وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أبحاث منطقة فلاندرز (FWO G.0856.13N) ومجلس البحوث في جامعة الكويت لوفين (OT / 13/113). ويتم تمويل KDC قبل FWO بلجيكا. ويتم تمويل ه أوراسكوم تليكوم / 13/113. ونود أن نشكر خلية منشأة التصوير الأساسية لوفين جامعة الكويت (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) لاستخدام المجهر متحد البؤر.

<ol>
	<li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation:+a+model+for+the+action+of+progesterone.">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+regulation+of+menstruation.">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li><li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation.">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li><li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy.">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li><li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The evolution of the human placenta. , (2012).</li><li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse.">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li><li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+(TER)+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture.">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li><li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li><li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells.">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li><li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium.">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li><li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium.">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li><li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells.">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li><li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production.">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li><li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact.">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+stromal+cells+regulate+epithelial+cell+growth+in+vitro:+a+new+co-culture+model.">Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model.</a> Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).</li><li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+well-defined+in+vitro+three-dimensional+culture+of+human+endometrium+and+its+applicability+to+endometrial+cancer+invasion.">A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion.</a> Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Decidualization هو التمايز التي تعتمد على هرمون البروجسترون من خلايا انسجة بطانة الرحم إلى خلايا الساقطية إفراز الجولة. في الإنسان، هذه العملية تحدث بشكل عفوي خلال مرحلة الجسم الأصفر من الدورة الشهرية، وبدأت في الخلايا اللحمية المحيطة خلايا الأوعية الدموية لتشكيل predecidua. ومع ذلك، في القوارض، وجود الكيسة لا بد للحث على decidualization. حقيقة أن decidualization يحدث إلا بعد الاتصال مع الخلايا الظهارية بطانة الرحم يعني أن هناك عوامل مهمة تفرز من خلايا الظهارية للحث على decidualization في سدى الكامنة. وعلى الرغم من هذا الاختلاف في بدء عملية decidualization ينبغي الاعتراف، والحقيقة أن decidualization الإنسان يصبح أكثر قوة على زرع الأجنة تشير إلى أن آليات مماثلة يمكن أن تشارك. في المختبر غالبا ما تستخدم مزارع الخلايا لدراسة تأثير جزيئات محددة خلال عملية decidualization.ومع ذلك، فإن توافر وكمية من الأنسجة البشرية التي يمكن جمعها وغالبا ما يقتصر ويرافقه الاختلافات، وعلى سبيل المثال، مرحلة دورة، وعدد حالات الحمل وجود أمراض النساء مثل التهاب بطانة الرحم أو غدي. العديد من هذه القضايا يمكن الوقاية منها عن طريق استخدام أنسجة الفئران التي يمكن الوصول إليها بسهولة ومرحلة دورة مستقلة. ميزة أخرى قوية من استخدام أنسجة الفئران هي الفرصة لاستخدام القوارض المعدلة وراثيا وإمكانية إعداد عدد كبير من التجارب. في هذه اللحظة، وقد وصفت العديد من البروتوكولات العزلة مختلفة في الأدب مع تفاوت الكبير في السن من الحيوانات وفترة في مرحلة الشياع في لحظة الاستخدام. تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لبطانة الرحم المشترك الثقافات الأولية للانسجة والخلايا الظهارية التي تم اتخاذها الاستفادة من دورة داقية موحدة من قبل حقن يومية من هرمون الاستروجين قبل العزلة. وعلاوة على ذلك، هرمون الاستروجين هو كnown للحث على الانتشار في الخلايا الظهارية وانسجة الخلايا مما يزيد العائد في العزلة. واستند بروتوكول العزلة وصفها في هذه الورقة على غرانت وآخرون. 7، ومع ذلك، تم إدراج المزيد من الخطوات الأمثل لزيادة الغلة، والنقاء، والجدوى من ثقافات مختلفة من الخلايا. أولا، كان HBSS تستكمل دائما مع المضادات الحيوية لتجنب التلوث من ثقافة الأولية. خلال عزل MEEC، تم إجراء التكيف درجة حرارة (15 دقيقة عند 37 درجة مئوية) لزيادة حصاد الخلايا الظهارية أثناء عملية الهضم الأول. بعد ذلك، أدرج خطوة إضافية لتهدئة النشاط الأنزيمي بعد التربسين الهضم عن طريق إضافة المتوسطة التي تحتوي على FBS لكبح نشاطها. وعلاوة على ذلك، صدرت MEECs من خلال مرشح والذي كانت شبكة أكبر مما هو شائع وصفها (100 ميكرون) لأنها غالبا ما تأتي في مجموعات وأوراق الخلية. وعلاوة على ذلك، تم تخفيض التلوث من قبل خلايا انسجة عن طريق أداء الوظيفةخطوة itional التي تم فصلها استنادا MEECs وMESCs على الترسيب الجاذبية. وأخيرا، تم المصنف MEECs coverslips على المغلفة الكولاجين لزيادة المرفق من الخلايا لcoverslips الزجاج، كما أصبح واضحا أن التعلق coverslips الزجاج غير المصقول أو المطلي PLL-لم يكن كافيا. خلال عزل MESCs، واستكملت كولاجيناز (1 ملغ / مل) لتحسين الهضم. وعلاوة على ذلك، تم تنفيذ هذه الخطوة الهضم في مكررة لتجنب التلوث من MEECs المتبقية. أدت كل هذه خطوات إضافية في ثقافات نقية وقابلة للحياة السكان خلية متجانسة. تم تقييم نقاء سكان الخلية مع المناعية وQRT-PCR تستخدم فيمنتين كعلامة انسجة وcytokeratin باعتباره علامة الظهارية. بشكل واضح، وقد لوحظ نمط التعبير الآخر من فيمنتين وcytokeratin في MEEC ومسك. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون لاحظت أن التعبير مرنا نسبيا من فيمنتين وcytokeratin مشابه في الثقافات MEEC. Similيتم نشر النتائج ع من قبل مجموعات بحثية أخرى، حيث تنمو الخلايا الظهارية في الثقافة اكتساب فيمنتين التعبير 9. الأهم من ذلك هو الاختلاف في التعبير البروتين بين فيمنتين وcytokeratin كما لوحظ في stainings immunohistological من السكان مختلفة من الخلايا. أظهر المناعية المزدوج الذي EECS كانت إيجابية للcytokeratin وكانت ESC إيجابية لفيمنتين. استخدام هذه العلامات في المناعية هو وسيلة ثابتة وتستخدم standardly للإشارة إلى أنواع الخلايا 10. على الرغم من أن الكثير من الأبحاث قد أجريت على decidualization من مسك، فإنه لا يزال من الممكن أن وجود الخلايا الظهارية في هذا النموذج قد يغير من نتائج decidualization. أولا، وقد تبين أنه إذا MEEC تنمو إلى أحادي الطبقة بحضور المتوسطة مكيفة مسك أو في إعداد ثقافة مشتركة، أحادي الطبقة لديها مقاومة كهربائية تحسين الظهارية الخلايا بطريق الظهارة (طير)، والناجمة عن العوامل التي يفرزها مسك 7. وعلاوة على ذلك، بييرو وآخرون. 11 تقدم أي دليل على انتشار الظهارية، وتتأثر 17β استراديول، قد بوساطة العوامل يفرز من خلايا انسجة، وبدلا من ذلك، يمكن للخلايا الظهارية الافراج عن العوامل التي تعدل انسجة decidualization 12 و 13. وعموما، فمن الواضح أن البيئة المشارك ثقافة الظهارية انسجة توفر وضعا أكثر الفسيولوجية التي تسمح للتفاعل نظير الصماوي والاتصالات. وقد وصفت طريقة زراعة اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا باستخدام نظام المشاركة في ثقافة إدراج سابق 14 و 15 و تم تكييفها للاستخدام الخلايا الأولية الفئران. من خلال الكشف عن مستويات البرولاكتين مرنا باعتباره من قراءة لdecidualization، تقنية الموضحة لديها استنساخه جدا للقراءة خارج لdecidualization المتاحة والسماح للليالي بالتالي دراسة للعلاقة بين الظهارية انسجة خلال decidualization. إشارات نظير الصماوي بوساطة من MEEC قد يغير مدى decidualization في خلايا انسجة. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج يسمح لتعديل معين من الجانب الظهارية دون أن يؤثر بشكل مباشر على خلايا انسجة. لذلك، هذا التعاون ثقافة MEEC ومسك تقدم أداة مثالية لتقييم تأثير الهرمونات، السيتوكينات، وما إلى ذلك على الخلايا الظهارية مع التدريجي على قراءة decidualization اللحمية. ميزة أخرى لهذا النظام المشترك الثقافة هو أنه يسمح للباحثين للتحقيق في تورط بروتين معين في العملية decidualization سواء في الظهارية أو مقصورة انسجة باستخدام الخلايا المعزولة من الحيوانات المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية أن تكون مفيدة جدا للتحقيق في الكيسة التصاق لتقييم ما إذا كانت العوامل نظير الصماوي يفرز من قبل خلايا الظهارية في وجود الكيسة كافية للحث على decidualization من انسجة الكامنةالخلايا. خطوة هامة في غزو الأرومة الغاذية ربطها تدهور المصفوفة خارج الخلية، التي تتوسط فيها عمل الإنزيمات المحللة للبروتين. التقنية المقترحة يمكن تطبيقها كنموذج في المختبر للتحقيق في الحديث عبر بين الكيسة، والخلايا الظهارية وسدى الداعمة. ومع ذلك، في هذه اللحظة لا يعرف إلا القليل عن أصل الخلايا الظهارية التي يمكن أن تكون اللمعية كذلك غدي. لذلك، هناك حاجة إلى مزيد توصيف الصورة الجينية والجزيئية للخلايا الظهارية. وبالإضافة إلى ذلك، يقتصر الطريقة الموصوفة في المعرفة المتاحة عن الاستقطاب من الخلايا الظهارية. في هذه اللحظة، لم تؤخذ استقطاب الخلايا الظهارية في الاعتبار. ومع ذلك، يتم وصف الاختلافات في التعبير عن بروتينات الغشاء في الأغشية القمية والقاعدية. الاستقطاب غير المناسب للطبقة الطلائية يمكن أن يكون لها تأثير على التفاعل نظير الصماوي بين epitheliالقاعدة والخلايا اللحمية. ومع ذلك، طرق للحصول على الخلايا الظهارية الاستقطاب وصفت ويمكن إدراجها في تقنية وصفها 15 و 16. وإجمالا، يقترح بروتوكول صفها تقنية لإنشاء مزارع الخلايا الأولية من الماوس طلائي بطانة الرحم وخلايا انسجة بنجاح. نتائج هذا الأسلوب في مزارع الخلايا نقية كما أكد QRT-PCR والمناعية من فيمنتين وcytokeratin. في النهاية تم عرض الظهارية وانسجة الثقافة المشتركة التي تسمح للتحقيق في إشارات نظير الصماوي بوساطة إما MEEC و / أو مسك في عملية decidualization.

بطانة الرحم البشري هو البطانة الداخلية للرحم ويخضع لدورات شهرية من انهيار وإصلاح تمهيدا لحالات الحمل المحتملة. وهو يتألف من طبقة واحدة من الخلايا الطلائية المبطنة لتجويف الرحم وسدى الكامنة التي تختلف في السمك وفقا لتقلبات المبيض هرمونات الاستروجين والبروجستيرون. خلال مرحلة الجسم الأصفر، وارتفاع هرمون البروجسترون بعد الإباضي لحث على تمايز الخلايا اللحمية بطانة الرحم إلى خلايا الساقطية أكبر، جولة، وهي عملية تسمى decidualization 1 و 2. في الإنسان، تحدث هذه الظاهرة بشكل عفوي لتشكيل predecidua، ولكنه يصبح أكثر وضوحا على زرع الأجنة. والنتيجة الوظيفية decidualization هي أن الرحم يصبح عابر تقبلا لزرع الجنين. وصفت هذه الفترة باسم &quot;نافذة زرع&quot;. خلال الفترة المبكرة من زرع الأجنة، البريد decidualizedوالخلايا اللحمية ndometrial المحيطة الجنين زرع توفر حاجزا لمنع مرور المواد الضارة إلى الجنين 3. خلال فترة الحمل، وهذا الساقط توفير المواد الغذائية للجنين النامي قبل اتخذت المشيمة مكان، وستشكل لاحقا الجزء الأمهات من المشيمة (4). الاعتبارات الأخلاقية والعملية تحد من تصميم الدراسات الإنسان للتحقيق في عملية decidualization ولقد دفعت استخدام النماذج الحيوانية. كونه عضوا في مجموعة المشيمة دموية مشيمائية، فإن بطانة الرحم من القوارض تخضع أيضا decidualization قبل المشيمة 5. في القوارض، ومع ذلك، فإن الشروع في عملية decidualization يعتمد على وجود الكيسات الأريمية في تجويف الرحم، مما يدل على أن التحفيز الإضافي اللازم لتحريك ردود الساقطية 6. هذا ينطوي على الاتصالات المعقدة بين عشرالبريد خلايا بطانة الرحم الظهارية التي لها اتصال مباشر مع الكيسة، والخلايا اللحمية الأساسية. ومع ذلك، decidualization يمكن أن يتسبب بشكل مصطنع استخدام المنبهات مثل الخدش الميكانيكي أو تقطير النفط في الرحم تستعد هرمونيا. على الرغم من الدراسات المجراة باستخدام نماذج decidualization الاصطناعية سمحت لنا لتحسين رؤيتنا في عملية معقدة إشارات من decidualization، الميكانيكية دراسات معمقة، على سبيل المثال، التحقيق في البلاغ الذي لا غنى عنه بين الخلايا الظهارية واللحمية، محدودة. لذلك، في الدراسات المختبرية decidualization يمكن استخدامها لمعالجة مسارات مهمة ودراسة العمليات الأساسية. تحقيقا لهذه الغاية، مزارع الخلايا اللحمية بطانة الرحم الأولية يمكن إعدادها من بطانة الرحم البشري أو القوارض. توظيف القوارض يوافق على استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا للتحقيق في دور بروتين معين من الاهتمام أثناء عملية decidualization. ومع ذلك، غير ناضج، prepuberوغالبا ما تستخدم تاي الفئران من أجل تجنب المضاعفات دورة داقية، بينما في حالات أخرى يتم جمع رحم من جميع مراحل دورة داقية، مما يؤدي إلى عدم التجانس في الثقافات. وعلاوة على ذلك، وقد تمت دراسة عملية decidualization في بروتوكولات مختلفة، على سبيل المثال، عن طريق (ط) الهرمونات المكمل (الاستروجين والبروجسترون أو الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم)) إلى وسيلة زراعة، أو (ب) عزل الخلايا الساقطة من الفئران في اليوم 4.5 من (الزائفة) الحمل، والتي تتطلب ضرورة إضافية لفحص المكونات والذكور أجريت لهم هذه العمليات. هذه القيود تدل على ضرورة وجود طريقة موحدة للدراسة في decidualization المختبر. في هذه الدراسة، وهذا نموذج الفسيولوجية لفحص في المختبر decidualization بدءا من الكبار، وستعرض غير (الزائفة) الفئران الحوامل. في هذه الطريقة، سوف حقن يومية من 17β استراديول (E2) تحفز تكاثر خلايا بطانة الرحم، مما أدى إلى زيادة العائد من متجانسة وصالسكان الخلية لدى عودتهم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظام coculturing يسمح دراسة الحديث المتبادل-الظهارية انسجة والقدرة على التعامل مع عملية decidualization على مستويات مختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 &#181;m pore size; transparant</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>662610</td>
			<td>Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. 
			https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell culture treated 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromoadenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B7880</td>
			<td>Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medroxyprogesterone 17-acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1629</td>
			<td>Prepare a stock solution of 250 &#181;M in ethanol. Store aliquots at -20 &#176;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arachis oil</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td>Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue cell viability reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13261</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-046</td>
			<td>Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-&#946; Estradiol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td>Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell medium filter Stericup, 0.22 &#181;m, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td> http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063&#160;&#160;&#160;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-056</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-018</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-037</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5921</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-105</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6395</td>
			<td>Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1882</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, glass, 18 mm &#216;</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td>
			<td>1001/18</td>
			<td> http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&#38;tx_rmproducts_pi1[g]=937&#38;tx_rmproducts_pi1[p]=3504&#38;tx_rmproducts_pi1[v]=20088&#38;cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2674</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;m mesh, disposable</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, polyethersulfone, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid (glacial) 100%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.00063</td>
			<td> https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354236</td>
			<td>From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&#38;productid=354236%28Lifesciences%29#&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3292</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td> https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821296</td>
			<td> https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)&#160;</td>
			<td>Cell Signalling Tech</td>
			<td>#5741</td>
			<td>use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2562</td>
			<td>use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td> http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&#38;region=BE&#38;gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&#38;region=BE&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor&#38;reg;%20488\%22$;; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-11032</td>
			<td> http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&#38;resultPage=1&#38;resultsPerPage=15&#38;autocomplete=&#38;priorSearchTerms=&#38;searchMode=keyword&#38;productTypeSelect=antibody&#38;targetTypeSelect=antibody_secondary&#38;species=ltechall&#38;keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td> http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html&#160; </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, with calcium and magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040174</td>
			<td> https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133&#160; </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization

Decidualization هو عملية المفاضلة التي تعتمد على هرمون البروجسترون من خلايا انسجة بطانة الرحم، وهو شرط أساسي لنجاح زرع الأجنة. رغم ما بذل الكثير من الجهود للكشف عن الآليات الكامنة وراء decidualization، والإشارات الدقيقة بين الخلايا الظهارية التي هي على اتصال مع الجنين والخلايا اللحمية الأساسية لا تزال غير مفهومة. لذلك، ودراسة decidualization بطريقة يأخذ كل الظهارية وخلايا اللحمية في الاعتبار يمكن تحسين معرفتنا حول التفاصيل الجزيئية للdecidualization. لهذا الغرض، في النماذج الحية من decidualization الاصطناعي هي من الناحية الفسيولوجية الأكثر أهمية. ومع ذلك، والتلاعب من الاتصالات بين الخلايا غير محدود. حاليا، في الثقافات المختبر من خلايا انسجة بطانة الرحم يتم استخدامها للتحقيق في التشكيل من decidualization عدة جزيئات الإشارة. تقليديا، وخلايا انسجة الإنسان أو الماوس بطانة الرحم هيمستخدم. ومع ذلك، فإن توافر العينات البشرية وفي كثير من الأحيان محدودة. وعلاوة على ذلك، ويرافق استخدام أنسجة الفئران مع التنوع في طريقة زراعة. تقدم هذه الدراسة طريقة التحقق من صحة وموحدة للحصول النقي بطانة الرحم الخلايا الظهارية (EEC) والثقافات اللحمية الخليوي (ESC) باستخدام الكبار الفئران سليمة تعامل مع هرمون الاستروجين لمدة ثلاثة أيام متتالية. تم تحسين بروتوكول لتحسين العائد، والسلامة، ونقاء من الخلايا وكذلك تمديد لدراسة decidualization في coculture الجماعة الاقتصادية الأوروبية وESC. هذا النموذج قد تكون مناسبة لاستغلال أهمية كل أنواع الخلايا في decidualization وتقييم مساهمة الجزيئات يشير الهامة التي يفرزها EEC أو ESC خلال الاتصالات بين الخلايا.

لمحة عامة عن بروتوكول ويوضح الشكل 1A لمحة عامة عن البروتوكول. تم استخدام حقن يومية من E2 (100 نانوغرام) لمدة ثلاثة أيام متتالية لمزامنة الحيوانات وتوحيد مرحلة من مراحل دورة داقية. دورة داقية يمكن تقييم من قبل lavages المهبلية، وينقسم إلى مقدمات الوداق، شبق، هجوع الودق، ومرحلة تلية الوداق. يمكن أن يتم تعيين مرحلة دورة وفقا لنسبة من خلايا بشرية في غسيل، التي تخضع لتغيرات هرمونية. وزيادة مستويات هرمون الاستروجين جعل الحيوانات تتطور إلى مرحلة الشبق. يمكن بسهولة الكشف عن هذه المرحلة من وجود خلايا الظهارية متقرن حصرا وعدم وجود الكريات البيض (الشكل 1B). في يوم 4، رحم من الحيوانات التي هي في مرحلة الشياع يتم جمع وMEEC ومسك معزولة (الشكل 1C). Decidualization جليكون ذلك حافزا بإضافة 0.5 ملي المخيم و1 ميكرومتر MPA إلى 2٪ FBS المتوسطة خلال فترة الحضانة من 5 د. مراقبة نوعية MEEC ومسك الثقافات نقاء الثقافات الخلية الأولية يمكن تقييمها من قبل الفرق في فيمنتين وcytokeratin التعبير. فيمنتين غير لخيوط المتوسطة التي يعبر عنها في خلايا اللحمة المتوسطة، وبالتالي في الخلايا اللحمية بطانة الرحم. Cytokeratin هو خيوط وسيطة وجدت في الهيكل الخلوي من الأنسجة الطلائية. ويبين الشكل 2A مستوى التعبير مرنا من فيمنتين وcytokeratin في MEEC ومسك تقييم استخدام QRT-PCR. مستويات فيمنتين على نسبة عالية من مسك وانخفاض في MEEC (2.2x العالي، ف &lt;0.001)، في حين أن مستويات cytokeratin مرتفعة في MEEC وانخفاض في مسك (36X العالي، ف &lt;0.001). أجري فيمنتين / تلطيخ مزدوج cytokeratin وأشار إلى أن الخلايا اللحمية تعبر عن فيمنتين في حين epitخلايا helial تعبر عن cytokeratin (الشكل 2B، C). وقد استخدم غياب الأجسام المضادة الأولية كوسيلة لمراقبة سلبية على المناعية (الشكل 2D، E). تظهر هذه stainings immunohistological أن كلا من مزارع الخلايا بطانة الرحم (MEEC ومسك) لديها نقاء تصل إلى 90٪. Decidualization في MEEC / مسك Cocultures بعد العزلة، والمصنف خلايا بطانة الرحم الماوس واللحمية في نظام الثقافة المشتركة لمحاكاة بيئة الرحم. وكانت الخلايا المستزرعة حتى شكلت خلايا الظهارية أحادي الطبقة في إدراج الثقافة الخلية (قيم طير من 800 - 1000 / جيد)، وصلت إلى خلايا انسجة دولة شبه متموجة. وكان المستحث Decidualization في الخلايا اللحمية مع تطبيق 0.5 ملي المخيم و1 ميكرومتر MPA. بعد خمسة أيام من الحضانة، تم تقييم مستويات مرنا البرولاكتين في الخلايا اللحمية التي كتبها QRT-PCR مؤشرا لdecidualization (الشكل 3A). وأعرب عن مستويات البرولاكتين العالية في الخلايا تتعرض للهرمونات وnondetectable في الخلايا المحتضنة مع وسيلة التحكم (P &lt;0.01). منذ الخلايا الظهارية من الصعب تصور داخل إدراج ثقافة الخلية، تم إجراء فحص قابلية على الفور بعد فترة الحضانة لمدة خمسة أيام (الشكل 3B). تمت إضافة مزيج من متوسط ​​النمو الطبيعي وكاشف الجدوى إلى الآبار وحضنت لمدة الحد الأدنى من 8-12 ساعة. وأشار التحول من اللون الأزرق إلى اللون الوردي مشرق وجود خلايا الظهارية قابلة للحياة. لاحظ أن تحول لون سوف تحدث فقط عند وجود خلايا قابلة للحياة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> الشكل 1: نظرة شاملة من البروتوكول. (أ) مخطط للبروتوكول العزلة بدأت مع ثلاثةأيام متتالية من حقن هرمون الاستروجين. في يوم 3، وينبغي إعداد التحضيرات اللازمة. في يوم 4، يتم تقييم مرحلة الشبق (المشار إليها نجوم) عن طريق إجراء غسيل المهبل. مسك وMEEC يتم عزل باستخدام الخطوات الهضم مختلفة. في يوم 6، أو عندما الخلايا هي متكدسة، decidualization يمكن أن يتسبب في نظام المشاركة في الثقافة بإضافة المخيم والمناطق البحرية المحمية إلى المتوسطة وفترة الحضانة من خمسة أيام (يوم 6-11). (ب) الصورة التمثيلية للمرحلة الشياع تتميز بوجود خلايا الظهارية متقرن في غسل المهبل (التكبير 10X). (C) الصورة التمثيلية للمسك وMEEC (التكبير 20X، شريط مقياس: 100 ميكرون). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <stron<html> ز&gt; الشكل 2: المناعية والكمي RT-PCR لفيمنتين وCytokeratin في MEEC ومسك. (أ) مستويات رسول الحمض النووي الريبي فيمنتين وcytokeratin التعبير للدلالة على نقاء الثقافات. وتم قياس كمية الحمض النووي الريبي مستويات نسبيا في الوسط الهندسي من الجينات التدبير المنزلي ACTB وTBP. وقد أظهرت البيانات كما يعني ± SEM. فيمنتين / تلطيخ مزدوج cytokeratin على الثقافات مسك (ب) والثقافات MEEC (C). إدراج في الجهة اليسرى يظهر عرض التكبير 63X. السيطرة السلبية مع الأجسام المضادة الأولية حذفت لمسك (D) وMEEC (E) (مقياس شريط: 50 ميكرومتر). ***: P &lt;0.001 مع اتجاهين أنوفا مع تصحيح بونفيروني لاختبار متعددة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> EP-together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig3.jpg" /> الرقم 3: التحقق من Decidualization عبر RT-PCR. مستويات (A) مرنا التعبير للبرولاكتين في خلايا انسجة لتقييم decidualization. وتم قياس كمية الحمض النووي الريبي مستويات نسبيا في الوسط الهندسي من الجينات التدبير المنزلي PGK1 وTBP. ويظهر التغير أضعاف في الخلايا المستزرعة في السيطرة أو المتوسطة ساقطي كما يعني ± SEM. (ب) صور توضيحية للخلايا انسجة قبل (أعلى) وبعد (القاع) التحفيز decidualization. إدراج على اليمين يوضح التكبير من خلية انسجة decidualized. يتميز Decidualization عن وجود خلايا متعددة النوى، وأشار السهام السوداء. (C) صور الممثل لتقييم قابلية الخلايا الظهارية في إدراج بعد الفحص. وتم التقاط الصور على الفور بعد إدارة كاشف الجدوى (Prestoblue) (0 ح) ووصباح ollowing (ON). **: ف &lt;0.01 مع اختبار مان ويتني U. ON: بين عشية وضحاها. شريط مقياس: 100 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization at JoVE.com

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

تقدم هذه الدراسة طريقة موحدة والتحقق من صحتها للعزلة وثقافة الماوس الرئيسي انسجة بطانة الرحم والخلايا الظهارية، والتي يمكن استخدامها في نظام coculture للدراسة في decidualization المختبر.

عزل ماوس بطانة الرحم طلائي واللحمية خلايا ل<em&gt; في المختبر</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

isolation-mouse-endometrial-epithelial-stromal-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

23.8K Views.  Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven).  تقدم هذه الدراسة طريقة موحدة والتحقق من صحتها للعزلة وثقافة الماوس الرئيسي انسجة بطانة الرحم والخلايا الظهارية، والتي يمكن استخدامها في نظام coculture للدراسة في decidualization المختبر. 

Video: Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

العزلة وإثراء الإنسان الدهنية المشتقة من خلايا انسجة لتعزيز تكون العظم

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

العزل والتوسع في الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة مشتقة من المشيمة البشرية الأنسجة

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

عزل السريع لBMPR-IB + الدهنية المشتقة الخلايا اللحمية للاستخدام في قبي عيب شفاء نموذج

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

عزل وتوصيف الخلايا اللحمية الوسيطة القلب من عينات مرضى اعتلال عضلة القلب أرهيثموجينيك بيوبتيك اندوميوكارديال

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...