We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

הערה: מלאו אחר כל התקנות המוסדיות לגבי השימוש הבטוח והסילוק של חומר רדיואקטיבי, לרבות אך לא רק, שימוש בציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ומגינים אקריליק מתאימים. הערה: המאגר סטנדרטי מורכב מ -40 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 גלוטמט אשלגן מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ DTT, 0.1 mM EDTA (חיץ זה שהוכן מראש בריכוז 5x) ו -0.3 מ&quot;מ של כל dNTP. חלבונים שכפול T7 הם מטוהרים כמתואר 8, 9, 10. דנ&quot;א חד-גדילי המכיל אתר הכרה primase יחיד T7 (5&#39;-GGGTC-3 &quot;, 5&#39;-GTGTC-3&quot;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) ניתן לרכוש ממגוון רחב של חברות סינתזה DNA (אורך של ssDNA יכול להיות תלוי האנזים של בחירה עבור primase T7, pentamer הוא אורך תבנית המינימום לסנתז פריימר באורך מלא 11, כמו C הנסתר חיוני, אולם אם היה פריימר הוא תוארך פולימראז, נוקלאוטידים נוסף חייב להיות נוכח בסוף &#39;3 של התבנית. תגובות יזומים על ידי תוספת של ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ MgCl 2 וטופחו על 25 מעלות צלזיוס. דגימה ידנית עובדת היטב עבור נקודות זמן של 5 שניות או יותר. אם בזמן נקודות קצרות מזו נדרשות, מומלץ להשתמש באמצעי זרימה מהיר-להרוות להשיג נתונים מדויקים. 1. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור ידי דגימה ידנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניסוי, aliquot 2 μL של חיץ לצבוע לפוראמיד (93% (V / V לפוראמיד), 50 מ&quot;מ EDTA, 0.01% cyanol קסילן ו 0.01% bromophenol כחול) לתוך 8 1.5 צינורות פוליפרופילן מ&quot;ל. באופן כללי, מספר צינורות שווה למספר נקודות זמן המנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת 20 μL המורכב חיץ 1x, 0.1 מ&quot;מ ATP ו CTP, 0.25 MCI / מ&quot;ל [α- 32 P] CTP, 0.1 מיקרומטר SSDתבנית NA, ו -0.1 מיקרומטר gp4 (מבוטא ריכוז hexamer - 0.6 מיקרומטר מונומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 2 μL של התערובת באמצעות pipettor ומערבבים עם 2 μL חיץ לצבוע לפוראמיד צינור 1.5 מ&quot;ל מוכן בשלב 1.1 עבור כל שליטה התגובה (זמן אפס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של 0.1 M MgCl 2 לתערובת התגובה (לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני למשוך 2 דגימות μL של תערובות התגובה באמצעות pipettor ב 10 מרווחי ים ומערבבים עם צבע לפוראמיד predispensed ב 1.5 צינורות מ&quot;ל מוכן בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מחממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך גוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען aliquots של דגימות על ג&#39;ל denaturing. המוצרים פריימר tetraribonucleotide קטן מסונתז על ידי primase T7 נפתרות היטב על acrylamide 0.4 מ&quot;מ עובי 25%: bisacrylamide (19: 1), 3 M אוריאה, TBE 1x (100 מ&quot;מ טריס-borate, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ג&#39;ל כולו על chromatograPHY נייר ומכסים בניילון נצמד. ג&#39;ל ניקוי באמצעות היבשים ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סדרת דילול של שארית תערובת התגובה ספוט באותו הנפח טעון על הג&#39;ל על גבי נייר כרומטוגרפיה, כלומר, במקום 4 μL של הדילול אם 4 μL של מדגם הועמס. הערה: זה ישמש את עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז של מוצרים נוצרו במהלך התגובה. לדוגמה, פי חמישה דילולים באמצעות TE חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) עובד טוב, פורש מגוון של 1:25 עד 1: 15.625 (5 2 -5 6), אבל דילולים צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הפעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף ג&#39;ל יבש רגיל באמצעות מסך phosphorimager. לכמת את הרדיואקטיביות בסדרת הדילול לבנות עקום סטנדרט כמתואר 8, 12 הערה: הכללה של DNA פולימראז T7 לתערובת התגובה מאפשרת לאדם EXAשלי השימוש של פריימרים tetraribonucleotide ע&quot;י אנזים זה. באופן אופטימלי, ריכוז פולימראז יש להרוות כדי לפשט את הפרשנות של הנתונים. ריכוז פולימראז של 0.4 מיקרומטר ומעלה נותן תוצאות טובות. בנוסף, ההשפעה של חלבונים אחרים, כגון חלבונים מחייב חד גדילי דנ&quot;א, משני סינתזה פריימר או חניכה גדיל מפגרת ניתן לבדוק בדרך זו. </li></ol> 2. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור באמצעות מכשיר Rapid-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 0.2 מיקרומטר hexamer gp4, 0.2 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ&quot;מ dNTPs, 0.2 מ&quot;מ ATP ו CTP (כולל 0.5 MCI / מ&quot;ל [α- 32 P] CTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ&quot;מ MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע של מכשיר זרימה מהירה-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ראפמכשיר זרימה id-להרוות; לאחר הופעת התפריט הראשי, הקלד 7 במקלדת המכשיר כדי להזיז את נהג המזרק לעמדת המוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מזרק להרחיב בעמדה &quot;עומס&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקי חיץ טוען <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף חוצץ המכיל מזרק 10 מ&quot;ל לנמל מזרק הכונן. שינוי מיקום ידית מזרק כדי &quot;לטעון&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 10 מזרקים מ&quot;ל, למלא מאגר חיץ מכשיר ו- B עם 10 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 1 mM EDTA ולמלא מזרק C עם פתרון להרוות (250 מ&quot;מ EDTA, ו -0.2% SDS). הסר בועות אוויר על ידי דחיפת בוכנות פנימה והחוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית שינוי עמדות &quot;אש&quot;. סוג 2 כדי לשנות את מיקום של בר נהג מזרק. לחץ &quot;להתאים DOWN&quot; על מנת להקטין את המזרק עד חיץ יוצא לולאת היציאה: (7-יורדים ברציפות; צעד גדול 8 למטה; 9-קטן צעד למטה). הקלד &quot;ESC&quot; כדי לחזור לתפריט הראשי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עו&quot;דאח היציאה בתור ואקום. שנת ידיות מדגם &quot;סומק&quot;. מזרק חיץ לסגור על ידי קביעת הידיות למצב האופקי. הפעל ואקום לטבול 2 לולאות הסומק H 2 O עבור 10 s, ואז לטבול MeOH במשך 10 שניות. ניקוי לולאות ידי מציצת אוויר עבור ~ 15 שניות, או עד יבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טוענים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום ידית מדגם שנה &quot;עומס&quot;. מניחים פתרון לתוך מזרק 1 מ&quot;ל. חבר מזרק לתוך לאחת מיציאות עומס המדגם. חזור על הפעולה עבור פתרון B, ומניחים בנמל עומס מדגם ההפך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של נקודות זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט הראשי, מסוג 1 לריצה להרוות-זרימה. זן זמן תגובה (ים) ולחץ &quot;ENTER&quot;. מספר לולאת התגובה להשתמש יוצג. Switch to לולאת תגובה הנדרשת. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מדגם ידיות &quot;לטעון&quot;. תגובה טען מתערבבת לולאות מדגם עד ממש מחוץ לתא הערבוב המרכזי. הפעל את כל הכפתורים כדי &quot;FIRE &quot;. מוודא שכל הכפתורים נמצאים בעמדה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 1.5 מיליליטר מתחנת רכבת תחתי לתוך סוף לולאת יציאה. לחץ &quot;GO&quot; כדי להפעיל את התגובה. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. מזרקי חיץ רענן A ו- B עד שהם להכות את הנהג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבי 2.2.6.2-2.2.6.3 עבור כל נקודת זמן רצויה. יוצא מן הכלל: אל תטען תמיסה המכילה מגיב ההתחלה (כלומר, MgCl 2 במקרה זה) כאשר מרווה השליטה אפס זמן נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום איסוף דגימות, הזן &quot;ESC&quot; כדי לחזור לתפריט הראשי. לחץ &quot;7&quot; כדי לחזור נהג מזרק חיץ לעמדת המוצא שלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר לניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור מזרקי תערובת תגובה. הפעל ידית טעינה מדגם למצב &quot;עומס&quot;. תחת ואקום, לשטוף כל לולאה המדגם עם 10 מ&quot;ל 0.2 N NaOH, ואחריו 10 מ&quot;ל 0.3 NH 3 PO 4 ו -10 מ&quot;ל MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ידיות מזרק למצב &quot;עומס&quot;. לחץ כלפי מטה על כל 3 SYRבוכנות אינגה לאחזר מאגרי תגובה להרוות. לשטוף מזרקים עם 5 מ&quot;ל H 2 O לפחות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרקים שוב עם 5 מ&quot;ל H 2 O ולהפוך ידיות למצב &quot;אש&quot;. שינוי עמדות כפתור ולהדליק ואקום כדי להסיר H 2 O. Flush כמו בשלב 2.2.4. כבה המכשיר. הערה: מוצרים מנותחים כמתואר בשלבים 1.7-1.12. בנוסף, DNA פולימרז T7 וחלבונים שכפול אחרים ניתן להוסיף לתערובת התגובה לנתח את השפעתם על סינתזה פריימר או הרחבה. </li></ol></li></ol> 3. תגובת סינתזת פריימר חד מחזור הערה: סינתזת פריימר חד מחזור / מבחני הרחבה מתבצעים באופן דומה לתגובות מרובה-מחזור, עם הבדלים גדולים כמה: מבחנים אלה בצעו את ההמרה של ה- ATP רדיואקטיבי לתוך מוצרים פריימר או רחבה, אולם ריכוז המצעים וחלבונים הם consideraבליי גבוה. בנוסף, על מנת להשיג ברזולוציה אלפית השנייה כדי לאפשר ניתוח של סינתזת התגובה פריימר, אחד חייב לנצל מכונת זרימה מהירה-להרוות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות תגובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 3 מיקרומטר hexamer gp4, 6 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ&quot;מ dNTPs, 1 מ&quot;מ CTP, ו -2 ננומטר [γ- 32 P] ATP. הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ&quot;מ MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע זרימה מהיר-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות כמתוארות בשלב 2.2. אם תרצה בכך, להוסיף פולימראז T7 DNA או T7 חד גדילי ה- DNA חלבון מחייב בריכוז של 15 מיקרומטר ו 20 מיקרומטר, בהתאמה. במקרה זה, את המוצרים הרחבים להצטבר משטר זמן המאפשר דגימה ידנית של התגובה. </li></ol></li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומות התקדמות מוצר לנכונות שאינו ליניארי least-מודלי ריבועים באמצעות תוכנה זמינה מסחרי מסוגלים ריבועים לפחות מתאימים ו / או אינטגרציה נומרית. הפרטים של המבצע ישתנו עם התוכנה מועסקת, אך להלן צורות כלליות של משוואות המשמשות התאמת הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את קצב היווצרות התוצר של תגובות סינתזת פריימר מספר המחזור ידי ההתאמה להתקדם עקומות למשוואה ליניארית. אם יש עיקום ניכר, השתמש בשיטת שיעורו הראשונית 13, 14 על ידי התאמת הנתונים לפונקציה יחידה מעריכים: y = A (e - t k), כאשר y הוא ריכוז המוצר, A היא משרעת התגובה, k הוא הקבוע לקצב המהיר שנמדד בטלסקופים, t הוא הזמן, בשניות. השיפוע של המשיק בשלב = 0 הוא השיעור הראשוני. הערה: Fit טרום יציב תגובות סינתזת פריימר מדינת משוואה ליניארית או למשוואה טרום יציבה פרץ מדינת Y = A (e - k buהראשון t) + שיעור ss t, כאשר A הוא משרעת התגובה, פרץ k הוא קבוע קצב ציין עבור פרץ במצב טרום יציב, ss השיעור הוא ss שיעור היציב = חתול k [אנזים]), t הוא הזמן , בשניות. התאם תגובות סינתזת פריימר חד מחזור להתקדם עקומות על יחיד מעריכי פונקציה y = A (ה - k t). במקרה של gp4, להתאים את הנתונים על ידי אינטגרציה נומרית 15, למודל עם שלושה שלבי עיבוי NTP, כאשר כל ביניים נמצאים בשיווי משקל עם האנזים, באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי. </li></ol>

<ol>
	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ&quot;מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. ל...

השכפול של הדנ&quot;א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית 1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג&#39;ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ&quot;א מחייב, GP2. 5) 2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור את המנגנונים הביוכימיים המשומרים מעורבים שכפול הדנ&quot;א. דגש מיוחד מושם על היווצרות של פריימרים ribonucleotide ידי DNA T7 primase, critical צעד בייזום של סינתזה של DNA. בנוסף, אפשר גם לבחון את השימוש של פריימרים אלה על ידי פולימראז T7 DNA או חלבונים שכפולים אחרים על ידי כולל אותם לתערובת התגובה. T7 primase-helicase, gp4, מזרז היווצרות של פריימרים עבור סינתזה של DNA על רצפי DNA ספציפי הנקרא אתרי הכרה primase, או PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). ציטוזין ב PRS הוא נסתר, זה הכרחי להכרה של האתר, אבל זה לא מועתק לתוך המוצר 3. הצעד הראשון סינתזה פריימר ידי gp4 כרוך היווצרות של dinucleotide pppAC, אשר ניתנת להארכה אז אל trimer, ובסופו של דבר פריימרים tetranucleotide פונקציונלי pppACCC, pppACCA, או pppACAC תלוי רצף בתבנית 4. פריימרים אלו לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי פולימראז T7 DNA ליזום סינתזת ה- DNA, שהוא גם תהליך 5 בסיוע gp4, 6. בהקשר זה, primaseתחום מייצב את tetraribonucleotides הקצר מאוד עם התבנית, מניעת דיסוציאציה שלהם, עוסק DNA פולימרז באופן הדרך להבטיח פריימר / תבנית לתוך פולימראז האתר פעיל 7. צעדים אלה (סינתזת פריימר RNA, handoff פריימר כדי פולימראז, ורחבה) חוזרים מחזורים רבים לשכפל הגדיל המפגר חייבים להיות מתואם עם השכפול של הגדיל המוביל. המבחנים המתוארים כאן הם רגישים מאוד והוא יכול להתבצע בתוך מסגרת זמן מתונה. עם זאת, הם נמוכים יחסית תפוקה ו בזהירות רבה יש מבוצעת השימוש וסילוק חומרים רדיואקטיביים. תלוי במהירות שבה היא מתרחשת, אפשר להעסיק מכשיר מהיר-להרוות להשיג דגימות בסקלות הזמן נוחות עבור ניתוח משמעותי של קורסי זמן תגובה כלשהי באחד משני יציבה או במצב טרום היציב. לאחרונה, השתמשנו מבחנים המתוארים כאן כדי לספק evidencדואר לחשיבות שחרור פריימר מהתחום primase של gp4 בייזום של שברי Okazaki. בנוסף, מצאנו עדויות של תפקיד רגולטורי עבור דנ&quot;א חד-גדילי T7 חלבון מחייב, gp2.5, בקידום היווצרות פריימר יעיל וניצול 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;"> 
			Tris pre-set crystals 
			pH 7.5</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">T4128&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:83px;">&#160;SIGMA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">G1501&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">5958-04</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,4-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:83px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">F780-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:83px;">MP Biomedicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">811030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">4931-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#945;-32P] CTP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU508H</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">[&#947;-32P] ATP</td>
			<td style="width:83px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502A</td>
			<td>radioactive, take protective measures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Affymetrix</td>
			<td align="right" style="width:119px;">77100</td>
			<td>four dNTPs part of set</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 mM ATP and CTP</td>
			<td style="width:83px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">RN02825</td>
			<td>part of NTP set</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">ssDNA constructs</td>
			<td style="width:83px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>custom sequences&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">methanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">3017-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">17899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bromophenol blue</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">B8026&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cylene xyanol&#160;</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">X4126&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A9099</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:83px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">M7279&#160;</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:83px;">Boston Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">P-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:83px;">Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rapid Quench-Flow Instrument&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">RQF-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kintek Explorer</td>
			<td style="width:83px;">Kintek Corp.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kaleidagraph&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

התוצאות שמוצגות באיור 1A התקבלו כמתואר בשלב 1 של הפרוטוקול, כלומר, באמצעות דגימה ידנית תגובת סינתזת פריימר מזורזת על ידי gp4 בתנאים מרובה מחזור. הנה, מגוון של מוצרים לאחר ג&#39;ל אלקטרופורזה ניתן לצפות באמצעות CTP שכותרתו עם 32 ...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K Views.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Video: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing biosynthetic pathways. In this manuscript, the use of a highly effective system for the construction of multigene synthetic operons under the control of an inducible T7 RNA polymerase is described. This system allows many genes to be expressed simultaneously from one plasmid. Here, a set of four related vectors, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K, and pMGX-hisK, with either the ampicillin or kanamycin resistance selectable marker (A and K) and either possessing or lacking an N-terminal hexahistidine tag (his) are disclosed. Detailed protocols for the construction of synthetic operons using this vector system are provided along with the corresponding data, showing that a pMGX-based system containing five genes can be readily constructed and used to produce all five encoded proteins in Escherichia coli. This system and protocol enables researchers to routinely express complex multi-component modules and pathways in E. coli.

This study describes methods for the T7-mediated co-expression of multiple genes from a single plasmid in Escherichia coli using the pMGX plasmid system.

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video