هذا البروتوكول مهم لأنه يظهر منهجية خطوة بخطوة لعزل ظهارة الرحم النقية للغاية من رحم الفأر لثقافة عضويات بطانة الرحم. تستخدم هذه الطريقة بكفاءة التفكك الأنزيمي والميكانيكي لعزل ظهارة الرحم. تم تبسيط التقنيات لإنشاء ومعالجة وتحليل عضويات ظهارة بطانة الرحم المشتقة من الظهارة المعزولة.
ابدأ بإذابة مصفوفة الجل على الثلج لمدة ساعة إلى ساعتين تقريبا قبل الاستخدام. ثم قم بتشريح الفأر الرحيم عن طريق إجراء شق خط الوسط على البطن باستخدام المقص ، وتقشير الجلد برفق لفضح الطبقة البريتونية الأساسية. حدد موقع قرون الرحم عن طريق تحريك ضمادات الدهون في البطن جانبا برفق وأمسك قرون الرحم عند تقاطع عنق الرحم قبل قطعها على طول الدهون المساريقي.
بعد تشريح رحم الفأر ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية تماما من قرن الرحم بمقص صغير. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتقطيع كل قرن رحم إلى أجزاء صغيرة ، يبلغ قياس كل منها حوالي أربعة إلى خمسة ملليمترات. ضع جميع شظايا الرحم من رحم واحد في بئر واحد من صفيحة بئر 24 تحتوي على 0.5 ملليلتر من 1٪ تربسين.
ثم احتضان لوحة البئر 24 في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تقريبا للفصل الأنزيمي لظهارة بطانة الرحم عن السدى الأساسي. بعد الحضانة ، انقل شظايا الرحم إلى صفيحة زراعة الأنسجة 35 ملم تحتوي على ملليلتر واحد من محلول دولبيكو المخزن بالفوسفات أو DPBS. بعد ذلك ، افصل ظهارة الرحم عن أنبوب الرحم تحت مجهر التشريح عن طريق إمساك أحد طرفي جزء الرحم بالملقط وتشغيل طرف الماصة برفق طوليا عبر الجزء ، والضغط على الظهارة من الطرف الآخر من أنبوب الرحم.
ثم لاحظ الأوراق الظهارية المنفصلة عن جزء الرحم تحت مجهر التشريح. بعد ذلك ، انقل جميع الأوراق الظهارية برفق إلى نفس الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة ملليلتر. وبيليه الصفائح الظهارية المنفصلة عن طريق الطرد المركزي عند 375 × جم لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 ملليلتر من 2.5 ملليغرام لكل ملليلتر كولاجيناز بالإضافة إلى ملليغرام لكل ملليلتر من محلول الحمض النووي. ماصة صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات أو حتى يتم تحقيق تعليق خلية واحدة. بعد ذلك ، أضف 0.5 ملليلتر من DMEM F / 12 بالإضافة إلى 10٪ مصل بقري جنيني أو FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية وطرد الخلايا بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 375 × جم.
قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد DMEM / F12 بالإضافة إلى 10٪ FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية وأجهزة الطرد المركزي للخلايا. ضع مصفوفة الجل على الثلج حتى تصبح جاهزة. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية من خلايا الطرد المركزي وأعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 20 ضعف حجم مصفوفة الهلام دون إدخال الفقاعات.
اترك معلق خلية مصفوفة الهلام يستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبا. بمجرد أن يصبح تعليق خلية مصفوفة الهلام هلاما شبه صلب ، استخدم ماصة صغيرة P200 مع طرف عريض التجويف 200 ميكرولتر واستنشاق 25 ميكرولتر برفق من تعليق خلية مصفوفة الهلام. قم بتوزيع ثلاث قباب منفصلة سعة 25 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 12 بئرا واترك مصفوفة الهلام تعالج لمدة 15 دقيقة وحاضنة زراعة الأنسجة المرطبة 37 درجة مئوية.
بعد معالجة مصفوفة الهلام ، أضف 750 ميكرولترا من الوسط العضوي إلى كل بئر يحتوي على قبة مصفوفة هلام ، وحاضنة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة. أظهرت صور تباين الطور لعضويات بطانة الرحم للفأر أن فصل الخلايا الظهارية واللحمية أسفر عن عينات لا تزيد عن 10٪ إلى 15٪ تلوث من نوع الخلية المعاكس. تم تجميع الخلايا الظهارية بطانة الرحم في المواد العضوية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام.
تم تصور عضويات بطانة الرحم المضمنة في الفورمالين البارافين الثابت بواسطة بقع الهيماتوكسيلين والإيوزين ، والتي عرضت طبقة واحدة من الظهارة والمراكز المجوفة ، لومن المواد العضوية. أظهر التصوير المجهري الفلوري أن جميع الخلايا الموجودة في المواد العضوية كانت إيجابية Cytokeratin 8 وتحتوي على DAPI ، مما يشير إلى أن تثبيت وتضمين ومعالجة عضويات بطانة الرحم متوافق مع التلطيخ المناعي القائم على الأجسام المضادة. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي أن التحفيز باستخدام 10 نانومولار استراديول زاد من التعبير عن ليبوكالين 2 ، لاكتوفيرين ، ومستقبلات البروجسترون في الكائنات العضوية الظهارية ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام الكائنات العضوية الظهارية البطانية بنجاح لقياس تغيرات التعبير الجيني استجابة للاستراديول.
من المهم التأكد من الحصول على فصل واضح لظهارة بطانة الرحم أثناء خطوة التفكك الميكانيكي. يجب أن يكون المرء قادرا على مراقبة الظهارة الخارجة من أنبوب الرحم. تشمل الطرق الأخرى إنشاء المواد العضوية الظهارية عن طريق التغليف في مصفوفة هلامية.
إذا رغبت في ذلك ، يمكن هضم المقصورة اللحمية لإنشاء ثقافات انسجة ظهارية 3D. يمكن أن تساعد الطريقة في الإجابة على أسئلة حول الإشارات التي تتحكم في تجديد بطانة الرحم. يمكن أن يساعد في علاج الأمراض لدى النساء ، مثل التهاب بطانة الرحم وفقدان الحمل والسرطان.
