنوية الممدود في < 4 أسابيع من الفئران الذكور يمنع استخدامها لmicrodissection بمساعدة transillumination. يمكن استخدام جميع سلالات الماوس التي تحتوي على تكوين الحيوانات المنوية الطبيعي.</li>
	<li>رش البطن البطني مع 70٪ الإيثانول. فتح تجويف abdominopelvic باستخدام مقص معقمة، مما يجعل فتح على شكل حرف V.</li>
	<li>سحب على وسادة الدهون epididymal مع ملقط العقيمة، وتحديد موقع الخصيات، وتشريح لهم باستخدام مقص ووضعها على طبق بيتري عقيمة 100 مم التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. ملاحظة: للحفاظ على العقم، تأكد من أن جميع أدوات اللبوت والأدوات الجراحية معقمة.</li>
	<li>باستخدام مقص ناعم الرؤوس قطع الخصيات عن طريق قطع شق في albuginea tunica، ورقة ليفية سميكة تغليف الخصية. ثم المسيل للدموع tunica فتح باستخدام زوج من ملقط. قوة الأنابيب من خلال الضغط مع ملقط والتخلص من tunica. ملاحظة: أثناء التخلص من التونيكا، قد يكون من المفيد لبعض التطبيقات المصب أن تتم إزالة الخصية الشريانية جنبا إلى جنب مع tunica. تجنب إتلاف الأنابيب شبهiferous.</li>
	<li>نقل الأنابيب seminiferous إلى طبق بيتري جديد وصب ما يكفي من برنامج تلفزيوني عقيم لتغطية الجزء السفلي من طبق بيتري. بعد ذلك، اسحب الأنابيب بعيدًا عن بعضها البعض بلطف ولكن تجنب إتلاف الأنابيب. ملاحظة: سوف يؤثر الكثير من الإجهاد الميكانيكي على نمط الترانسيلومين ويؤثر على صلاحية الأنسجة وهندستها الخلوية. ويمكن أيضا أن تكون معالجة الأنابيب لكامل جبل المنادونات من هذه النقطة دون التدريج (3B). في بعض الأحيان يكفي لتحديد المرحلة بأثر رجعي عن طريق تضمين الأجسام المضادة ضد البروتينات التي أعرب عنها في تمييز الحيوانات المنوية، مثل SALL4، ج-كيت وDNMT3A18،23. كثافة الحيوانات المنوية هو مؤشر المرحلة موثوق نسبيا (الشكل 2).</li>
</ol>2- الميكرويسيرات بمساعدة الترانسيلومين
<ol><li>ضع طبق بيتري تحت مجهر تشريح بقوة عن طريق تسجيله على المسرح. ملاحظة: من المهم أن الشريط طبق بيتري جيدا لمنع حركتها التي يمكن أن تسبب خلط شرائح الأنابيب seminiferous نظمت.</li>
	<li>للكشف عن نمط امتصاص الضوء من الأنابيب شبهiferous تحت التركيز، تأكد من أن يتم مضيئة العينة من أسفل والضوء يمر من خلال العينة، أي،هو transilluminated. ملاحظة: كمية الضوء الممتص / المبعثرة هي نسبة إلى مستوى التكثيف الكروماتين في المطيّع الحيوانات المنوية وتجميعها داخل أنبوب شبهي: كلما كان أكثر تكثيفًا، كلما تم امتصاص المزيد من الضوء، أي،يظهر أكثر قتامة.</li>
	<li>التعرف على نمط امتصاص الضوء من مراحل مختلفة كما هو موضح في الشكل 2، الشكل 5A والشكل S1 عن طريق نقل حزم بعناية من الأنابيب باستخدام ملقط غرامة. ملاحظة: المراحل دائما تتبع بعضها البعض في ترتيب منطقي، وتشكيل موجة من ظهارة شبهiferous. ومع ذلك، من المهم أن نعرف أن اتجاه موجة spermatogenic أحيانا عكس ثم يعود مرة أخرى (المعروف أيضا باسم التشكيلات4،9)، تعقيد أحيانا الإجراء. كما أن طول كل مرحلة، من حيث عدد مم من الأنابيب، يختلف اختلافا كبيرا.</li>
	<li>رفع بعناية أنبوب الفائدة باستخدام ملقط مع طرف مدمن مخدرات، ثم قطع قطعة من طول مناسب باستخدام مقص microdissection (انظر فيديو التكميلية 1). ربط في غيض من ملقط يجعل رفع وعقد أنبوب أسهل ويساعد على تجنب الضغط عليه. ملاحظة: طول القطع التي سيتم قص يعتمد على التطبيقات المتلقين للمعلومات. لجمع قطع الأنابيب المجمعة من مرحلة محددة لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي12،13 (الثاني - الخامس ، VII - VIII و التاسعة الحادية عشرة ، الشكل 5B)الطول عادة 2-5 ملم. عندما يتم استخدام استخراج الفينول الكلوروفورم القياسي، يمكن أن تستمد حوالي 200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من 1 مم من أنبوب. بالنسبة لتلوين كامل من أجزاء أنبوبية مرحلية، يجب أن يكون طول الأجزاء > 5 مم. بالنسبة لتحضيرات الاسكواش، يجب ألا يتجاوز طول الأجزاء 1-2 مم لأن الخلايا في منتصف الجزء قد تفشل في الخروج إذا كانت طويلة جداً. استخدم مقياس مم تحت طبق بيتري لقياس دقيق لطول الأنبوب.</li>
</ol>3- الكبت المناعي لمختلف الاستعدادات
<ol><li>إعداد الاسكواش: التحقق من المرحلة واحتواء المناعة ملاحظة: يمكن سحق قطع الأنابيب الخاصة بالمرحلة على شريحة مجهرية مع غطاء زجاجي لإجراء التحليل المورفولوجي للخلايا الحية عن طريق المجهر على النقيض من المرحلة ومناعة المناعة اللاحقة. ويوصى مبتدئا لاستخدام هذا النهج للتحقق من المراحل عند التعرف على طريقة microdissection بمساعدة transillumination.<ol>
<li>جمع الجزء في حجم 10 ميكرولتر باستخدام ماصة ونقلها على شريحة المجهر.</li>
		<li>الاسكواش أنبوب عن طريق وضع غطاء الزجاج (20 مم × 20 مم) بعناية على أنبوب. ونتيجة لذلك، سوف تتدفق الخلايا خارج الأنبوب وتشكل أحادية الخلية الحية. ضع ورقة تصفية على حافة غطاء الزجاج لتسهيل انتشار الخلايا. تجنب سحق الخلايا أكثر من اللازم للحفاظ على قيد الحياة.</li>
		<li>مراقبة الخلايا المنتشرة تحت المجهر. استخدام المجهر على النقيض من المرحلة في الهدف 40x للتحقق من التعرف على المرحلة من خلال فحص أنواع الخلايا الموجودة(الشكل 2، الشكل S2).</li>
		<li>مرة واحدة قد انتشرت الخلايا لتشكيل أحادية مستديرة من طرفي الأنبوب، تراجع الشريحة في حاوية تحتوي على النيتروجين السائل في حين عقد مع ملقط. يبقيه مغمورة لمدة 10 s. بدلا من ذلك وضع الشريحة على لوحة الجليد الجاف لتجميد.</li>
		<li>إزالة غطاء الزجاج عن طريق التقليب تشغيله باستخدام مشرط.</li>
		<li>دون تأخير، والمضي قدما في التثبيت ووضع الشريحة بسرعة في وعاء مع 90٪ الإيثانول لمدة 2-5 دقيقة. ملاحظة: تأكد من أن إعداد الاسكواش لا يذوب قبل وضعه على 90٪ الإيثانول. ويمكن أيضا أن تكون غيرها من المثبتات المستخدمة، مثل الأسيتون، لمدة 10 دقيقة.</li>
		<li>الهواء الجاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) (حتى بعض الأيام) أو في -80 درجة مئوية (على المدى الطويل).</li>
		<li>بالنسبة للمناعة، بعد إصلاح العينات في 4٪ شبه شكلي (PFA) لمدة 10 دقائق في RT.</li>
		<li>شطف في برنامج تلفزيوني و permeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>شطف في برنامج تلفزيوني ورسم حلقة الشحوم حول كل عينة الاسكواش.</li>
		<li>إضافة 50-100 μL من 10٪ BSA (بولين المصل البوم) في 0.1٪ توين في PBS (PBST) داخل حلقة الشحوم وعينات كتلة لمدة 30 دقيقة في RT.</li>
		<li>إزالة حل BSA واحتضان مع جسم مضاد الأولية المخفف في 10٪ BSA في PBST لمدة 1 ساعة في RT.</li>
		<li>غسل 3x لمدة 5 دقائق مع PBST.</li>
		<li>احتضان مع جسم مضاد ثانوي مخفف في 10٪ BSA في PBST. ملاحظة: لطخة acrosomes، يمكن أن تكون حضنت العينات مع رودامين المسمى agglutinin الأجسام المضادة (السلطة الوطنية الفلسطينية، 1:1000) في 10٪ BSA في PBST لمدة 1 ساعة في RT(الشكل S3)بدلا من الأجسام المضادة الأولية والثانوية محددة.</li>
		<li>غسل 3x لمدة 5 دقائق كل مع PBST، شطف مع برنامج تلفزيوني وجبل مع mountant تحتوي على DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>كامل جبل من مناعة الأنابيب شبهiferous ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه تلوين كامل التحميل لشرائح الأنبوبة المرحلية (من الخطوة 2.4). إذا كان الباحث يريد أن يؤدي تلطيخ كامل دون التدريج (من الخطوة 1.5) ، وإيلاء الاهتمام للملاحظات في 3.2.1 و 3.2.7.<ol>
<li>باستخدام ماصة، نقل شرائح الأنابيب (من الخطوة 2.4) في PBS الجليد البارد إلى أنبوب مخروطي 15 مل والسماح لهم إلى الرواسب على الجليد. ملاحظة: إذا كان استخدام الأنابيب غيرstageed من 1.5.، فصل الأنابيب في طبق بيتري عن طريق الأنابيب صعودا والعودة إلى طبق مائلة عدة مرات. استخدام ماصة 1 مل مع تلميح قطع. وتهدف هذه الخطوة لفتح هيكل الأنسجة. ومع ذلك، تجنب الكثير من الأنابيب لأنها قد تضر الأنابيب. سوف ترسب الأنابيب يستغرق بضع عشرات من الثواني. تبقى شظايا الأنبوب الصغيرة والخلايا الخلالية ومخلفات الخلايا في المُنطَع.</li>
		<li>إزالة بعناية عظمى (SN) عن طريق الأنابيب أو مع pirator. إضافة 10 مل من الجليد البارد برنامج تلفزيوني ومزيج من الانقلاب.</li>
		<li>السماح للرواسب ثم إزالة SN كما كان من قبل.</li>
		<li>أضف 5 مل من 4٪ PFA، ثم قم بإصلاح 5 ساعات على طاولة دوارة (20-30 دورة في الدقيقة) عند +4 درجة مئوية. ملاحظة: يعتمد وقت التثبيت على البروتينات ذات الاهتمام وتوطينها دون الخلوي. بالنسبة للبروتينات النووية والسيكتوبلازمية، يكون التثبيت 2 ح كافياً عادة، ومع ذلك، علامات الغشاء، مثل GFRα1 (مستقبلات الأسرة GDNF ألفا 1؛ الشكل 6A, B),الاستفادة من تثبيت أطول, تصل إلى 6 ح.</li>
		<li>السماح للرواسب، وإزالة SN (PFA) كما كان من قبل، وشطف لفترة وجيزة عن طريق إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وعكس الأنبوب.</li>
		<li>السماح للرواسب، وإزالة SN كما كان من قبل، وتكرار خطوة غسل برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة على الأقل كل على طاولة دوارة في +4 درجة مئوية والمضي قدما مع تلطيخ أو تخزين في +4 درجة مئوية. ملاحظة: إذا كانت ظروف العمل معقمة وتنظيف العينات يمكن تخزينها واستخدامها على الأقل بعض الأسابيع. بدلا من ذلك، إضافة الصوديوم Azide إلى تركيز النهائي من 0.02٪ (ث / الخامس) من محلول الأسهم 2٪ للمساعدة في الحفاظ على الأنابيب قبل تخزينها في +4 درجة مئوية.</li>
		<li>باستخدام ماصة 1 مل، نقل 10-20 شرائح أنبوب ثابت إلى أنبوب 2-مل الجولة القاع. السماح للرواسب وإزالة SN. ملاحظة: إذا كان العمل مع أنابيب طويلة التي لم يتم تنظيمها، صب الأنابيب على طبق بيتري واستخدام مقص microdissection وقطع ملقط شرائح من حوالي 5-20 ملم. سوف تشابك شرائح طويلة جدا خلال عملية تلطيخ، في حين يتم فقدان أجزاء قصيرة جدا بسهولة.</li>
		<li>إضافة 1 مل من 2٪ BSA + 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنين) في 0.3٪ تريتون X-100 في PBS (PBSX). كتلة لمدة 1 ساعة على الأقل على طاولة الدورية (20-30 دورة في الدقيقة) في RT.</li>
		<li>شطف مع 1 مل من PBSX، وإزالة SN عن طريق الأنابيب وإضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ BSA في PBSX (1:100-1:2000 تخفيف). احتضان لمدة 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها في +4 درجة مئوية على طاولة الدورية (20-30 دورة في الدقيقة).</li>
		<li>إزالة حل الأجسام المضادة عن طريق pipetting وشطف الأنابيب مع 1 مل من برنامج تلفزيوني على النحو الوارد أعلاه. اغسل ثلاث مرات لمدة 1 ساعة في PBSX على طاولة دوارة (20-30 دورة في الدقيقة) في RT. ملاحظة: بعد هذا أول غسل يمكن ترك العينة بين عشية وضحاها في +4 درجة مئوية إذا لزم الأمر.</li>
		<li>إزالة SN وإضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 1٪ BSA في PBSX (عادة 1:500 تخفيف الأجسام المضادة الفلورية المسمى). يُغطّى المزيج في رقائق ورقائق على طاولة دوارة (20-30 لفة في الدقيقة) في RT لمدة ساعة.</li>
		<li>كرر 3.2.10.</li>
		<li>وأخيرا إزالة SN وصب الأنابيب إلى شريحة المجهر. فصل بلطف وترتيب الأنابيب في شرائط خطية باستخدام نصائح هلام التحميل. استنزاف قبالة العازلة الزائدة وإضافة متوسطة التركيب و coverlip. ملاحظة: تجنب تجفيف الأنابيب أثناء ترتيبها. إن مضادة تلطيخ النوى مع DAPI ليس ضروريًا في معظم الحالات. اغلق حافة الغطاء بتلميع الأظافر لمنع تجفيف العينات وتدهورها. يمكن تخزين الشرائح لمدة 1-2 أسابيع في +4 درجة مئوية قبل التصوير.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

طريقة الميكرويسيرات بمساعدة الترانويلوميين التي وصفناها أعلاه تمكن من اتباع نهج موجه نحو المرحلة لدراسة تكوين الحيوانات المنوية. إنّ تكوين الحيوانات المنوية عملية متزامنة للغاية، وجميع الخطوات الرئيسية خلال التمايز المنوي تُنظَّم وتُنفَّذ بطريقة تعتمد على المرحلة، مثل التزام التمايز (في المراحل السابعة إلى الثامنة)، وبداية الداء (VII-VIII)، والتقسيمات الميوتيكية (XII)، وبداية استطالة النطاف المنوية (الثامن) والحيوانات المنوية (الثامن)1،26،27. يوفر التحليل الموجه نحو المرحلة أداة قوية لدراسة هذه الأحداث الخاصة التي تقتصر على خطوات محددة من تكوين الحيوانات المنوية وبالتالي لا توجد إلا في مراحل محددة من دورة الظهارية شبه المائلة. اتقان الأسلوب يأخذ بعض الممارسة واستخدام مجهر تشريح ذات نوعية جيدة والظروف المناسبة مضيئة هي مفتاح النجاح. تنفيذ هذه الطريقة كجزء من مجموعة أدوات اليومية لديه القدرة على تحسين كبير في تأثير وأهمية البيولوجية للبحوث على وظائف الإنجاب الذكور من خلال السماح تشريح أكثر دقة للأحداث الجزيئية أثناء تكوين الحيوانات المنوية.
جميع سلالات الماوس WT التي درسناها عرض نمط مماثل transillumination وعرض الجمعيات الخلوية المحفوظة في مراحل من دورة الظهارية seminiferous. على شرط أن التمايز spermiogenic من الخلايا الجرثومية لا يختلف اختلافا صارخا عن الفئران WT، وينطبق الشيء نفسه أيضا على جميع نماذج الماوس خروج المغلوب التي درسناها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى التي تظهر الترتيب القطاعي الطولي من مراحل دورة الظهارية شبه7. ومع ذلك، لا يمكن استخدام الأنواع ذات المراحل غير المجزأة (مثل الإنسان). نظرا للدور الأساسي للتكثيف الكروماتين في ممدود الحيوانات المنوية في تحديد نمط transillumination، فمن الواضح أن أي سوء تنظيم هذه العملية سوف تمس حتما على تنفيذ هذه الطريقة. في الفئران الشابة والشباب (5-6 أسابيع) لم يتم بعد تحديد نمط الترانسيليمين بشكل كامل ، وبالتالي ، يجب استخدام الفئران التي تزيد أعمارهم عن 8 أسابيع فقط. من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن الضغط وسحب الأنابيب سوف تؤثر حتما على نمط الترانسيلومين لأنه يشوه العمارة الخلوية داخل ظهارة شبهiferous.
ويمكن أيضا أن تكون شرائح الأنابيب seminiferous المعزولة المستزرعة تمكين مراقبة الجسم الحي السابق والتلاعب في العمليات المقترنة بالحيوانات المنوية، بما في ذلك الميوسيس. لضمان صلاحية الأنسجة ومنع تحلل الحمض النووي الريبي والبروتين، يجب جمع العينات ومعالجتها على ألا تزيد عن ساعتين بعد التضحية بالماوس. لثقافة vivo السابقين من الأنابيب seminiferous، وينبغي أن الوقت من التضحية إلى بداية الثقافة لا تتجاوز 1 ساعة. يمكن عادة الحفاظ على سلامة شظايا الأنابيب تصل إلى 72 ساعة في المختبر إذا تم حصادها بشكل صحيح.
يمكن التحقق من مرحلة دورة الظهارية شبه المائلة، بل وتحديدها بدقة أكبر باستخدام المجهر على النقيض من مرحلة من تحضيرات الاسكواش16. يتم إجراء المجهر على الخلايا الحية، والذي يوفر بعدا إضافيا في التحليل ويسمح بمراقبة حركات العضية أو الخلية في مراحل محددة من تكوين الحيوانات المنوية28،29،30. يوفر المجهر على النقيض من الطور التدريج الدقيق لـ مناعة لاحقة ، مما يتيح إجراء تحليل مفصل جدًا للتعبير البروتيني وديناميات التعريب أثناء تكوين الحيوانات المنوية ، بما في ذلك التغييرات الخاصة بالمرحلة.
في حين يتم تحرير الخلايا من السياق الظهارية في الاستعدادات الاسكواش، والمناعة كامل جبل من شرائح أنبوب تمكين دراسة الخلايا المنوية في بيئتها الفسيولوجية. لذلك ، قد توفر الاستعدادات الكاملة تصورًا أفضل لهندسة الأنابيب شبه المنيفيرة ومخالطها بين الخلايا من الاحتفاظ بالمناعة على المقاطع العرضية. والأهم من ذلك أن التدريج بمساعدة الترانسيلومين للأجزاء الأنبوبية قبل الكبت المناعي يجعل النهج أكثر قوة من خلال تضمين معلومات عن المرحلة المحددة لشريحة معينة. تلوين كامل جبل هو أداة مفيدة بشكل خاص لدراسة الخلايا في محيط الأنابيب شبهiferous، مثل الخلايا العضلية peritubular، الضامة المحيطة والحيوانات المنوية، ولكن قد تفتح أيضا رؤى جديدة في البحوث على الخلايا الجرثومية الميوخية وما بعد الميكونية.

تمايز الخلايا الجرثومية الذكور من الحيوانات المنوية diploid إلى الحيوانات المنوية هابلويد ناضجة، أي، الحيوانات المنوية، هو عملية معقدة التي تجري في ظهارة من الأنابيب شبهiferous في الخصيتين للفرد ناضجة جنسيا1. أحفاد Mitotic من الحيوانات المنوية A1 تقسيم أول خمس مرات لتوسيع السكان ملتزمة التمايز، ثم أدخل meiosis كما spermatocytes التي تؤدي في نهاية المطاف إلى الحيوانات المنوية haploid. التمايز بين الحيوانات المنوية المستديرة في الحيوانات المنوية، أي،تكوين الحيوانات المنوية، ينطوي على تغييرات معقدة في مورفولوجيا الخلايا، بما في ذلك الضغط النووي وبناء الهياكل الخاصة بالحيوانات المنوية مثل المضاداتبوم و flagellum. في الماوس ، تستغرق عملية تكوين الحيوانات المنوية 35 يومًا لإكمال2،3.
في أي لغة معينة، يستضيف الظهارة شبه المنيفيرة ما يصل إلى خمسة أفواج من الخلايا الجرثومية المميّزة بالإضافة إلى الخلايا الجذعية/السلفة والجراثيمية وخلايا سيرتولي الجسدية1. تميز الخلايا الجرثومية تشكل طبقات متحدة المركز تكوين الذي يمكن التنبؤ بها، وخلايا haploid في خطوة معينة من التنمية دائما المنتسبين مع أنواع معينة من الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية4،5. ولذلك، فإن أي مقطع مُنَطَمِي من أنبوب يستضيف أفواج من الخلايا الجرثومية ذات التركيب الثابت. وتعرف هذه الجمعيات الخلية المحددة على أنها مراحل ظهارة شبهiferous. مراحل في حد ذاته لا تقدم راكدة نقطة الاختيار مثل الدول ولكن تتطور باستمرار كما التمايز من الأفواج الخلية الجرثومية يتقدم في متزامن1,2,6. في الفئران ، هناك 12 مرحلة (I-XII)2 التي يتم ترتيبها بطريقة مجزأة على طول المحور الطولي من أنبوب سينيفيروي ، ويتبعون بعضهم البعض في ترتيب منطقي وبالتالي تشكيل موجة من ظهارة شبه مفطورة ، أو موجة الحيوانات المنوية7،8،9 ( الشكل1). الانتهاء من الحيوانات المنوية يأخذ أربع دورات، والطبقات الهرمية أو أفواج من الخلايا الجرثومية التمييز داخل أي المقطع المقطع عرضية أنبوب شبهي هي مؤقتا دورة واحدة شبهية وبصرف النظر عن بعضها البعض. طول الدورة تعتمد على الأنواع وفي الماوس كل دورة يأخذ 8.6 أيام10.
ويمكن تحديد المراحل على أساس التكوين الخلوي وتنظيم الظهارة شبهiferous على الخصيتين الهَنَسيَّةأقسام 5 (الشكل 1 والشكل 2). ومع ذلك، التحليل النسيجي شاقة، تستغرق وقتا طويلا ويتطلب تحديد وتلطيخ، وبالتالي لا يمكن تطبيقها على الأنسجة الحية. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن يكون تنظيم على الأنسجة الحية تحت مجهر تشريح من خلال الاستفادة من أنماط امتصاص الضوء /مبعثر متميزة التي تظهرها مراحل مختلفة من الدورة(الشكل 2). قدرة كل مرحلة على امتصاص وتشتت الضوء هو نسبة إلى مستوى التكثيف كروماتين من الحيوانات المنوية في وقت متأخر بعد الظهارية أن أي مرحلة معينة تستضيف وتعبئة هذه الخلايا في حزم7,11. تمايز الحيوانات المنوية، أيتكوين الحيوانات المنوية، وينقسم إلى 16 خطوة تنموية، بما في ذلك 8 خطوات من الحيوانات المنوية المستديرة (الخطوة 1-8) و8 خطوات من الحيوانات المنوية الممدود (الخطوات 9-16) التمايز(الشكل 1). الخطوة 9-11 ممدود الحيوانات المنوية (المرحلة التاسعة الحادية عشرة) عرض مستوى منخفض فقط من التكثيف الكروماتين مما أدى إلى كمية منخفضة من الضوء يجري امتصاصها. يبدأ تكثيف كروماتين في الخطوة 11 spermatids (المرحلة الحادية عشرة)، والخطوة 15-16 ممدود الحيوانات المنوية (المرحلة الرابعة-الثامنة) تحتوي على الكروماتين المكثفة بالكامل، وبالتالي يحمل امتصاص الضوء الأقصى(الشكل 3). الكروماتين يحتاج إلى أن يكون مكثفا من أجل أن تكون معبأة بإحكام في رأس الحيوانات المنوية. العوامل الإضافية التي تسهم في نمط امتصاص الضوء هي موقع الحيوانات المنوية الممدود داخل الظهارة (القاعدية مقابل apical) وتجميع الحيوانات المنوية الممدود (وضوحا في المراحل الثانية- V)11 (الشكل 3). وينظر إلى حزم والبقع في منتصف الأنابيب والمشارب على حواف تحت مجهر تشريح وأكثر مكثف الكروماتين، قتامة بقعة / شريط11.
توضح هذه المقالة استخدام طريقة microdissection بمساعدة transillumination لعزل شرائح أنبوبية شبهiferous تمثل مراحل محددة من دورة الظهارية seminiferous. مرة واحدة معزولة، يمكن أن تخضع قطاعات أنبوبي مراحل لمختلف التحليلات المصب، بما في ذلك الحمض النووي الحيوي وتحليلات البروتين12،13،14،15، تدفق cytometry16، السابقين فيفو tubule الثقافة17 والمناعة18. هنا نقدم أيضا بروتوكولات مفصلة المصب لإعداد أحادية الطبقات المسحقة من شرائح الأنابيب مراحل لتحليل الخلايا الحية والمناعة اللاحقة، فضلا عن مناعة كاملة جبل من شرائح tubule. سير العمل في باختصار في وصفها في الشكل 4.
تسمح طريقة التشخيص المجهري بمساعدة الترانسيلومين بالتعريف الدقيق وعزل الخلايا الجرثومية في خطوات محددة من التمايز بفضل التركيب الخلوي المتزامن للمراحل. الأهم من ذلك، فإنه يتيح أيضا دراسة الأحداث التي تعتمد على مرحلة خلال تكوين الحيوانات المنوية على الأنسجة الحية. ونظرا لعدم وجود نماذج قابلة للتطوير في المختبر لـ spermatogenesis، وهذا الأسلوب أيضا ميزة فريدة من نوعها للسماح المستهدفة دراسات النمو والسمية على مراحل المرحلة محددة الأنابيب قطاعات السابقين vivo12،17. بينما نحن وصف الأسلوب هنا للفأر، يمكن تطبيق نفس الإجراء على أي أنواع الثدييات مع ترتيب طولي وجزئي من المراحل الظهارية شبه المائلة، مثل الفئران4،7،15،19،20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

الحيوانات المنوية هي عملية تمايز فريدة من نوعها التي تؤدي في نهاية المطاف إلى واحد من أنواع الخلايا الأكثر تميزا في الجسم، والحيوانات المنوية. تمايز الخلايا الجرثومية يحدث في جيوب السيتوبلازمية من خلايا Sertoli الجسدية التي تستضيف 4 إلى 5 أجيال من الخلايا الجرثومية في وقت واحد وتنسيق وتزامن تطورها. ولذلك ، فإن تكوين أنواع الخلايا الجرثومية داخل المقطع المقطعي ثابت ، وتعرف هذه الارتباطات الخلوية أيضًا باسم المراحل (I-XII) من الدورة الظهارية شبه المائلة. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تكون مراحل تحديد من الأنابيب شبهiferous سليمة على أساس خصائصها امتصاص الضوء التفريقي / مبعثر كشفت عن طريق transillumination، وحقيقة أن المراحل تتبع بعضها البعض على طول أنبوب في ترتيب عددي. توضح هذه المقالة طريقة microdissection بمساعدة transillumination لعزل شرائح أنبوبية seminiferous تمثل مراحل محددة من دورة الظهارية الظهارية الماوس شبه. يتم فحص نمط امتصاص الضوء من الأنابيب شبهiferous أولا تحت مجهر تشريح، ومن ثم يتم قطع شرائح أنبوب التي تمثل مراحل محددة واستخدامها في التطبيقات المصب. هنا نصف بروتوكولات المناعة لإعدادات الاسكواش الخاصة بالمرحلة ولأجزاء الأنابيب السليمة. هذه الطريقة تسمح للباحث بالتركيز على الأحداث البيولوجية التي تحدث في مراحل محددة من تكوين الحيوانات المنوية ، وبالتالي توفير أداة فريدة للدراسات التنموية والسمية ، والسيولوجية من الحيوانات المنوية والآليات الجزيئية الكامنة.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

يصف هذا البروتوكول ميكروديستيون بمساعدة الترانويلومي من أجزاء من الأنابيب الماوس الكبار شبهiferous التي تمثل مراحل محددة من دورة الظهارة شبه المائلة، وأنواع الخلايا فيها، والمناعة اللاحقة من الاستعدادات الاسكواش وقطاعات الأنابيب سليمة.

التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

transillumination-assisted-dissection-specific-stages-mouse

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Reproductive System

SCIENTISTS IN ACTION

6.9K Views.  University of Turku, Turku, Finland. يصف هذا البروتوكول ميكروديستيون بمساعدة الترانويلومي من أجزاء من الأنابيب الماوس الكبار شبهiferous التي تمثل مراحل محددة من دورة الظهارة شبه المائلة، وأنواع الخلايا فيها، والمناعة اللاحقة من الاستعدادات الاسكواش وقطاعات الأنابيب سليمة.

Video: Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

خطوة محددة الفرز ماوس Spermatids بواسطة التدفق الخلوي

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

عزل ماوس بطانة الرحم طلائي واللحمية خلايا ل<em&gt; في المختبر</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

تشريح وإعداد شريحة الاكليلية وضع الغدة النخامية الماوس

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

تشريح والثقافة وتحليل خلايا الجمجمة العصبية الابتدائية من الماوس لدراسة الخلية كريست العصبية الترقيم والهجرة

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...