الفسفرة الثلاثية هي تعديل 5' في كل مكان للحمض النووي الريبي في علم الأحياء ويستخدم بشكل متزايد في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية. يتيح البروتوكول الموضح هنا 5'triphosphorylation من أي oligonucleotide المحضرة بواسطة التوليف الآلي القياسي. يعمل الفسفرة الثلاثية الكيميائية على أوليغونوكليوتيدات تحتوي على الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو الحمض النووي غير الطبيعي.
هنا ، يتم تصنيع L-RNA الأيسر ثلاثي الفوسفوريلات ، وهو enantiomer من D-RNA البيولوجي ، وتنقيته واستخدامه في تفاعل الريبوسوم. يتم إجراء الفسفرة الثلاثية بعد تخليق أوليغونوكليوتيد الآلي وقبل إزالة الحماية. لا يتم عرض هذه الخطوات هنا ، ولكن يجب أن يكون الباحثون على دراية بالطرق القياسية لكليهما.
للبدء ، تأكد من أن مساحة العمل الخاصة بالفسفرة تحتوي على مشعب غاز مع خطين على الأقل والفقاعة متصلة بمصدر أرجون جاف بضغط قابل للتعديل حيث يجب إجراء تفاعل الفسفرة الثلاثية تحت الأرجون. ثم قم بإرفاق محاقن بلاستيكية واحدة بالملليلتر بالخطوط لتسهيل الاتصال بجهاز التفاعل. بعد ذلك ، قم بجمع المعدات بما في ذلك المحاقن البلاستيكية بالملليلتر الواحد ، وسدادة البولي بروبيلين ثلاثية الاتجاهات ، والإبر غير المثبتة ، وأنابيب البولي بروبيلين 1.5 ملليلتر ، وملعقة معدنية صغيرة ، وتخزينها في حاوية مغلقة أو مجفف مع مجفف في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد على الأقل قبل الاستخدام.
تحت ضغط الأرجون ، اسحب 30 ملليلتر من الديوكسان اللامائي 1 ، 4 من زجاجة مغلقة. ينقل إلى زجاجة زجاجية مجففة 30 ملليلتر ويضاف مصيدة تجفيف. ختم مع الحاجز المطاطي وتخزينها في مجفف مع المجفف.
وبالمثل ، قم بإعداد 30 ملليلتر من N و N-dimethylformamide و acetonitrile وخليط من ثلاثة أجزاء من الديوكسان وجزء واحد من البيريدين حسب الحجم. تحضير محلول TBAP عن طريق خلط بيروفوسفات ثلاثي الألومونيوم الصلب مع ثنائي ميثيل فورماميد وتريبوتيلامين في زجاجة زجاجية سعة 30 ملليلتر كما هو موضح في المخطوطة. أضف ثلاثة مصائد رسم.
أغلق الزجاجة بحاجز مطاطي تحت الأرجون وفقاعة مع الأرجون لمدة 30 دقيقة. بعد تحضير أوليغونوكليوتيد مع هيدروكسيل حر 5' على عمود تخليقي باستخدام مركب آلي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي. تحضير الغرفة عن طريق إزالة المكبس من حقنة جافة ملليلتر واحد.
اقطع الجزء العلوي من المحقنة باستخدام مقص أو شفرة حلاقة وقم بتوصيل المحقنة بعمود التوليف. في الجزء العلوي من المحقنة ، قم بتوصيل الموقوف ثلاثي الاتجاهات وقم بتوصيل المدخل الجانبي لجهاز التوقف بمصدر الأرجون الجاف باستخدام الفقاعة بحيث يعمل المدخل العلوي لجهاز التوقف كمنفذ حقن الكاشف. قم بتأمين هذا المشغل على حامل مع المشابك وختم جميع مفاصل المنبع بفيلم ختم الشمع.
ثم اضبط الموقوف بحيث يتم إغلاق منفذ الحقن ويكون الجهاز مفتوحا لمصدر الأرجون. أغلق الفقاعة واسمح للأرجون عند الضغط المنخفض بالتدفق عبر غرفة العمل لمدة خمس دقائق. بعد إعادة فتح الفقاعة ، قم بإرفاق حقنة بالجزء السفلي من عمود التوليف ، والتي ستكون حقنة النفايات.
بعد ذلك ، اسحب الأرجون عبر العمود بشكل متكرر باستخدام حقنة النفايات ثم أعد توصيل المحقنة باستخدام المكبس الذي تم دفعه بالكامل. لإضافة كاشف أو مذيب ، قم بإرفاق إبرة بمصدر الأرجون الجاف وأدخلها في حاجز الكاشف أو زجاجة المذيب ، مع الحرص على عدم غمر الإبرة في محتويات الزجاجة. ثم قم بتجميع حقنة جافة بإبرة وأدخلها في حاجز الكاشف أو زجاجة المذيب دون غمرها في محتويات الزجاجة.
بعد ذلك ، املأ المحقنة بالأرجون ، واسحب الإبرة من الحاجز وطرد الأرجون. بعد ملء المحقنة بالأرجون وطردها مرة أخرى ، املأ المحقنة بالحجم المطلوب من المذيب أو الكاشف تحت ضغط الأرجون. اضبط الإيقاف بحيث يتم إغلاق مصدر الأرجون وفتح منفذ الحقن.
بمجرد ضبط التوقف على الجهاز بسرعة ، قم بإزالة المحقنة والإبرة المملوءة من الزجاجة المصدر ، وامسح أي مذيب عالق على جانب أو طرف الإبرة ثم أدخل الإبرة في منفذ الحقن. بعد طرد كاشف إلى الغرفة المضادة للمشغلين ، قم بإزالة الإبرة وأغلق منفذ الحقن أثناء إعادة فتح الجهاز إلى مصدر الأرجون. اسحب السائل بلطف من الغرفة المضادة على طول الطريق من خلال عمود التوليف باستخدام حقنة النفايات بحيث يتم الآن الاحتفاظ بكل السائل في حقنة النفايات.
الآن ادفع المحلول ببطء مرة أخرى إلى عمود التوليف ، مما يضمن عدم وجود فقاعات غاز في العمود. للخلط أو التحريك ، اسحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل فوق العمود باستخدام حقنة النفايات. لإزالة كاشف أو مذيب من العمود ، اسحب المحلول ببطء إلى حقنة النفايات.
بعد مرور الجزء الأكبر من المحلول إلى حقنة النفايات ، اسحب الأرجون لطرد المذيب المتبقي من العمود. بعد ذلك ، قم بإزالة فيلم ختم الشمع حول مفصل حقنة النفايات. ثم قم بإزالة المحقنة وتخلص من محلول النفايات.
بعد ذلك ، استبدل حقنة النفايات بحقنة جافة جديدة وأعد إغلاق المفصل. بعد تجميع جهاز الفسفرة الثلاثية ، ابدأ تفاعل الفسفرة الثلاثية بإضافة 200 ميكرولتر من ثنائي أوكسين البيريدين إلى الغرفة المضادة كما هو موضح سابقا. ولكن لا تسحب العينة إلى عمود التوليف بعد.
بعد إذابة SalPCl في الديوكسان كما هو موضح في المخطوطة ، أضفه إلى الغرفة المضادة وحمله على عمود التوليف باستخدام حقنة جافة. ثم اتركه يتفاعل لمدة 15 دقيقة ثم قم بإزالة محلول SalPCl والتخلص منه باستخدام حقنة نفايات كما هو موضح سابقا. مباشرة بعد إزالة محلول SalPCl ، أضف 250 ميكرولتر من محلول TBAP إلى الحجرة المضادة وتحميلها على عمود التوليف.
دعه يتفاعل لمدة 20 دقيقة مع الإثارة وتجاهل كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، اغسل العمود ب 0.5 ملليلتر من N ، N-dimethylformamide ، ثم 0.5 ملليلتر من الأسيتونيتريل ، وإزالة المذيب بعد كل إضافة. بعد إضافة محلول المؤكسد وإزالته وغسل العمود بالأسيتونيتريل مرة أخرى باستخدام نفس الإجراء الموضح ، قم بتفكيك الجهاز وغسل العمود بخمسة ملليلترات من الأسيتونيتريل.
بعد ذلك ، جفف العمود. افصل أوليغونوكليوتيد ثلاثي الفوسفوريلات عن الدعم الصلب وقم بإزالة الحماية باستخدام البروتوكولات القياسية كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، قم بإذابة oligonucleotide المجفف غير المحمي في مخزن مؤقت لتحميل اليوريا ، وتسخينه إلى 80 درجة مئوية ، ثم تحميله على هلام بولي أكريلاميد وتشغيله لمدة ساعة إلى ساعتين عند 25 إلى 35 واط.
في نهاية الرحلان الكهربائي للهلام ، بعد إزالة لوحة الجل ، قم بتفكيكها ولف الجل في فيلم بولي فينيل كلوريد. بعد ذلك ، حدد نطاقات المنتج عن طريق التظليل الخلفي بضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر واستقصاء نطاق المنتج الرئيسي باستخدام شفرة حلاقة. سحق الجل المقتطع عن طريق بثقه من خلال حقنة بلاستيكية أو ميكانيكيا.
بالنسبة لقلة النوكليوتيدات الأقصر من 15 نيوكليوتيد، قم بالتخلص في ثلاثة أضعاف حجم هلام الماء الحر من النوكليز لمدة 12 ساعة على الأقل مع الإثارة أو الاهتزاز. ثم قم بإزالة قطع الجل الصلبة عن طريق تمرير المحلول عبر حقنة مزودة بمرشح 0.2 ميكرومتر والتركيز عن طريق التجفيد. بعد التركيز ، قم بإزالة الأملاح المتبقية والتحية باستخدام عمود استبعاد الحجم القابل للتصرف وركز عن طريق التجفيد كما هو موضح سابقا.
بعد تحضير 10 ميكرولترات من محلول الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على ريبوزيم البوليميراز وقالب L-RNA التمهيدي وثلاثي نيوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتجديده عن طريق تسخينه إلى 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وتبريده إلى 23 درجة مئوية عند 0.2 درجة مئوية في الثانية في دورة حرارية PCR. بعد احتضان محلول الحمض النووي الريبي عند 17 درجة مئوية، أوقف التفاعل بإضافة 10 ميكرولترات من ضعف تركيز مخزن البداية المخزن المؤقت مع استمرار التفاعل، وخذ 10 ميكرولترات أليكوتس وقم بتبريده بخمسة ميكرولترات من 0.5 مول EDTA عند الرقم الهيدروجيني 8 ومعالجة كل عينة لعزل الحمض النووي الريبي كما هو موضح في المخطوطة. قم بإذابة الحمض النووي الريبي المترسب في 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لتحميل الجل الرسمي وإعداد التمهيدي غير المتفاعل المسمى بالنهاية كما هو موضح في النص.
بمجرد تحضير العينات ، قم بالحرارة إلى 80 درجة مئوية. قم بتحميل خمسة ميكرولترات من العينة في كل بئر وقم بتشغيل الجل عند 40 واط لمدة 40 دقيقة تقريبا. بعد إزالة صفيحة الجل من الحامل ، قم بالمسح الضوئي باستخدام ماسح ضوئي هلام فلورسنت أو فوسفورسنت لتصور منتجات تمديد L-RNA المتقاطعة.
بعد تنقية الجل ، يكشف التظليل الخلفي للأشعة فوق البنفسجية عن وجود 5'triphosphate كمنتج رئيسي واحد كما هو موضح لأدوات تشذيب الحمض النووي AAA و CCC و GAA L-RNA trimer. غالبا ما يكون المنتج الجانبي 5'hydroxyl مرئيا كنطاق هجرة أبطأ ، والذي تم عزله وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي لمشتري الحمض النووي. ترتبط النطاقات الإضافية أثناء تنقية الجل بمنتجات 5'diphosphate و monophosphate و H-phosphonate الجانبية في قياس الطيف الكتلي لمنتجات التفاعل غير النقية.
تظهر منتجات 5'triphosphate ذروة كتلة أولية تتوافق مع 5'triphosphate جنبا إلى جنب مع كتل 5'di و monophosphate. تم استخدام ثلاثي النوكليوتيدات L-RNA ذات الصلة كيميائيا مع التمهيدي L-RNA وقالب L-RNA في تفاعل بلمرة الحمض النووي الريبي الذي تم تحليله بواسطة PAGE وتم تصويره باستخدام ماسح ضوئي هلام فلورسنت. أظهر المنتج الموسع الذي تميزت به الدوائر السوداء تخليق نسخة L-RNA من ريبوزيم رأس المطرقة المشفر بواسطة القالب.
التعرض للماء أثناء الفسفرة الثلاثية سيقلل من الغلة. اتبع خطوات تحضير الكواشف الجافة وتجميع جهاز التفاعل بعناية. حرك السوائل عبر الجهاز ببطء لتجنب كسر الأختام.
الفسفرة الثلاثية الكيميائية ضرورية لإعداد ثلاثي فوسفات الأوليغونوكليوتيد غير البيولوجي، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الأعسر. وقد مكن ذلك من تخليق الريبوزيم عبر الشيرال لإصدارات الصور المرآة لجزيئات الحمض النووي الريبي الموجودة في علم الأحياء.
