We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

ملاحظة: اتبع جميع الأنظمة المؤسسية بشأن الاستخدام الآمن والتخلص من المواد المشعة، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، واستخدام معدات الوقاية الشخصية، مثل القفازات، ونظارات السلامة، معطف المختبر، والدروع الاكريليك المناسبة. ملاحظة: يتكون عازلة معيار من 40 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي الغلوتامات البوتاسيوم، 5 ملي DTT و 0.1 ملي EDTA (ومسبقة الصنع هذا المخزن المؤقت عند تركيز 5X) و 0.3 ملم من كل dNTP. ويتم تنقية البروتينات تكرار T7 كما هو موضح 8 و 9 و 10. الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يحتوي على واحد T7 الموقع الاعتراف بريميز (5&#39;-GGGTC-3 &quot;، 5&#39;-GTGTC-3&quot;، 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الشركات توليف الحمض النووي (طول وssDNA قد تعتمد على انزيم الاختيار، لبريميز T7، وهو مخموس هو الحد الأدنى لطول قالب لتجميع التمهيدي كامل طول 11، كما خفي C ضروري، ولكن إذا التمهيدي هو للتمديد من قبل البلمرة، يجب أن يكون النيوكليوتيدات إضافية موجودة في نهاية 3 &#39;من القالب. وبدأت ردود الفعل من خلال إضافة تركيز النهائي من 10 ملي MgCl 2 وحضنت عند 25 درجة مئوية. أخذ العينات اليدوية تعمل بشكل جيد لفترة نقاط من 5 ثوان أو أكثر. إذا كانت هناك حاجة للوقت نقطة أقصر من ذلك، فمن المستحسن استخدام أداة تدفق إخماد السريع للحصول على بيانات دقيقة. 1. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل من جانب أخذ العينات اليدوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء التجربة، قسامة 2 ميكرولتر من العازلة صبغ الفورماميد (93٪ (ت / ت) الفورماميد، 50 ملي EDTA، 0.01٪ سيانول زايلين و 0.01٪ برموفينول الأزرق) إلى 8 1.5 أنابيب البولي بروبلين مل. بشكل عام، وعدد من الأنابيب هو مساو لعدد من الزمن نقاط تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط 20 ميكرولتر تتكون 1X العازلة، 0.1 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP، 0.25 زارة التجارة والصناعة / مل [α- 32 ف] CTP، 0.1 ميكرومتر SSDقالب NA، و 0.1 ميكرومتر GP4 (معبرا عنها تركيز مسدوس - 0.6 ميكرومتر مونومر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 2 ميكرولتر من الخليط باستخدام pipettor وتخلط مع 2 ميكرولتر عازلة صبغ الفورماميد في أنبوب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1 لأي ​​السيطرة على رد فعل (الساعة صفر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 0.1 M MgCl 2 إلى خليط التفاعل (لتركيز النهائي من 10 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب يدويا 2 عينات ميكرولتر من خليط التفاعل باستخدام pipettor في الصورة فترات 10 وتخلط مع صبغ الفورماميد predispensed في أنابيب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل aliquots من العينات على هلام تغيير طبيعة. يتم حل المنتجات التمهيدي tetraribonucleotide صغيرة توليفها من قبل بريميز T7 جيدا على 0.4 مم 25٪ الأكريلاميد: bisacrylamide (19: 1)، 3 M اليوريا، 1X TBE (100 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل بالكامل على chromatograورقة فيز والغطاء مع غلاف بلاستيكي. هلام الجافة باستخدام أكثر جفافا هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة تخفيف ما تبقى من خليط التفاعل وبقعة نفس حجم تحميلها على هلام على ورقة اللوني، أي بقعة 4 ميكرولتر من التخفيف إذا تم تحميل 4 ميكرولتر من العينة. ملاحظة: وهذا سيكون بمثابة منحنى القياسية لتحديد تركيز شكلت المنتجات أثناء عملية التفاعل. على سبيل المثال، التخفيفات خمسة أضعاف باستخدام العازلة TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) تعمل بشكل جيد، تغطي مجموعة من 1:25 إلى 1: 15625 (5 2 -5 6)، ولكن يجب أن التخفيفات تعديلها تبعا لمستوى النشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح هلام الجافة ومستوى باستخدام شاشة phosphorimager. قياس النشاط الإشعاعي في سلسلة تخفيف وبناء منحنى القياسية كما هو موضح 8 و 12 ملاحظة: إدراج T7 البلمرة DNA لخليط التفاعل يسمح احد لإكساءمنجم استخدام بادئات tetraribonucleotide هذا الانزيم. على النحو الأمثل، وتركيز البلمرة يجب أن تشبع لتبسيط تفسير البيانات. وهناك تركيز البلمرة من 0.4 ميكرومتر أو أعلى يعطي نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير بروتينات أخرى، مثل الحمض النووي ملزمة البروتينات واحدة الذين تقطعت بهم السبل، على أي توليف التمهيدي أو متخلفة حبلا بدء يمكن فحص بهذه الطريقة. </li></ol> 2. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل عن طريق صك السريع-إخماد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخاليط رد فعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X و 0.2 ميكرومتر GP4 مسدوس، 0.2 ميكرومتر قالب ssDNA، 0.6 ملي dNTPs، 0.2 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP (بما في ذلك 0.5 MCI / مل [α- 32 ف] CTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل-إخماد السريع أداة تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل موسيقى الرابID-إخماد أداة التدفق. بعد ظهور القائمة الرئيسية، اكتب 7 على لوحة المفاتيح أداة لنقل سائق المحقنة إلى موقف البيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة موقف فتح عازلة ل&quot;تحميل&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحاقن العازلة تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق 10 مل حقنة تحتوي عازلة لميناء محرك حقنة. تغيير حقنة موقف مقبض الباب ل&quot;تحميل&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق الحقن 10 مل، وملء عازلة أداة خزان A و B مع 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA وملء حقنة C مع حل إخماد (250 ملي EDTA، و 0.2٪ SDS). إزالة فقاعات الهواء عن طريق دفع الغطاسون في الداخل والخارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواقف تغيير مقبض الباب ل&quot;النار&quot;. النوع 2 لضبط الموقف من شريط سائق حقنة. الصحافة .. &quot;تعديل أسفل&quot; الزر لخفض حقنة حتى يأتي عازلة خارج الحلقة الخروج: (7 تنخفض باستمرار؛ الخطوة 8 الكبيرة إلى أسفل؛ الخطوة 9 صغيرة أسفل). اكتب &quot;ESC&quot; للعودة إلى القائمة الرئيسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توريمنظمة العمل ضد الجوع خط الخروج إلى فراغ. تغيير المقابض عينة إلى &quot;إخراج&quot;. وثيقة حقنة عازلة عن طريق وضع المقابض إلى الوضع الأفقي. بدوره على فراغ وتراجع الحلقات 2 دافق في H 2 O لمدة 10 ثانية، ثم تراجع في MeOH لمدة 10 ثانية. حلقات الجافة ويمتص الهواء ل~ 15 ثانية، أو حتى تجف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقبض الباب تغير موقف عينة إلى &quot;تحميل&quot;. وضع حل لفي 1 مل حقنة. المكونات حقنة في واحدة من الموانئ تحميل عينة. كرر حل B، ووضع في المقابل ميناء التحميل العينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع من الزمن نقاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في القائمة الرئيسية، اكتب 1 لتشغيل إخماد التدفق. أدخل وقت رد الفعل (الصورة) ثم اضغط على &quot;دخول&quot;. سيتم عرض عدد حلقة رد فعل للاستخدام. التبديل إلى حاجة حلقة رد فعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المقابض عينة إلى &quot;تحميل&quot;. يمزج رد فعل الحمل في الحلقات عينة حتى خارج المقصورة خلط المركزية. تحويل جميع المقابض إلى &quot;منطقة معلومات الطيرانE &quot;. تأكد من أن كافة المقابض هي في الموضع الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 1.5 مل على نهاية الخروج الحلقة. اضغط على &quot;جو GO&quot; لتشغيل رد الفعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. تحديث الحقن عازلة A و B حتى ضربوا السائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.2.6.2-2.2.6.3 لكل نقطة الوقت المطلوب. استثناء: لا تقم بتحميل محلول يحتوي على بداية كاشف (أي MgCl 2 في هذه الحالة) عندما تبريد سيطرة الصفر الوقت نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من جمع العينات، أدخل &quot;ESC&quot; للعودة إلى القائمة الرئيسية. اضغط على &quot;7&quot; للعودة سائق عازلة حقنة لموقف وطنه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداة تنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المحاقن خليط التفاعل. تحويل عينة مقبض تحميل ل&quot;تحميل&quot; موقف. تحت فراغ، ويغسل كل حلقة العينة مع 10 مل من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N، تليها 10 مل 0.3 NH 3 ص 4 و 10 مل MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المقابض حقنة ل&quot;تحميل&quot; موقف. اضغط لأسفل على كل SYR 3الغطاسون إنجي لاسترداد رد فعل وإخماد المخازن. غسل المحاقن مع 5 مل H 2 O مرتين على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الحقن مرة أخرى مع 5 مل H 2 O وتحويل المقابض إلى موقف &quot;النار&quot;. تغيير المواقف مقبض الباب وتشغيل فراغ لإزالة H 2 O. فلوش كما في الخطوة 2.2.4. إيقاف الصك. ويتم تحليل المنتجات كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،12: ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة T7 الحمض النووي بوليميريز والبروتينات النسخ الأخرى في خليط التفاعل لتحليل تأثيرها على التوليف التمهيدي أو التمديد. </li></ol></li></ol> 3. وحيد دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل ملاحظة: يتم إجراء أحادي دوران المقايسات التمهيدي تجميع / تمديد الخروج على نحو مماثل لردود فعل متعددة دوران، مع بعض الاختلافات الرئيسية: هذه المقايسات تتبع تحويل رديولبلد ATP إلى التمهيدي أو تمديد المنتجات، إلا أن تركيز ركائز والبروتينات هي consideraأعلى بلاي. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل تحقيق حل ميلي ثانية واحدة للسماح للتحليل رد فعل التوليف التمهيدي، لا بد من الاستفادة من آلة التدفق إخماد السريع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخاليط رد فعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X، 3 ميكرومتر مسدوس GP4، 6 ميكرومتر ssDNA القالب، 0.6 ملي dNTPs، 1 ملم CTP، و 2 نانومتر [γ- 32 ف] اعبي التنس المحترفين. إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سريع لإخماد عملية تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفذ تفاعلات كما هو موضح في الخطوة 2.2. إذا رغبت في ذلك، إضافة البلمرة T7 الحمض النووي أو بروتين ملزمة T7 احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي عند تركيز من 15 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، على التوالي. في هذه الحالة، والمنتجات تمديد تتراكم في نظام الوقت الذي يسمح لأخذ العينات اليدوية للتفاعل. </li></ol></li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب منحنيات تقدم المنتج لالأقل- غير الخطيةالساحات النماذج باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا قادرة على المربعات الصغرى نوبات و / أو التكامل العددي. فإن تفاصيل العملية تختلف مع البرنامج يعمل، ولكن أقل من أشكال معممة من المعادلات المستخدمة لتركيب البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد معدل تكوين المنتج من عدة تفاعلات التخليق دوران التمهيدي من المناسب للتقدم منحنيات لمعادلة خطية. إذا كان هناك انحناء كبير، استخدام طريقة معدل الأولي 13 و 14 عن طريق تركيب البيانات إلى وظيفة واحدة الأسي: ص = أ (ه - ك ر)، حيث ص هو تركيز المنتج، A هي السعة رد فعل، ك هو ثابت معدل لاحظ، ر حان الوقت، في ثوان. المنحدر من خط المماس في الوقت = 0 هو المعدل الأولي. ملاحظة: صالح قبل ثابتة تفاعلات التخليق التمهيدي الدولة لمعادلة خطية أو معادلة حالة ما قبل مستقرة انفجار ذ = A (ه - بو كRST ر) + معدل SS ر، حيث A هي السعة رد فعل، ك انفجار هو ثابت المعدل الملاحظ للانفجار حالة ما قبل ثابت، ومعدل ss غير أن حالة استقرار معدل SS = ك القط [أنزيم])، تي آن الأوان ، في ثوان. تناسب-دوران واحد تفاعلات التخليق التمهيدي منحنيات إلى وظيفة ذ = A واحد الأسي التقدم (ه - ك ر). في حالة GP4، تناسب البيانات عن طريق التكامل العددي 15، إلى نموذج مع ثلاث خطوات التكثيف NTP، حيث كل وسيطة هو في حالة توازن مع الانزيم، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا. </li></ol>

<ol>
	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخف?...

تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور 1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) 2. هذه الميزة تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة الآليات البيوكيميائية الحفظ تشارك في تكرار الحمض النووي. ويتم التركيز بشكل خاص على تشكيل الاشعال ريبونوكليوتيد التي كتبها T7 الحمض النووي بريميز، وهو حرجةخطوة لتر في الشروع في تركيب الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن ينظر أيضا في استخدام هذه البادئات من قبل البلمرة T7 الحمض النووي أو البروتينات النسخ الأخرى عن طريق إشراكها في خليط التفاعل. وT7 بريميز-هيليكاز، GP4، يحفز تشكيل الاشعال لتخليق الحمض النووي في تسلسل الحمض النووي محددة تسمى المواقع الاعتراف بريميز، أو استراتيجية الحد من الفقر، (5&#39;-GTC-3 &#39;). والسيتوزين في استراتيجية الحد من الفقر هو خفي، فمن الضروري للاعتراف الموقع، ولكن لا يتم نسخ ذلك في المنتج 3. الخطوة الأولى في التوليف التمهيدي من GP4 تتضمن تشكيل ثنائي النوكليوتيد pppAC، التي امتدت بعد ذلك لأرتب، وفي نهاية المطاف إلى الاشعال رباعي النوكليوتيد الوظيفية pppACCC، pppACCA، أو pppACAC تبعا لتسلسل في قالب 4. ويمكن بعد هذه الاشعال يتم استخدامها من قبل البلمرة T7 الحمض النووي للشروع في تركيب الحمض النووي، والذي هو أيضا عملية بمساعدة GP4 5، 6. في هذا الصدد، وبريميزنطاق استقرار tetraribonucleotides قصيرة للغاية مع القالب، ومنع التفكك، ويشارك البلمرة DNA بطريقة تؤدي إلى تأمين التمهيدي / القالب إلى موقع نشط 7 البلمرة. وتتكرر هذه الخطوات (RNA التوليف التمهيدي، عمليتي التحول التمهيدي لالبلمرة، والإرشاد) في دورات متعددة لتكرار حبلا متخلفة ويجب أن ينسق مع تكرار حبلا الرائدة. المقايسات الموصوفة هنا هي حساسة للغاية، ويمكن أداؤها في إطار زمني المعتدل. ومع ذلك، فهي نسبيا منخفضة الإنتاجية وعناية كبيرة يجب أن تمارس في الاستخدام والتخلص من المواد المشعة. اعتمادا على السرعة التي حصيلة التفاعل، يمكن للمرء أن يستخدم أداة لإخماد السريع لتحقيق العينات في فترات زمنية قابلة للتحليل مغزى من الدورات وقت رد الفعل إما في ثابت أو دولة ما قبل مستقرة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا المقايسات وصفها هنا لتقديم evidenc(ه) من أهمية إطلاق التمهيدي من المجال بريميز من GP4 في بدء شظايا أوكازاكي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا دليلا على وجود دور تنظيمي لالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل T7 البروتين، gp2.5 ملزمة، في تعزيز تشكيل التمهيدي كفاءة واستخدام 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;"> 
			Tris pre-set crystals 
			pH 7.5</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">T4128&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:83px;">&#160;SIGMA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">G1501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">5958-04</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:83px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">F780-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:83px;">MP Biomedicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">811030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">4931-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#945;-32P] CTP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU508H</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#947;-32P] ATP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502A</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77100</td>
			<td>four dNTPs part of set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM ATP and CTP</td>
			<td style="width:83px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">RN02825</td>
			<td>part of NTP set</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ssDNA constructs</td>
			<td style="width:83px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>custom sequences&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">methanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">3017-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">B8026&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cylene xyanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">X4126&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A9099</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M7279&#160;</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:83px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Quench-Flow Instrument&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">RQF-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kintek Explorer</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kaleidagraph&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

وقد تم الحصول على النتائج الموضحة في الشكل 1A كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول، أي عن طريق أخذ عينات رد فعل التوليف التمهيدي يحفزه GP4 في ظل ظروف متعددة دوران يدويا. هنا، مجموعة واسعة من المنتجات بعد الكهربائي للهلام يمكن مل?...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em&gt; في المختبر</em&gt; من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K Views.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Video: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

التنميط الحمض النووي توقيت النسخ المتماثل باستخدام الزرد كنظام نموذجي في فيفو

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

الحمض النووي عالي الكثافة وmicroarrays RNA - التوليف الضوئي، والتهجين وإعداد مكتبات الأحماض النووية الكبيرة

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

استخدام الأنسجة المجمدة في فحص المذنب لتقييم تلف الحمض النووي

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video